重组鸡γ-干扰素对肉鸡生长性能和免疫功能的影响

为研究注射重组鸡γ-干扰素(rChIFN-γ)对肉鸡生长性能和免疫功能的影响,将90只健康14日龄AA肉仔鸡随机分为3组:对照组、试验组Ⅰ和试验组Ⅱ.于14、21和28日龄每只鸡皮下注射含rChIFN-γ 50μg(试验组Ⅰ)和100μg(试验组Ⅱ)的PBS缓冲液1 mL,对照组同期每只注射PBS缓冲液1 mL.每次注射rChIFN-γ 7 d后,对各组肉鸡进行翅下静脉采血,并于35日龄剖杀肉鸡摘取免疫器官.研究表明:①35日龄试验组Ⅰ的淋巴细胞刺激指数极显著高于对照组(P＜0.01);②35日龄试验组Ⅱ的胸腺指数显著高于对照组(P＜0.05);③35日龄试验组Ⅰ的白细胞介素-2水平显著高于其他各组(P＜0.05);④35日龄试验组Ⅰ的TNF-α水平显著高于其他各组(P＜0.05).肉鸡每7天注射一次rChIFN-γ,可提高35日龄肉鸡的免疫机能,促进肉鸡免疫器官的生长发育.     

鸡γ-干扰素联合新城疫活疫苗对肉鸡免疫效果的研究

选用350只1日龄罗氏308商品肉鸡,比较不同剂量的鸡γ-干扰素(ChIFN-γ)在新城疫活疫苗免疫前、后使用以及与疫苗同时使用对淋巴细胞刺激指数、巨噬细胞吞噬指数以及鸡新城疫HI抗体滴度的影响。结果显示:各试验组淋巴细胞刺激指数(SI)均高于空白对照组,表现差异显著(p<0.05);与疫苗对照组相比,疫苗免疫后给药组SI优于免疫前给药组和同时给药组,其中两次免疫后给药组好于一次免疫后给药组,500IU/羽的使用剂量优于100IU/羽;ChIFN-γ在免疫的不同时期使用均能有效提高巨噬细胞吞噬指数;两次免疫后给药组较疫苗对照组能明显提高28日龄以后新城疫抗体滴度,表现差异显著(P<0.05);一次免疫后给药组和免疫前给药各组的新城疫抗体滴度及变化趋势与疫苗对照组接近;但同时给药组各日龄段的新城疫抗体滴度都明显低于疫苗对照组。本试验结果显示ChIFN-γ联合新城疫活疫苗使用有助于提高疫苗免疫效果,其使用最佳时机为新城疫活疫苗免疫后使用,使用剂量为500IU/羽。     

重组鸡γ干扰素对E.tenella卵囊免疫后肠上皮组织结构的影响

取AA肉鸡，在其7日龄和14日龄时分别给予柔嫩艾美耳球虫（E．tenella）孢子化卵囊进行首免和二免，并同时肌肉注射5000U重组鸡γ干扰素（rChIFN-γ）后，于21日龄以同源E．tenella攻虫。试验结果表明，rChIFN-γ协同球虫活卵囊免疫可减少由于球虫病造成的体质量下降，降低OPG值和肠道病变记分，提高抗球虫指数（ACI）；同时还发现，rChIFN-γ能够显著增加肠道绒毛高度、肠隐窝深度、刷状缘厚度（α=0．05）。由此表明，rChIFN-γ可以减轻由于球虫感染所造成的肠道黏膜损伤，促进肠道的吸收功能，进而减轻球虫病所造成的增重损失，对球虫活卵囊疫苗的免疫有一定的免疫增强效果。     

鸡γ-干扰素的功能及临床应用

γ-干扰素(interferon gamma,IFN-γ)是干扰素的一种,是一类具有多种调节效应的细胞因子,主要由活化的T细胞和NK细胞产生,IFN-γ是动物机体最重要的细胞因子之一,是主要的巨噬细胞活化因子.由于其具有广谱高效抗病毒、抗肿瘤活性及其强大的免疫调节作用,IFN-γ已成为当今免疫学、病毒学、细胞学、分子生物学、临床医学、肿瘤学等相关领域的研究热点,被广泛应用于人类疾病临床治疗和动物疾病防控研究.文章就鸡IFN-γ的分子结构、作用机理、生物学功能、存在问题及临床应用等方面做简要综述.     

