一个新的家蚕锌指蛋白基因的克隆及基因组结构分析

锌指蛋白是一类能与细胞内核酸特异结合 ,调控基因表达活性 ,对细胞分裂、分化、胚胎发育及个体生长有重要作用的转录因子。从家蚕 5龄丝腺组织cDNA文库中克隆了一个具有锌指结构的新基因 ,命名为BmZFP基因 (GenBank登录号 :AY75 36 5 9) ,其cDNA全长为 180 9bp ,编码 14 3个氨基酸 ,3′端非翻译区 (3′ untranslatedregion ;3′ UTR)达 1332bp碱基序列。BmZFP氨基酸序列推测有 6个功能结构域 ,是一种CCHC型锌指蛋白。虽然BmZFP氨基酸序列与人、大鼠和小鼠的相关锌指蛋白的氨基酸序列同源性只有 33%左右 ,但 6个功能域中的Cys(C)和His(H)却完全匹配 ,推测其功能与人、大鼠和小鼠的相关锌指蛋白有相似性。BmZFP基因序列的结构分析表明 :该基因由 2个外显子和 1个 14 86bp碱基序列的内含子组成 ,在 5′端上游 - 182～ - 2 2 2区域存在一个启动子元件 ,但不是典型的TATA盒启动子。     

野生卵穗苔草泛素结合酶基因片段的克隆与序列分析

苔草(Carex L.)是我国极具研究开发潜力的乡土草坪草种质资源.采自内蒙古大青山的卵穗苔草(Carexduriuscula)具有较强的抗旱性和耐贫瘠力,是草坪草抗性育种的重要基因源之一.本研究从野生卵穗苔草干旱抑制性消减杂交的cDNA文库中测序获得一条长度为291 bp、编码50个氨基酸的cDNA基因片段,对该基因片段进行序列分析,确定其属于泛素结合酶(ubiquitin-conj ugating enzyme,E2s)蛋白家族,命名为Cd-UBC2.该基因生物信息学分析结果表明:氨基酸组成中不含吡咯赖氨酸(Ply)和硒半胱氨酸(Sec),这与其他物种UBC蛋白成分非常接近.二级结构预测表     

野桑蚕、家蚕海藻糖酶基因5''侧翼区的克隆与序列分析

海藻糖是一种双糖,广泛存在于包括细菌、酵母、植物和无脊椎动物在内的生物体内,主要功能是储备生物代谢所需的能源.在昆虫血液中,海藻糖是一种最重要的糖类,具有供给能量和提供合成生物大分子的底物等功能.其功能主要是通过海藻糖酶(Trehalase)的作用来实现的.家蚕海藻糖酶有可溶型和膜固定型两种类型,可溶型主要存在于蛹期中肠,而膜固定型存在于包括卵巢在内的多种组织.这两种类型酶是由同一个基因表达而形成不同的成熟海藻糖酶.海藻糖酶膜固定型存在于向血液面的卵巢膜内,该基因的表达是由滞育激素诱导调控.卵母细胞通过位于膜内的海藻糖酶,将血液中海藻糖降解成葡萄糖,然后吸收到胞内,最后合成糖原,从而导致蚕卵的滞育.从而海藻糖酶基因是从分子水平来解明家蚕滞育机理的一个重要途径.本实验从野桑蚕、家蚕苏@菊×明@虎基因组中分别克隆了野桑蚕和家蚕的海藻糖酶基因的5′侧翼区片段并进行了测序分析,以供进一步的启动子功能研究,现报道如下.     

野桑蚕、家蚕LSP基因5′侧翼区的克隆与序列分析

根据已报道的家蚕朝日×东海的幼虫血清蛋白LSP基因序列设计1对引物,以野桑蚕、家蚕苏*菊×明*虎的基因组DNA为模板,分别克隆了野桑蚕、家蚕苏*菊×明*虎的LSP基因5′侧翼区,约1.9 kb,并进行了序列测定与分析.结果表明:克隆的野桑蚕、家蚕苏*菊×明*虎的LSP基因5′侧翼区涵盖了第一内含子、第一外显子、启动子区及其5′上游区;野桑蚕LSP基因5′侧翼区与朝日×东海LSP基因5′侧翼区的同源性达96.4%,其中第一内含子、第一外显子的同源性分别为91.6%,100%;家蚕苏*菊×明*虎的LSP基因5′侧翼区与朝日×东海LSP基因5′侧翼区的同源性达98.9%,其中第一内含子、第一外显子的同源性都为100%,核心启动子区具有典型的TATA盒,还有数种昆虫脂肪体内组织特异性表达基因的共有序列和推定的激素响应元件等功能元件;野桑蚕的LSP基因启动子的5′上游区(-304～-598 bp)与J139家蚕丝素轻链基因第一内含子区域(7 639～7 933 bp)的同源性达90.6%,-913～-1 383 bp为失活的部分水手转座子元件.     

