山羊痘云南流行毒株的分离鉴定及P32基因PCR-RFLP分析

应用牛睾丸细胞,从12份采集自云南省不同疫点的山羊痘病羊肺脏中分离获得3株可疑毒株.这3株流行毒株经本动物回归试验、PCR鉴定及P32基因PCR-RFLP分析后确诊为山羊痘病毒,并据分离地被命名为MYS、XW、XD毒株.     

中国山羊痘弱毒疫苗AV41株基因组分子标记的比较分析

为鉴别我国山羊痘病毒(GTPV)弱毒疫苗AV41株与牛结节性皮肤病病毒(LSDV)野毒株,运用生物信息学方法将AV41株基因组全序列与GenBank中已发表的LSDV、GTPV和绵羊痘病毒(SPPV)基因组进行比较,筛选AV41株基因组分子标记.采用我国不同厂家来源的AV41株疫苗测序验证分子标记相关序列,并与我国LS...     

羊痘病毒活载体疫苗研究进展

广义的"羊痘"包括山羊痘、绵羊痘和结节皮肤病,是羊、牛等反刍动物的重要皮肤传染病,三者分别由山羊痘病毒(Goatpox virus, GTPV)、绵羊痘病毒(Sheeppox virus, SPPV)和结节皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus, LSDV)感染引起,也可交叉感染。GTPV、SPPV和LSDV同属于痘病毒科(Poxviridae)羊痘病毒属(Capripoxvirus)成员,三者统称"羊痘病毒(capripoxvirus, CaPV)"。CaPVs基因组为两端共价闭合的线性双链DNA,对外源基因容纳性较强。病毒本身具有强启动子,可启动外源基因的转录进而对其进行蛋白表达。因此,CaPVs是理想的活疫苗载体,可在体内表达外源抗原并诱导特异性免疫反应。文章综述了CaPVs的基本特征、弱毒活疫苗及CaPV活载体疫苗的研究进展,以期为CaPV活载体疫苗的研究提供参考。     

山羊痘病毒疫苗株RR基因的克隆与序列分析

用绵羊睾丸细胞培养山羊痘病毒疫苗株G14-STV44-55,提取其基因组为模板,设计还原酶(RR)基因的特异引物进行PCR扩增,并克隆至pGEM-TEasy载体,蓝白斑筛选,酶切和测序签定,并对目的基因进行了序列分析。结果获得了RR基因的阳性克隆PGM-RR,DNA片段长度2 669 bp,内存在BglII等4个单一限制性内切酶酶切位点,编码区5′端含有早期转录终止信号TTTTTN(T)T。RR基因核苷酸和推测的氨基酸同源性与GENEBANK中发表的9个参考毒株的同源性分别在97%和99%以上,说明羊痘病毒RR基因具有高度的保守性。     

羊痘病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

山羊痘和绵羊痘是由羊痘病毒引起的一种急性、热性、接触性传染病。为了更快、更准确的诊断该病,本研究根据Gen Bank已经发表的GTPV和SPPV参考毒株(登录号分别为AY077836和AY077832)A29L基因序列,设计合成了1对特异性引物和2条Taq Man探针,同时制备重组质粒标准品。经过反应条件的优化,建立了羊痘病毒实时荧光定量PCR检测方法,对所建立的实时荧光定量PCR方法反应体系的特异性、灵敏性和重复性进行了评价,并用此方法对19份临床样品进行了检测。结果显示:该诊断方法与4种非羊痘病毒不发生交叉反应,并且山羊痘病毒和绵羊痘病毒之间也不发生交叉反应。该方法的重复性试验变异系数均低于2%,并且双重实时荧光定量PCR最低浓度检测限分别为470和440 fg。对标准阳性模板进行定量检测,生成的标准曲线相关系数分别为0.995和0.997。在检测的临床样品中,GTPV和SPPV阳性分别有14和4份,混合感染有1份。结果表明所建立的方法具有良好的特异性,灵敏性、稳定性,可以对GTPV和SPPV进行准确的定量检测。     

通用山羊痘病毒P32基因缺失转移载体的构建

为了构建GTPV P32基因缺失的通用GTPV转移栽体,试验根据山羊痘病毒疫苗株(GTPV-TY)的P32基因结构设计了2对引物,分别扩增得到与P32基因部分相邻的长度约为11kb的同源重组臂序列并插入到pGEM-T easy载体上,通过Smal位点重新连接,并在此位点插入CMV启动子、多克隆位点、BGH polyaA信号以及LacZ基因.结果表明,试验成功构建了通用山羊痘病毒P32基因缺失转移载体pdP32,此转移载体为改造GTPV-TY株以及开发二价或多价基因工程疫苗提供了有力工具.     