Effects of Recombinant Chicken lnterferon-γ on Lipopolysaccharide Induced Immunological Stress in Broilers

文章旨在研究前期注射重组鸡干扰素-γ(rChIFN-γ)对肉鸡免疫应激的影响.将40羽14日龄肉鸡随机平均分成A、B,C和D4组.于14、21、28和35日龄给A组和B组肉鸡静脉注射PBS缓冲液1 mL·只-1,C组同期静脉注射含rChIFN-γ 50 μg的PBS缓冲液1 mL·只-1,D组同期静脉注射含rChIFN-γ 100 μg的PBS缓冲液1mL·只-1.于36、38、40日龄,给B、C、D组的肉鸡腹腔注射含有大肠杆菌脂多糖(LPS,按体质量以250 μg·kg-1计算)的PBS缓冲液1 mL·只-1造模,A组同期腹腔注射PBS缓冲液1 mL.记录36日龄至41日龄肉鸡的体质量和采食量,测定第3次注射脂多糖(40日龄)12h肉鸡的血常规和T淋巴细胞刺激指数,并于第3次注射脂多糖后12、24和36 h,测定肉鸡血清白细胞介素-1(IL-1)、皮质酮(CORT)的含量.研究表明:(1)在整个免疫应激时期(36～41日龄),A组的平均日增体质量(P＜0.01)和平均日采食量(P＜0.05)均要高于B、C、D3组,A组的料重比要显著低于B、C、D3组(P＜0.05);(2)第3次注射脂多糖后12 h,C组和D组的白细胞总数显著高于A组和B组(P＜0.05);(3)第3次注射脂多糖后12 h,C组和D组的淋巴细胞刺激指数显著高于A组和B组(P＜0.05);(4)第3次注射脂多糖后12 h,A组的CORT含量显著低于B组(P＜0.05),第3次注射脂多糖后24 h,A组的CORT含量低于B组(P＜0.01)、C组(P＜0.05)和D组(P＜0.05),第3次注射脂多糖后36 h,A组显著低于B组(P＜0.05);(5)第3次注射脂多糖12 h后,A组IL-1显著低于B组(P＜0.05),第3次注射脂多糖24 h后,A组极显著低于其它各组(P＜0.01).结果显示,前期注射rChIFN-γ,可以缓解免疫应激导致的肉鸡血清中IL-1和皮质酮升高,提高免疫应激时期肉鸡的细胞免疫功能,缓解免疫应激对肉鸡的负面影响.     

表达鸡γ-干扰素和传染性支气管病毒S1基因的重组鸡痘病毒疫苗对鸡外周血T淋巴细胞动态分布影响的研究

机体的免疫应答是一个复杂的生物学过程，它以体液和细胞免疫为主，二者相互影响，相互作用，而构成了一个动态整体。本研究通过FACS技术检测SPF鸡接种共表达IBVS1基因和鸡γ-干扰素基因的重组鸡痘病毒疫苗后外周血中CD4^＋、CD8^＋和TCRδγ^＋三种亚类T淋巴细胞的数量的变化，初步探讨了干扰素对鸡外周血中T淋巴细胞亚类动态分布的影响。结果表明，含有干扰素基因的重组鸡痘病毒能显著增高机体特异性的CD8^＋和TCRδγT淋巴细胞水平，CD4^＋T淋巴细胞比例则要低于其他的疫苗免疫组。     

表达MDV gB和/或鸡γ干扰素基因的重组鸡痘病毒免疫效力试验

将表达鸡γ干扰素基因、表达MDV gB基因、共表达MDV gB和鸡γ干扰素基因的重组鸡痘病毒进行组合免疫观察在SPF鸡、狼山鸡中的免疫保护作用。在狼山鸡中随rFPV-gB剂量的减少，保护效力逐渐下降，而在SPF鸡中10^4与10^6PFU的rFPV-gB提供相同的保护效力，但存在减缓增重的副反应；在所有的疫苗组合中，由10^6PFU的rFPV-gB、10^5PFU的rFPV-IFN-Ⅱ和4000PFU HVT组成三价疫苗的保护效力最高且不影响增重，表明鸡γ干扰素既或降低重组鸡痘病毒的减缓增重的副反应，又具有免疫佐剂作用，与重组鸡痘病毒及HVT配合成疫苗是预防MD有效的冻干制剂。     