家蚕escargot基因的克隆及启动子活性鉴定

果蝇escargot(esg)基因作为表皮成组织细胞标记基因,可以指示果蝇成虫表皮形成过程。果蝇成虫雌较雄多1个体节,家蚕成虫与果蝇体节数相反。利用同源检索和RACE克隆获得果蝇esg在家蚕中的同源基因Bmesg,发现其ORF为1 128 bp,共编码375 aa。进一步克隆该基因上游约2 000 bp的调控序列esgp2k,细胞转染证明esgp2k有驱动活性。通过启动子截短及荧光素酶活性分析,证明起始密码子上游-270～-190 bp为esgp2k活性关键区域,并成功克隆长270 bp的核心启动子esgp7。上述结果为寻找家蚕成组织细胞潜在分子标记,进而研究家蚕雌雄体节数量差异的分子机制奠定了基础。     

家蚕Gar1p基因的克隆表达及生物信息学分析

在对家蚕功能基因筛选中获得一条长844 bp的基因序列,其编码蛋白与一种富含甘氨酸和精氨酸的核仁小分子RNA结合蛋白(glycine and arginine-rich nucleolar protein,Gar1p)的同源性达63%。利用生物信息学方法分析了该基因上游的启动子序列,发现该基因不含内含子,由1个699 bp的单一外显子编码232个残基的蛋白,预测分子量为22.4 kD,等电点11.43。该Gar1p蛋白的疏水性最大值为1.167,最小值为-2.011,其序列的两端各有1个强亲水性的GAR区域,而中间含有5个潜在的磷酸化位点。Gar1p基因已从家蚕基因组中扩增得到,并克隆进表达载体pET-28a中,在大肠杆菌中得以表达,为研究其功能提供了条件。     

家蚕细胞周期素家族基因的克隆及结构特征与表达分析

细胞周期素(cyclin)是推进细胞周期进程最主要的调控因子之一,并与个体发育及肿瘤形成等有关。为研究细胞周期素家族基因在家蚕组织中的表达情况,利用家蚕基因组数据库信息设计引物克隆了家蚕细胞周期素家族的5个基因,对基因序列结构的分析结果表明,cyclinA、cyclinB、cyclinB3基因分别有7个外显子,cyclinE基因有8个外显子,cyclinL1基因只有1个外显子;cyclinA及cyclinE基因存在较多的剪切方式,cyclinA主要包含大小为2 141和2 173 bp的2种转录本,其变化在第7外显子,cyclinE则含有1 422、1 290及1 194 bp等大小不同的序列,变化集中于第5～7外显子,而cyclinB、cyclinB3及cyclinL1基因则相对稳定。克隆的家蚕细胞周期素家族基因的组织表达存在差异:cyclinA基因只在精巢中表达,cyclinB3基因只在精巢和卵巢中有明显的表达,cyclinE基因在丝腺、脑、脂肪体、中肠、马氏管、精巢、卵巢及血液8种组织都有表达,cyclinB和cy-clinL1基因在除丝腺或血液外的其他7种组织检测到表达。研究结果为进一步探究不同细胞周期素在昆虫蜕皮、变态等生理过程中的功能提供了参考。     

家蚕P450基因CYP305B1的基因组序列克隆及结构分析

为了研究家蚕P450基因CYP305B1的结构,采用反向PCR技术克隆了家蚕CYP305B1基因的基因组序列,经序列测定,拼接得到家蚕CYP305B1全基因序列,发现家蚕CYP305B1的第1内含子位于5′端非翻译区序列(5′-UTR)中间。将家蚕CYP305B1与野桑蚕P450基因CYP305B1V1序列进行同源性比较的结果表明,二者在5′-UTR上游-400～-770 bp序列间的同源性只有40.4%,序列差异最大的是第1内含子和第6内含子。在第1内含子中,野桑蚕CYP305B1V1在翻译起始密码ATG上游-340之前存在330 bp的插入序列,在-110～-340 bp间二者的同源性也只有46.9%;在第6内含子中,家蚕CYP305B1比野桑蚕CYP305B1V1多了一段约300 bp的插入序列。研究结果有助于进一步探究该基因的转录和调控机制。     