羊痘病毒中免疫抑制分子的发现以及在疫苗中的应用

正山羊痘病毒(GTPV)是痘病毒科羊痘病毒属中的重要成员。羊痘病毒属有三个成员,GTPV、绵羊痘病毒(SPPV)和牛皮肤疙瘩病毒(LSDV)。三种病毒基因组高度同源,同源性高达95%以上。山羊痘和绵羊痘主要在亚洲以及非洲地区流行;牛皮肤疙瘩病(LSD)在我国尚无流行报道。但目前,已经在我国周边国家流行,给国内养牛业带来巨大威胁。目前,关于GTPV致病力以及免疫逃避机制的研究鲜     

绵羊痘病毒和山羊痘病毒双重PCR检测方法的建立及应用

为建立鉴别绵羊痘病毒(SPPV)和山羊痘病毒(GTPV)的检测方法,本研究针对这2种病毒的基因组序列,分别设计2对特异性引物,通过对引物浓度、退火温度等的优化,建立了快速鉴别检测SPPV和GTPV的双重PCR方法。该方法分别扩增出SPPV长度为177 bp和GTPV长度为222 bp的目的片段。特异性试验结果显示,该方法对牛疙瘩皮肤病病毒、犬细小病毒、大肠杆菌O157、沙门氏菌、健康羊组织和牛组织均无扩增。敏感性试验显示,该方法最低可检测1.725×107copies/μL的SPPV和1.71×106copies/μL的GTPV。应用该方法对50份临床病料样品进行检测的结果与病毒分离鉴定结果一致,均检出5份感染GTPV的病料和2份感染SPPV的病料,表明该方法可以用于临床病料样品的检测。     

云南山羊痘流行毒株P32基因的克隆与表达

山羊痘是由山羊痘病毒引起的一种严重的、高度接触传染的动物疾病,被国际兽疫局(OIE)列为A类动物传染病.临床上以体温升高、全身性或局部性皮肤痘疹及内脏病变(特别是肺)乃至死亡为特征.山羊痘病毒(GTPV)属痘病毒科脊索动物亚科羊痘病毒属的成员,该属其他成员还有绵羊痘病毒(SPPV)、疙瘩皮肤病病毒(LSDV).P32抗原是一种结构蛋白抗原,包含有一个主要的抗原决定簇,存在于所有的羊痘病毒属的3个成员中.针对山羊痘病毒与副痘病毒属存在免疫交叉反应,缺乏有效的鉴别诊断试剂盒,本研究克隆表达出羊痘病毒属特异的P32蛋白,为进一步研制抗体及抗原检测试剂盒奠定前期工作基础.     

绵羊痘病毒吉林株的分离鉴定及其RPO30、P32和Kl基因的克隆与进化分析

从病理学和病原学角度对临床一起疑似羊痘病例进行了系统的检测分析,确诊该起病例为绵羊痘病毒(sheep poxvirus,SPPV)感染所致。对病死羊进行大体病理剖检,病羊口腔黏膜、尾根及肺脏等内脏器官表面可见有大量痘疹样结节;病理组织学观察可见,肺脏支气管黏膜上皮细胞、肺泡上皮细胞发生变性、坏死、脱落,并伴有上皮化生;此外,在肺泡上皮细胞胞浆中可见有嗜酸性病毒包涵体,该结果提示这起病例可能是羊痘病毒感染所致。之后从病原学角度进行了检测分析,电镜负染观察可见典型的痘病毒粒子;RPO30、P32、Kl基因的PCR检测结果显示,均扩增出与预期目的片段大小相一致的条带;P32基因的系统发育进化分析结果显示,该分离株与SPPV-AV40的亲缘关系较近,证实了该起病例的病因为SPPV感染所致,命名为SPPV-Jilin分离株(KF991006)。该分离株RPO30和Kl基因的测序分析结果发现,与山羊痘病毒相应序列相比,其RPO30基因缺少21bp的核酸序列,而Kl基因在902～925bp位置处存在缺失,该结果表明RPO30和Kl基因将可能用于绵羊痘病毒与山羊痘病毒的鉴别诊断。     

绵羊痘病毒山东流行株的分离鉴定与T4肽基因序列分析

从山东东营疑似绵羊痘病羊的肺脏组织中分离到1株病毒。取疑似绵羊痘病羊组织病料研磨、冻融、离心后分别接种11日龄SPF鸡胚绒毛尿囊膜和牛睾丸继代细胞,鸡胚接种部位出现明显的痘斑;牛睾丸细胞出现聚集、变圆等明显的细胞病变。利用1对绵羊痘病毒T4肽基因特异性引物进行了PCR扩增,获得与预期大小一致的约300 bp的片段。将所得序列与GenBank收录的绵羊痘病毒、山羊痘病毒等毒株相关序列进行比较分析。结果表明,该分离株与国外其他绵羊痘病毒株具有较高的同源性,达97.4%～99.3%;与山羊痘病毒株同源性为96.4%。通过试验初步证明所分离的病毒为绵羊痘病毒,并将该毒株命名为绵羊痘病毒DY株。     