重组鸡干扰素对E.tenella卵囊免疫后肠上皮组织结构的影响

取AA肉鸡,在其7日龄和14日龄时分别给予柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)孢子化卵囊进行首免和二免,并同时肌肉注射5 000 U重组鸡γ干扰素(rCh IFN-γ)后,于21日龄以同源E.tenella攻虫。试验结果表明,rCh IFN-γ协同球虫活卵囊免疫可减少由于球虫病造成的体质量下降,降低OPG值和肠道病变记分,提高抗球虫指数(AC I);同时还发现,rCh IFN-γ能够显著增加肠道绒毛高度、肠隐窝深度、刷状缘厚度(=α0.05)。由此表明,rCh IFN-γ可以减轻由于球虫感染所造成的肠道黏膜损伤,促进肠道的吸收功能,进而减轻球虫病所造成的增重损失,对球虫活卵囊疫苗的免疫有一定的免疫增强效果。     

重组鸡γ干扰素的抗球虫作用

鸡 γ干扰素 (Ch IFN- γ)是一种重要的细胞因子。对 r Ch IFN- γ抗球虫作用进行初步研究。在 7日龄对试验雏鸡口服接种 4× 10 4 个成熟的柔嫩艾美耳球虫卵囊时 ,结果表明 ,r Ch IFN-γ可以增加试验雏鸡的相对增重率 ,同时还发现 r Ch IFN-γ可以减少 OPG值和肠道病变记分 ,各 r Ch IFN-γ处理组中以肌肉注射 5 0 0 0 U r Ch IFN-γ组的相对增重率最高 ,为 93.0 %,其肠道病变记分和 OPG分别为 1.8和 6 .6 1万 / ml,ACI为 14 1.7     

鸡γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达及抗病毒活性的测定

本研究构建了表达鸡-γ-干扰素（Chicken interferon-γ，ChIFN-γ）的重组杆状病毒rBac-ChIFN-γ。采用鼠抗ChIFN-γ免疫血清作为一抗进行间接免疫荧光（1FA）及间接ELISA检测，表明ChIFN-γ在重组杆状病毒rBac-ChIFN-γ感染的昆虫细胞中获得表达。细胞病变抑制法测定重组ChIFN-γ抗病毒活性试验显示，重组杆状病毒表达ChIFN-γ能有效抑制水疱性口炎病毒（VSV）在鸡胚成纤维细胞（CEF）上的复制。而且其抗病毒活性可以被鼠抗ChIFN-γ免疫血清阻断。试验结果表明，重组杆状病毒能良好表达ChIFN-γ，并具有高效抗病毒活性。     

重组鸡γ干扰素的高密度发酵生产及对肉鸡巨嗜细胞活性影响

研究了培养条件和诱导条件等对工程菌CH1的最终菌体量和表达量的影响,确立最优的高密度发酵条件,还探讨了不同补料流加方式对菌体生长的影响.结果表明,DO-stat流加方式具有显著增加菌体量的作用,发酵液最终菌体密度D600达25.31,湿菌体53.4 g/L,蛋白表达量也达到32.3%,实现了ChIFN-γ的高密度发酵和高表达.初步纯化的鸡γ干扰素以500 U/只的剂量对双A肉鸡口服给药,可以提高机体的巨嗜细胞吞噬活性(P<0.05).本试验为鸡γ干扰素的工业化生产和临床应用提供了依据.     

共表达传染性支气管炎病毒S1基因和鸡干扰素-γ基因的重组鸡痘病毒部分生物学特性测定

将共表达传染性支气管炎病毒S1基因和鸡干扰素-γ基因的重组鸡痘病毒(rFPV-IFNγS1)接种4周龄SPF鸡,免疫3周后用异源病毒LSC99I株攻击,考察重组疫苗对异源病毒攻击的保护作用。结果显示,疫苗接种后,免疫鸡血清中很快出现抗体;外周血中CD4 和CD8 T淋巴细胞的百分含量略高于非免疫对照组,但这种差异并不显著。LSC99I株IB病毒攻击后的保护率结果表明,免疫组的发病率为50%(5/10),死亡率为20%(2/10),非免疫对照组的发病率为100%(10/10),死亡率为50%(5/10);另外免疫鸡的病理损伤程度与非免疫对照组相比,二者差异不明显,在排毒时间和排毒量上也没有明显变化。体重分析结果显示,攻毒前免疫组与对照组相比,体重均没有显著变化,但攻毒后免疫组鸡体重增长的幅度要高于非免疫对照组。从以上结果可以说明,重组疫苗虽然能在动物体内很好地表达,但不能对实验动物产生很好的保护作用,而鸡干扰素-γ基因能在动物体内表达并发挥其免疫调节作用,减轻了重组疫苗对体重增长的影响。     