抑制泛素结合酶改变猪卵母细胞透明带泛素化状态及精-卵结合能力

本研究旨在探究猪卵母细胞体外成熟过程中添加泛素结合酶(E2)抑制剂对卵母细胞透明带蛋白泛素化水平及精-卵结合能力的影响。试验分为6组:对照组、DMSO组、5、10、15和20μmol·L^-1 NSC697923处理组。采用Western blot方法分析体外成熟培养液中添加不同浓度泛素结合酶抑制剂NSC697923对猪卵母细胞透明带泛素化水平表达的影响。通过Hoechst染色检测不同组别的精卵结合能力。结果表明:1)猪卵母细胞体外成熟培养液中,添加10、15和20μmol·L^-1 NSC697923显著降低卵母细胞成熟率(P<0.05),透明带硬化时间(P<0.05)以及精卵结合率(P<0.05)。2)对照组和各处理组的透明带蛋白在61、81、106 ku处发生不同程度的泛素化标记,而添加15和20μmol·L^-1 NSC697923显著地降低透明带蛋白泛素化水平(P<0.05)。综上表明,猪卵母细胞体外成熟过程中泛素结合酶(E2)改变成熟卵母细胞透明带泛素化水平以及精卵结合能力。     

家蚕细胞色素P450基因CYP6AE2的分子克隆与序列分析

为了在分子水平上研究家蚕(Bom byx mori)细胞色素P450基因的特性,更好地探讨该基因与家蚕抗性的相关机制,依据已有的家蚕基因组数据,通过BLASTP比对,选择与抗性相关的6家族中含有预测基因数量最多的CYP6AE亚家族的1条序列,并设计1对引物,用RT-PCR方法克隆了家蚕细胞色素P450家族基因CYP6AE2(Gen-Bank登陆号:EF415296)。该基因的ORF为1 572 bp,编码523个氨基酸,推定的蛋白质分子质量为60.2 kD,等电点为8.50。将该基因的cDNA和家蚕基因组序列比对,结果表明该基因只有1个内含子;与已知的同亚家族基因CYP6AE1(欧洲防风草结网毛虫Depressaria pastinacella)、CYP6AE12(棉铃虫Helicoverpa armigera)编码的氨基酸序列比对,同源性同为53%。     

一个新的家蚕BmLITAF基因的电子克隆及序列分析

在对家蚕蛹cDNA文库的测序中发现了脂多糖诱导肿瘤坏死因子α的转录激活因子(lipopolysaccharide-induced tumor necrosis factor-α factor,LITAF)的EST序列(GenBank登录号AADK01016184)。经过比对发现BmLI-TAF全长为981 bp,由97 bp的5′端非翻译区序列(5′UTR)、390 bp的开放读码框(ORF)和494 bp的3′端非翻译区序列(3′UTR)组成。用电子克隆方法对BmLITAF进行基因结构分析发现,此基因由3个外显子和2个内含子组成,编码129个氨基酸。对BmLITAF蛋白进行疏水性、跨膜结构和信号肽分析的结果显示,BmLITAF具有跨膜结构域。根据BmLITAF的电子克隆序列由家蚕基因组PCR扩增获得BmLITAF基因,将其克隆到pGEM-T-easy载体中,测序验证与电子克隆结果一致。     

家蚕丝素蛋白H链基因启动子区域的克隆及活性分析

家蚕(Bombyxmori)丝素蛋白H链基因(fib-H)具有在后部丝腺组织专一性、高效性表达的特点。为利用其时空调控机制,通过PCR扩增方法克隆fib-H启动子片段,并进行序列分析,进而构建由fib-H启动子控制报告基因DsRed的重组载体pSK-FH-DsRed-PolyA,通过家蚕BmN细胞和丝腺进行瞬时表达。结果表明:克隆的fib-H启动子序列具有典型的丝腺特异性表达启动子的特征,并可以驱动DsRed报告基因在BmN细胞和家蚕后部丝腺组织中瞬时表达。     

家蚕钙网蛋白的基因结构与初步表达谱研究

钙网蛋白(calreticulin,CRT)是内质网/肌浆网主要的Ca2+结合蛋白,在细胞功能的调节方面发挥重要作用。利用双向电泳技术及质谱技术研究家蚕脂肪体蛋白组的变化,通过分析检索蛋白质组数据,获得了钙结合蛋白的氨基酸序列。通过电子克隆、cDNA3′末端快速扩增(3′rapid amplification of cDNA ends,3′RACE)方法克隆了家蚕钙网蛋白基因cDNA全长序列,命名为BmCRT(GenBank登录号:FJ360528)。BmCRT基因cDNA全长1 705 bp,开放阅读框序列(ORF)长1 197 bp,编码398个氨基酸。氨基酸序列分析显示,BmCRT与其它物种的CRT都具有保守的N-结构域、脯氨酸富集结构域和C-端结构域。BmCRT基因组结构分析表明:该基因由7个外显子和6个内含子组成。分析BmCRTmRNA在不同发育时期的表达变化显示,该基因在家蚕幼虫眠期的mRNA表达量比食桑期高,而在4龄和5龄食桑期mRNA表达量没有随着生长变化而变化。     