山羊痘病毒的分离鉴定及生物学特性的研究

本研究对2003年广西部分地区山羊群发生的疑似山羊痘进行了病毒分离鉴定及生物特性的研究。取疑似山羊痘病羊的皮肤丘疹、水泡或脓泡组织的病毒悬液，接种初生羔羊睾丸细胞观察到明显的细胞病变，免疫荧光试验结果显示，病毒能与山羊痘标准阳性血清反应，在感染的细胞浆内发出特异性的黄绿色荧光。病毒悬液接种乳鼠、小鼠、豚鼠、兔子都未发病，而接种3月龄山羊则出现典型的山羊痘症状和病理变化，接种9～10日龄鸡胚绒毛尿囊膜，未见出现痘斑，连传3代，均无异常变化。通过病理组织学观察可以看到在细胞浆内有大小不一圆形或椭圆形的包涵体，在电子显微镜下可以观察到150nm～300nm大小，卵圆形、砖形，有囊膜的病毒颗粒。利用一对山羊痘病毒P32基因引物进行了PCR扩增，将所得序列与GenBank收录的5株山羊痘病毒P32基因的核苷酸及氨基酸序列比较分析。结果与疫苗株的同源性分别为99．8％和99．4％。与国外其它毒株的同源性为99．6％和98、8％～99．4％。研究结果表明，所分离的病毒为山羊痘病毒，在生物学特性上与资料记载存在一定的差异，P32基因与疫苗毒和国外毒株之间同源性非常高。将该毒株命名为山羊痘病毒LiuJiang／2003株。     

山羊痘病毒ORF112基因的克隆与序列分析

山羊痘是由山羊痘病毒(goat pox virus,GTPV)引起的一种急性、热性、接触性传染病,A27L蛋白是山羊痘病毒细胞内成熟病毒粒子重要的免疫保护抗原之一,为检测该蛋白诱导的特异性免疫应答,笔者等开展了山羊痘病毒ORF112基因的克隆与序列分析。结果表明:山羊痘毒株(GTPV-S-1)的ORF112基因序列与不同来源的山羊痘病毒分离株相比较,ORF112基因核苷酸序列的同源性达86.8%以上,说明山羊痘病毒的ORF112基因具有高度保守性。该结果为建立敏感、快速、准确、简单易行的GTPV检测方法和ORF112蛋白的后续研究奠定了基础。     

羊痘病毒基因组及其功能研究概况

<正>羊痘病毒(sheeppox and goatpox virus,SGPV)属于羊痘病毒属(Capripoxvirus,CPV),包括绵羊痘病毒(sheeppox virus,SPPV)和山羊痘病毒(goatpox virus,GTPV),引发的羊痘(sheeppox and goatpox,SGP)是羊的一种急性、热性、接触性传染病。受感染的羊群皮毛质量下降,或造成羔羊的大批死亡,是     

山羊痘病毒ORF8～ORF18缺失重组毒株的构建和鉴定

本研究旨在通过敲除山羊痘病毒(GTPV)大段基因组片段尝试构建安全性更好的基因工程减毒株和病毒表达载体.采用PCR方法,克隆了GTPV AV41株基因组ORF7～ORF8间1 242 bp的基因片段,以及ORF18～ORF19间1 355 bp的片段.接着分别以上述2片段作为左、右侧同源重组臂,构建了包含报道基因EGFP和抗性基因gpt的GTPV重组转移载体pCF-Eg.然后采用脂质体介导法,将重组转移载体pCF-Eg与GTPV AV41株共转染原代羊睾丸细胞,通过空斑纯化筛选阳性重组病毒,并鉴定重组病毒的遗传稳定性和生长特性.结果成功获得1株敲除掉ORF8～ORF18间9个ORF、长达7 kb基因组片段的重组病毒vCF-Eg.该重组病毒能稳定表达绿色荧光蛋白至少10代,并且其增殖滴度与亲本毒株基本相同.表明上述区域是GTPV的复制非必需区.     