抗鸡γ-干扰素单克隆抗体的制备及定量ELISA方法的建立

将原核表达重组鸡γ-干扰素(rChIFN-γ)以100μg/只剂量免疫8周龄BALB/c小鼠,4次免疫后进行细胞融合,以昆虫细胞表达重组鸡γ-干扰素为检测抗原,筛选出阳性克隆株,经有限稀释,获得1株稳定分泌抗鸡γ-干扰素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分泌抗体亚型为IgG1型,轻链为Κ链,命名为G1株。Western blot检测显示,该单克隆抗体与原核表达和昆虫细胞表达的rChIFN-γ均具有良好的免疫反应原性。昆虫细胞表达rChIFN-γ经该G1单克隆抗体作用后,失去抑制水疱性口炎病毒(VSV)在鸡胚成纤维细胞(CEF)复制的能力。利用纯化的单克隆抗体和昆虫细胞表达rChIFN-γ建立相对定量ELISA检测方法,取吸光度值(Y)对昆虫细胞表达rChIFN-γ的抗病毒活性单位对数(X)作回归曲线,回归方程为Y=0.1164~*X-0.1281,回归系数R=0.9539,具有艮好的线性关系。     

重组鸡α-干扰素对新城疫病毒复制的影响

毕赤酵母表达鸡α-干扰素经纯化后,以50000U、5000U和500U分别与200ELD50新城疫病毒疫苗株LaSota和中等毒力Q株等量混合,接种9～10日龄SPF鸡胚,记录鸡胚死亡情况并测定尿囊液HA效价,结果表明,高浓度重组干扰素可使病毒致死鸡胚时间延长,并使Q株在尿囊液中的HA效价下降2～3个滴度。     

鸡γ-干扰素基因的克隆及原核表达

参照Digby发表的鸡γ-干扰素的核苷酸序列，设计一对引物，应用RT—PCR技术，从ConA诱导过的鸡脾淋巴细胞中特异性地扩增出大小约为500bp的基因片段。将该扩增基因进行克隆测序，结果表明其序列与Digby报道的CHIFN-γ基因序列的同源性达100％。将该基因插入原核表达载体pGEX-4T-γ中构建成重组表达载体pGEX—CHIFN-γ，并将其导入大肠杆菌BL21中，诱导表达的重组蛋白经SDS—PAGE分析，分子量约为43ku，表明所克隆的CHIFN-γ基因在原核细胞中得到了表达。     

重组鸡γ-干扰素联合鸡新城疫和禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗免疫效果的研究

为研究重组鸡γ-干扰素(Chicken interferonγ, ChIFN-γ)对鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活苗(La Sota株+WD株)的免疫增强效果,取重组鸡γ-干扰素作为免疫增强剂,联合鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗免疫SPF鸡,在免疫后24h和48h采集全血进行细胞因子检测,结果显示免疫后联合免疫组的IFN-γ和IL-4细胞因子水平要高于单独免疫疫苗组;免疫后7、14、21、28和35d分别采集血清测定抗体效价,通过检测血清中针对鸡新城疫病毒和禽流感病毒(H9亚型)的HI抗体水平可知,联合免疫组产生的针对鸡新城疫病毒和禽流感病毒(H9亚型)的抗体均高于单独免疫疫苗组。试验结果表明,重组鸡γ-干扰素对鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活苗(La Sota株+WD株)具有免疫增强作用。     

鸡α-干扰素对罗曼雏鸡免疫功能的影响

为研究鸡α-干扰素对罗曼雏鸡免疫功能的影响,将60羽健康1日龄罗曼雏鸡随机分为2组,即对照组、试验组。试验组鸡于1日龄胸肌注射鸡-α干扰素,0.5 mL/羽;对照组鸡同期每羽注射生理盐水0.5 mL。试验开始后,于第4 d、8 d、12 d、16 d、20 d对鸡进行翅下静脉采血,并于20日龄剖杀摘取免疫器官。研究表明,鸡注射α-干扰素后,其外周血液ANAE+T淋巴细胞百分率和鸡脾相对湿重显著高于对照组,鸡α-干扰素在一定范围内可提高雏鸡免疫功能。     

重组人γ-干扰素基因工程菌发酵工艺优化

研究不同类型培养基、诱导时间、菌体密度和不同补料对rhIFN-γ表达的影响,并运用高密度发酵工艺对rhIFN-γ的产量进行优化,目的蛋白表达量从4 000 mg/L提高到20 000 mg/L以上,发酵产量提高了5倍,大大提高了效率。同时为验证工艺的稳定性,将优化的发酵条件进行连续三批重复发酵实验。结果表明该优化条件具有重复性,表达稳定,维持在40%左右,从而为rhIFN-γ大规模生产奠定了良好的基础。