一个新的家蚕kunitz类型CI基因的克隆和序列分析

家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂(chymotrypsin inhibitor,CI)的多个编码基因位于多个染色体位点上,是家蚕CI具有丰富多态性的原因之一。根据Gene Bank中登录的家蚕CI基因Sci-sb的mRNA,设计引物克隆了一个家蚕kunitz类型的CI基因,命名为CI-fb。CI-fb基因有3个外显子,开放阅读框长度为255 bp,编码85个氨基酸残基,具有一个典型的kunitz结构域。CI-fb基因与其他已知的kunitz类型的CI基因相比,在基因序列和结构、蛋白序列和结构上高度相似,但在已知的CI基因家族中序列最短。RT-PCR分析表明,CI-fb基因在家蚕的脂肪体、精巢、卵巢、马氏管、气管和中肠6个组织中表达,而在丝腺、血细胞和体壁中没有表达,是一个组织特异性表达的基因。研究结果为进一步研究家蚕CI的多态性和功能提供了新的线索。     

家蚕周期蛋白A基因(BmcyclinA)的克隆和表达谱分析

周期蛋白A(cyclinA)能分别与2种重要的周期蛋白依赖性激酶cdk1和cdk2作用,推动细胞周期的正常进行。利用家蚕基因组数据和分子生物学方法克隆了cyclinA基因在家蚕中的同源物BmcyclinA(GenBank登录号:FJ619105),发现了BmcyclinA基因的另一种错误剪接形式BmcyclinA-1。BmcyclinA基因位于家蚕第13号染色体,由7个外显子和6个内含子组成,其完整开放阅读框为1 533 bp,编码511个氨基酸,在248th-450th氨基酸区域存在2个保守的周期蛋白框。BmcyclinA-1仅能编码正常cyclinA蛋白N端的153个氨基酸残基。RT-PCR分析显示BmcyclinA基因在家蚕整个胚胎发育时期及5龄第3天各组织中均有表达,并且在幼虫精巢中的表达相对较高。     

家蚕丝氨酸蛋白酶基因BmHP21的克隆及表达分析

丝氨酸蛋白酶参与昆虫对抗入侵病原体及保护受伤组织的黑化反应。为了探讨家蚕黑化反应过程中丝氨酸蛋白酶在酚氧化酶原前体级联体系的作用,克隆了家蚕的一个新的丝氨酸蛋白酶基因,命名为BmHP21(GenBank登录号:JF431073)。该基因由1 233个核苷酸组成,编码410个氨基酸。通过SMART网站预测蛋白结构显示BmHP21包括一个clip结构域和一个胰蛋白酶结构域。BmHP21蛋白和烟草天蛾Ms-HP21的氨基酸序列有55%的相似性,推测BmHP21在家蚕黑化反应中起着激活酚氧化酶原前体激酶(PPAE)的作用。RT-PCR检测结果表明,BmHP21在家蚕大部分组织包括脂肪体中都有表达,其mRNA转录几乎贯穿于整个家蚕的幼虫、蛹和成虫发育阶段,推测BmHP21除了参与黑化反应外,还有其它的生理功能。     

家蚕体节极性基因(Bmdpp)的克隆与表达研究

体节极性基因dpp是昆虫发育过程中的关键基因。采用生物信息学的方法,利用家蚕EST数据获得了家蚕dpp基因(Bmdpp)cDNA序列。该cDNA序列全长1 206 bp,ORF1 146 bp,编码381个氨基酸,预测蛋白分子质量38.6 kD,等电点9.18。将克隆的Bmdpp基因完整CDS序列亚克隆到pET-28a(+)表达载体,转化、诱导后经SDS-PAGE电泳检测到约40 kD与预测分子质量相符的目的蛋白条带。对Bmdpp在家蚕胚胎不同发育时期的表达分析发现,该基因在受精6~14 h的表达量很低,甚至没有表达。这一表达模式和果蝇dpp基因在胚胎发育过程中的表达模式相似,推测Bmdpp在家蚕早期胚胎发育的背-腹轴分化中起作用。     

家蚕亲环蛋白基因家族(BmCyPs)

家蚕亲环蛋白基因家族(CyPs)在全基因组水平由18条相似序列组成,与人CyPA在氨基酸序列上具有较高的同源性。结构域分析显示家蚕CyP基因家族可分为单一结构域(SD)和多结构域(MD)两类,无根进化树将18个家族基因分为两枝。本论文根据功能元件相似性预测了家蚕CyP单一结构域(SD)和多结构域(MD)基因的功能,并通过序列氨基酸位点的置换、缺失和插入分析推测位于胞质Cyclophilin基因的功能差异,这些功能差异使蛋白质在三维结构上发生或小或大的变化导致与底物结合的特异性。