昆虫杆状病毒egt基因研究进展

杆状病毒是一类大分子的双链环状DNA病毒,其编码的蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因(egt)在感染昆虫后表达产生EGT酶。EGT酶的催化使宿主体内的蜕皮激素失活,阻止幼虫蜕皮,从而利于病毒自身的繁殖。已有研究发现,敲除egt基因的杆状病毒感染的昆虫,死亡时间缩短,向上攀爬行为减弱。最近的研究还表明转egt基因的家蚕蚕蛹发育迟缓。从分子水平对EGT酶作用机制及其与宿主蛋白互作关系进行探索,将加深我们对杆状病毒调控宿主生长发育和行为变化策略的认识,有利于农业生产应用(特别是蚕丝业,如鲜茧缫丝),且为新型高效生物杀虫剂的研发提供新思路。     

昆虫杆状病毒egt基因研究进展

昆虫杆状病毒基因组中存在一个编码蜕皮甾醇尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(ecdysteroid UDP-glucosyltransferase,EGT)的基因egt.     

杆状病毒egt基因对昆虫激素表达的调控影响

从昆虫激素对宿主相关基因表达的调控机理和杆状病毒egt基因的结构功能和表达方面 ,讨论了昆虫激素和杆状病毒间相互关系的研究进展 ,表明杆状病毒的感染改变了宿主固有的激素平衡 ,从而影响宿主的发育进程。     

细胞凋亡的调控基因研究进展

1　细胞凋亡的概念在多细胞生物中 ,细胞的死亡有两种不同的形式。一种是坏死性或意外性死亡 ( necrocis or acci-dental cell death) ,它是由于某些外界的因素 ,比如局部贫血、高热以及物理、化学损伤和生物的侵袭等 ,造成细胞急速死亡 ,即病理性细胞死亡 ,形态学上表现为细胞坏死。另一类为生理性细胞死亡 ,这是1972年 Kerr等在正常生理状态下观察到的 ,称为编程性细胞死亡 ( Programmed cell death PCD) ,形态学上表现为细胞凋亡 ( apoptosis) [1]。细胞凋亡是机体的正常细胞在受到生理性或病理性刺激后启动的自发的死亡过程 ,是一种主…     

与细胞凋亡相关的分子和基因研究进展

综述了与细胞凋亡相关的分子和基因的研究进展,部分揭示了细胞凋亡与癌基因的关系,并对细胞凋亡的基因控制研究在癌症治疗上的应用前景进行了大胆的展望。     

家禽免疫器官内细胞凋亡及其凋亡相关基因调控研究进展

细胞凋亡是生物界广泛存在的一种重要的生命过程,是多细胞动物为调节机体发育、维护内环境稳定、有基因调控的细胞主动性死亡过程。在细胞凋亡的分子生物学研究过程中,发现已有多种基因参与细胞凋亡的调控,其中包括Bcl-2家族和Bax、p53、Fas和FasL等。家禽免疫器官胸腺、脾脏和法氏囊内存在着自然凋亡现象,许多学者用物理性、化学性和生物性因素诱导了家禽免疫器官细胞凋亡,证实了细胞凋亡相关基因参与了家禽免疫器官内细胞凋亡的调控。     

猪生长激素基因在昆虫细胞中的分泌表达

将PCR将增得到pGH基因插入到带有polh启动子和gp67强信号肽序列的杆状病毒转移载体pAcGP67-A中，构建重组质粒pGP67pGH，并与线性化致死缺失型苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（AcMNPV-OCC)基因组DNA共转染Sf9细胞，构建出重组病毒AcMNPV-pGP67-pGH-OC^-。感染重组病毒的Hi5细胞的表达产物的SDS-PAGE和Western blot结果表明，细胞可溶蛋白和培养液上清中均有一条分子量约为22kDa的猪生长激素特异性反应带，且培养液上清中的目的蛋白分子量比天然pGH略大一些，薄层扫描仪扫描估测可知，重组pGH分别占细胞可溶蛋白的8．98％和培养液上清总蛋白的3.61%。将表达96h的培养液上清浓缩液进行N－糖基化分析，结果显示重组pGH无N－糖基化加工修饰。     

细胞凋亡:昆虫抗病毒感染的重要机制(续)

3.2 细胞凋亡与Cdk_s活性 任何干扰Cdk/cyclin复合体活性的因素都可毫不含糊地导致细胞凋亡。干扰可发生在Cdk_s或其内在抑制因子(如P21、P27、P16)的表达水平上,也可发生在用化学抑制剂对Cdk活性的抑制作用水平上。     