携带小反刍兽疫病毒H基因的重组山羊痘病毒构建和鉴定

将小反刍兽疫病(PPRV)毒糖蛋白基因H插入到山羊痘病(GPV)毒通用转移载体PtkPgpt-egfpP启动子P7.5的下游,构建了重组山羊痘病毒转移载体PtkPgpt-egfpPpprv-H。该重组转移载体转染感染山羊痘病毒疫苗株的绵羊睾丸细胞中,通过同源重组获得小反刍兽疫病毒H基因重组山羊痘病毒,通过纯化和PCR鉴定,证明小反刍兽疫病毒H基因插入到山羊痘病毒基因组中。本研究为进一步研究PPRVH基因重组山羊痘病毒的免疫原性奠定了基础。     

山羊痘病例的病理学诊断及病毒鉴定

菏泽市某养羊场从散户购买青山羊50余只,购进后1周左右陆续发病,发病羊体温41~42℃,2周内死亡率超过60%,部分羊体表有痘疹样病变,疑似羊痘。对该病例进行了现场调查、尸体剖检、病理组织学检查及病毒分离鉴定。结果显示:病羊眼睑、口、鼻部有痘疹结节,皮肤有大量红色丘疹。剖检病死羊可见肺、胃肠黏膜、肾及肝表面有数量不等的灰白色丘疹。皮肤及黏膜痘疹部的上皮细胞增生、水泡变性,并见胞浆红染包涵体;肺、肝、肾丘疹完全符合痘疹的病变特征,通过Macehiavello包涵体染色在皮肤、黏膜增生的上皮细胞及肝、肾痘细胞的胞浆内有紫红染包涵体。将获得p32基因序列与GenBank上登录的相应序列进行同源性分析表明该分离株与山羊痘病毒分离株的同源性为99.4%~99.8%,但与绵羊痘病毒的同源性偏低(97.2%~98.1%)。系统进化树分析表明该分离株与山羊痘病毒处于同一分支。将纯化后的p32基因扩增产物用Hinf I酶切位点分析表明,该病毒仅在688bp处存在1个酶切位点,酶切后产生2条目的片段(688和311bp)。对p32基因序列进一步分析表明,在169~171位点上存在3个碱基(GAT)的插入,而山羊痘病毒和其他痘病毒在该位点上有3个碱基缺失,证明此次疫情是由山羊痘病毒引起的。据病理学及病原学诊断结果判定该病例为山羊痘重症感染。按《中华人民共和国动物防疫法》规定,扑杀并无害化处理发病羊群,羊舍、场地、用具严格消毒,粪便堆积发酵处理,受威胁区的羊群实施疫苗紧急接种羊痘疫苗,疫情未发生进一步扩散。     

山羊痘病毒疫苗株与野毒株PCR-RFLP鉴别方法的建立及应用

为了建立区分疫苗株与广西分离株的检测方法,根据GenBank上的山羊痘病毒序列设计1对引物,用来扩增山羊痘病毒P32基因,通过对国内疫苗株及6株广西分离株的P32基因进行克隆、测序比较发现,所有广西分离株核苷酸651位的碱基全部由T变为C,647位~652位核苷酸构成由TGTATA变异为TGTACA,多了1个限制性内切酶Bsp1407Ⅰ位点,因此用特异性引物扩增出739 bp的目的片段后,再用限制性内切酶Bsp1407Ⅰ进行酶切分析,疫苗株可以切成135 bp和604 bp 3个片段,广西分离株可以切成135、226、378 bp 3个片段。结果表明,所建立的PCR-RFLP方法可以区分疫苗株和广西分离株。     

山羊痘病毒ITR基因片段的克隆与序列分析

应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y和B株ITR基因片段,插入pMD18-T载体,转化DH5α感受态细胞,提取重组载体经PCR和酶切鉴定后测序,并与GenBank上8株羊痘病毒相应序列进行同源性分析。结果经PCR扩增,4株病毒均可得到一条均一的DNA片段,该片段可被内切酶AluⅠ特异酶切,而且该PCR的DNA模板最小检出量为24.40pg。经测序,该基因片段长度为289bp;序列比较发现,4株病毒ITR片段与GenBank上2株山羊痘病毒的核苷酸与氨基酸序列同源性均为100%,与3株绵羊痘病毒分别为98.2%和96.5%,与3株牛疙瘩皮肤病病毒为98.2%～99.3%和96.5%～97.7%。这表明ITR基因片段在羊痘病毒属中较为保守,可以针对ITR基因建立羊痘病毒的PCR检测方法。     

山羊痘病毒糖蛋白基因ORF112的原核表达及多克隆抗体的制备

为探索山羊痘病毒(GTPV)糖蛋白基因ORF112在疫苗和诊断中的应用,应用PCR技术扩增GTPV弱毒疫苗株AV 41ORF112基因,将其克隆到pET-32a载体,转化感受态细胞BL21,经IPTG诱导后获得与预期大小相符的约37ku的融合蛋白,为可溶性和包涵体表达。应用镍离子亲和树脂对可溶性表达的目的蛋白进行纯化,然后用纯化的融合蛋白免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体。免疫荧光试验表明该多克隆抗体可以与GTPV反应,为GTPV新型疫苗和诊断试剂的研究奠定了基础。