杆状病毒--一种新的哺乳类细胞传递基因载体

在多角体蛋白基因启动子的控制之下 ,利用杆状病毒已有许多种重组蛋白在昆虫细胞中被表达。许多常用细胞系以及原代培养细胞能被杆状病毒有效转染 ,但几乎观察不到细胞毒性。在哺乳细胞中 ,用带有哺乳类细胞活性启动子元件的重组杆状病毒载体已成功地实现基因的瞬时和稳定传递 ,杆状病毒作为基因治疗外载体 ,能将目的基因传递给哺乳细胞 ,并直接对传递基因的表达产物产生专一性免疫反应 ;补体成份对杆状病毒向哺乳类细胞传递基因的效率有明显抑制作用 ,但假型杆状病毒对补体表现出抗性。杆状病毒介导基因传递可评价启动子在不同细胞中的强度。含有异源病毒基因组的杂交杆状病毒能发动病毒感染 ,并成功用于检验抗病毒药物的效果。杆状病毒作为安全有效的专一性基因传递载体 ,有望在将来发展成更有效的新一代基因治疗载体。     

细胞凋亡:昆虫抗病毒感染的重要机制

最近2002年诺贝尔医学与生理学奖授予英国的悉尼·布雷尔(Briehl,1927～)与美国的罗伯特·霍维茨(Horvitz,1947～)及约翰·苏尔斯顿(Sulston,1942～)3位学者。他们的研究为细胞凋亡/程序性细胞死亡理论提供了分子遗传学的实验证据。     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因在昆虫细胞中的表达

将含有传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）广东地方分离株Ｄ４１的Ｓ１基因ｃＤＮＡ（从ＡＴＧ到Ｓ前体蛋白裂解位点）的片段克隆到具有多角体启动子（ＰＸＩＶ）和人工合成启动子（Ｐｓｙｎ）的杆状病毒转移载体质粒ｐＳＸ－ＩＶＶＩ＋Ｘ３中，构建了重组转基因载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３－Ｓ１．Ｄ４１。用该重组转移质粒与无包涵体的粉纹夜蛾核型多角体病毒ＴｎＮＰＶ－ＳＶＩ－ＧＤＮＡ（ｏｃｃ－，ｇａｌ＋）共转染草地夜蛾（Ｓｆ９）细胞，筛选并纯化出既能表达Ｓ１基因又能形成多角体的重组病毒ＴｎＮＰＶ－ＩＢＶＳ１－ｏｃｃ＋（ｏｃｃ＋，ｇａｌ－）。通过间接ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ等方法在感染了重组病毒的Ｓｆ９细胞中成功地检测到分子量约６２０００的Ｓ１基因表达产物。虽然该重组Ｓ１糖蛋白可能由于Ｎ－糖基化不完全而分子量小于天然蛋白，但它可以像正常病毒粒子一样，被鸡抗ＩＢＶＤ４１株血清特异识别。     

猫泛白细胞减少症病毒VP2基因在昆虫细胞中的表达

根据猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus,FPV)GT-2株VP2蛋白全长基因序列设计1对特异性引物,以GT-2毒株为模板,PCR扩增VP2基因片段(去除终止密码子);与转座载体pFastBacI连接,构建重组质粒pFastBac-VP2,并进行测序鉴定;鉴定正确后,转化到含有辅助质粒的大肠杆菌DH10Bac中,将目的基因定向插入到Bacmid质粒中;经蓝白斑筛选后获得重组Bacmid-VP2,转染Sf9昆虫细胞。电镜负染结果表明:重组Bacmid-VP2在昆虫细胞中包装,形成了大量的杆状病毒粒子;VP2蛋白得到表达并形成了FPV病毒样颗粒。直接免疫荧光试验证明,FPV VP2蛋白在重组杆状病毒中获得了表达。利用双抗体夹心ELISA法检测病毒样颗粒的表达量,表明目的基因在昆虫细胞中获得了较高水平的表达。将表达蛋白作抗原免疫小鼠,经抗体测定证明表达的重组蛋白能诱导机体产生特异性免疫应答。     

小反刍兽疫病毒N基因在昆虫细胞中的表达

为了研发小反刍兽疫病毒ELISA检测试剂盒中替代全病毒的抗原物质,参照GenBank公布的小反刍兽疫疫苗株Nigeria75/1的全基因组序列(GenBank登录号:X74443),人工合成表达核蛋白的N基因开放阅读框序列,通过PCR扩增、经引物设计引入的EcoRⅠ和KpnⅠ特异性酶切位点,将N基因克隆于昆虫杆状病毒表...     

犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因在昆虫细胞中的表达及其抗原性分析

将非典型犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）的核衣壳蛋白（nucleocapsid protein,N）基因克隆到杆状病毒表达系统供体质粒pFastBacHTA中,构建含N基因的重组供体质粒pFastBac-N,转化E.coli DH10Bac感受态细胞,经筛选获得含N基因的重组Bacmid DNA（rBacmid-N）,脂质体法转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒vBacmid-N。用vBacmid-N感染昆虫细胞Sf9,免疫印迹（Western blot）分析,在62kDa处出现一条特异蛋白条带,与重组N蛋白的理论值相符合;间接免疫荧光试验（indirect immunofluorescent assay,IFA）检测,vBacmid-N感染的昆虫细胞sf9出现特异绿色荧光。以纯化的重组N蛋白为抗原建立CDV抗体间接ELISA检测方法,犬CDV阳性血清A450大于0.40,而犬CDV阴性血清A450小于0.05,显示了良好的抗原特异性与稳定性。     

铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因的克隆及在昆虫细胞中的表达

以产弹性蛋白酶的铜绿假单胞菌基因组DNA为模板,经PCR扩增得到约1.5 kb的弹性蛋白酶基因,克隆到质粒pET28 a,连同其上游的6×H is序列转移到pBacPAK8构建成pBacPAK8-H is-E la转移载体。采用L ipofec-tin法,将载体pBacPAK8-H is-E la和亲本病毒BacPAK6共转染Sf21细胞,经空斑纯化分离得到重组病毒BacPAK6-E la。通过双酶切及单酶切鉴定证实弹性蛋白酶基因已插入到病毒基因组的多角体启动子下游,SDS-PAGE检测到在昆虫细胞中表达约34 kD的蛋白条带,以弹性蛋白为底物的生化反应证明了表达产物具有一定的生物学活性。研究结果为弹性蛋白酶的制备提供了新的方法。     

细胞凋亡的常用调控基因研究近况

细胞凋亡主要受基因的控制，现已发现许多基因对细胞凋亡均有直接或间接的调控作用。通常将这些基因分为两大类，即细胞生存基因和细胞死亡基因。一般认为与细胞生存有关的基因包括C－myc,C-abl,Ras,V-src,Bcl-2,EIB,LMW5-HL,C-kit和Bcl-x等；与细胞死亡有关的基因包含P^35,P^53,RB,DCC,WT-1,CpGv,Bcr-abl,V-erb-A,tats20,DAD1,ADO/Fas,TGF-β，TRP－2，RP－8，TRPM－2，SGP－2，TIA，Bax,ICE,C-rel,irrecrst等。本文对目前使用较多研究较深入的几种凋亡调控基因，即C－myc基因，Bcl-2基因，P^53基因，ICE基因，Fas基因及FasL和Cdc2基因的来源，作用和相互间关系的研究近况，予以综述，做一简介。     

以杆状病毒为载体在昆虫细胞中表达致弱I型马立克氏病病毒pp38？…

用限制性内切ｃｏ ＲＩ将不含起始密码子的ｐｐ３８基因从重组转移载体质粒ｐＶＬ ｐｐ３８ Ｉ中切出,将致弱Ｉ型ＭＤＶ ｐｐ３８基因同源物的重组转移载体质粒ｐＶＬ ｐｐ３８与野生型杆状病毒（ＡｃＭＮＰＶ）以脂质体介导法共转染昆虫细胞系Ｓｆ９后,用单克隆抗体Ｈ１９介导的间接荧光抗体法筛选到能表达ＭＤＶ ｐｐ３８基因同源物的重组杆状病毒克隆。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ试验,证实ｐｐ３８ｘ     

猪传染性胃肠炎S基因A D抗原位点在昆虫杆状病毒系统中的表达

猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis，TGE）是猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起猪的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为主要临床症状的高度接触性传染病。该病对2周龄以内的仔猪具有高度致病性，致死率高达100％，是威胁养猪业发展的重要传染病。     

非洲马瘟病毒VP7基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

为了获得具有天然活性的非洲马瘟病毒重组VP7蛋白,制备针对非洲马瘟VP7蛋白的单克隆抗体及建立快速抗体检测方法,本试验通过PCR扩增、胶回收纯化后经Xba Ⅰ和Hind Ⅲ特异性酶切,将VP7基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTB,经PCR、酶切、测序鉴定后,成功构建了携带VP7基因的重组质粒pFastBacHTB-AHSV-VP7。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,经抗生素、PCR筛选,获得转座的杆粒Bacmid-AHSV-VP7,并在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,再感染Sf9昆虫细胞,收获表达产物。表达产物经Western blotting分析表明,VP7重组蛋白得到表达,其分子质量大小约为45 ku,且具有良好的生物活性。