香蕉线条病毒MP功能域基因的克隆、原核表达及抗血清制备

【目的】制备香蕉线条病毒广东分离物(BSV-GD)MP功能域基因编码蛋白的多克隆抗血清,为BSV基因编码蛋白功能的研究提供条件.【方法】对BSV-GD ORF3基因氨基酸序列进行生物信息学分析,得出MP功能域基因序列,克隆该基因并插入载体pET-28b(+)构建原核表达载体,经IPTG诱导表达后,采用超声波裂解法进行蛋白可溶性分析,利用组氨酸标签纯化试剂盒对目的融合蛋白进行纯化和回收,然后以纯化的目的蛋白为抗原免疫健康家兔制备其多克隆抗血清;通过Western-blot分析该抗血清的特异性,间接ELISA法检测该抗血清的效价.【结果和结论】MP功能域基因在ORF3中的序列为61~311 aa处,核酸序列长753 bp.试验克隆了该基因并成功构建了其原核表达载体pET28b-MP,经IPTG诱导1 h后表达了相对分子质量约为30 800的融合蛋白6His·MP.可溶性分析表明该融合蛋白以包涵体形式存在,纯化获得了高纯度的目的融合蛋白,以其为抗原成功制备了BSV-GD MP功能域基因编码蛋白的多克隆抗血清;分析表明该抗血清具有很强的特异性,其效价高达204 800倍以上.     

建兰花叶病毒广东分离物TGBp1生物信息学分析及抗血清制备

建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)是危害兰花的重要病毒。为对建兰花叶病毒广东分离物运动蛋白TGBp1进行研究,本试验制备了TGBp1多克隆抗血清,将CymMV广东分离物TGBp1基因克隆到原核表达载体中,诱导表达融合蛋白,以其为抗原制备多克隆抗血清,并对TGBp1进行生物信息学分析。结果表明,TGBp1融合蛋白的相对分子质量约为31.5 kD,该融合蛋白以包涵体形式存在;并以纯化的融合蛋白为抗原成功制备了TGBp1多克隆抗血清。Western blot分析表明,该抗血清与融合蛋白有较强的免疫反应;间接ELISA结果显示其效价高达524 288倍。生物信息学分析表明,该蛋白结构特征与已报道的CymMV其他分离物基本一致。本研究所制备的TGBp1多克隆抗血清具有专化性,为该蛋白质的生物学功能研究奠定了基础。     

猪链球菌2型epf基因的原核表达及其蛋白纯化

为了克隆、表达SS2菌株轲基因片段,分析蛋白活性,根据GenBank SS2 epf基因序列设计引物,克隆epf基因片段并进行序列分析,构建原核表达质粒pGEX4T-2-epf,在大肠杆菌中诱导带有GST标签的融合蛋白rEF-GST的表达;亲和层析法纯化融合蛋白rEF-GST,用凝血酶切除重组蛋白中的GST,获得纯化的EF抗原。经Westernblot鉴定,EF可与SS2多克隆抗血清发生特异性反应。     

ShSAP1的原核表达及多克隆抗体的制备

将ShSAP1的阅读框连接到原核表达载体p ET32a(+)中,构建成ShSAP1原核表达载体PET-ShSAP1,然后将其转入宿主菌BL21,经IPTG诱导后,宿主菌表达出与预期分子量大小相符的35 ku的融合蛋白;将纯化后的融合蛋白免疫家兔,获得了ShSAP1的特异性抗血清;以融合蛋白作抗原,用间接ELISA法测定其抗血清效价为1∶25 000。     

拟南芥乙烯应答基因HLS1的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】制备乙烯应答基因HLS1多克隆抗体,在过表达植物中检测HLS1的积累,为深入研究HLS1响应乙烯信号通路的分子机制奠定基础。【方法】构建pET28a-HLS1c原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导获得重组蛋白HLS1c-His;镍柱亲和纯化重组蛋白后免疫家兔获得抗HLS1血清,利用抗原亲和纯化抗血清获得高纯度的HLS1多克隆抗体;用HLS1抗体和GFP抗体,检测原生质体瞬时转化体系中GFP-HLS1c融合蛋白的表达;用农杆菌蘸花法获得过表达GFP-HLS1g的转基因植物,用HLS1抗体和GFP抗体检测GFP-HLS1g融合蛋白的表达。【结果】成功构建了原核表达载体pET28a-HLS1c,并在大肠杆菌系统中诱导获得重组蛋白HLS1c-His,且多以包涵体形式存在。纯化的HLS1c-His多克隆抗体,能清晰检测到约80 ng原核表达的HLS1抗原。纯化的HLS1抗体不仅能检测到原生质体中瞬时表达的GFP-HLS1c融合蛋白,也能检测到过表达转基因植物株系中的GFP-HLS1g融合蛋白,并且与标签蛋白GFP对应抗体所检测到的特异性条带大小一致。【结论】成功制备了拟南芥HLS1蛋白多克隆抗体,为HLS1蛋白在植物发育中的功能研究奠定了基础。     

虎源猫泛白细胞减少症病毒VP2基因主要抗原表位区的原核表达和蛋白纯化

利用PCR技术从FPV-HLJ株病毒细胞培养物中扩增VP2基因主要抗原表位区片段VP2’。扩增片段克隆至pMD18-T载体,经核苷酸序列测定确认后,亚克隆于pGEX-6p-1原核表达载体,构建pGEX-6p-VP2’重组原核表达质粒。将该质粒转化至表达菌BL21(DE3)中用IPTG进行诱导表达。表达蛋白采用切胶法纯化,并用SDS-PAGE和Westernblot检测纯化蛋白纯度和抗原特异性。结果表明,VP2基因全长1200bp,编码400个氨基酸。重组菌可表达相对分子量约为66kD的融合蛋白,包括目的蛋白40kD和GST标签26kD。该蛋白以包涵体形式存在,且GST融合蛋白具有良好抗原特异性。     

拟南芥Dof1基因原核表达载体的构建及应用

【目的】构建拟南芥转录因子Dof1基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】利用RT-PCR方法从拟南芥中克隆转录因子Dof1基因,将其连接到原核表达载体pET-32a(+)上,构建重组原核表达载体pET32a(+)-Dof1,经酶切鉴定和测序验证后将其转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导后,纯化重组蛋白,以分离到的重组蛋白为抗原免疫小鼠制备抗血清,检测植物中Dof1蛋白表达水平。【结果】成功构建了拟南芥转录因子Dof1基因的原核表达载体pET32a(+)-Dof1,在28℃、1mmol/L IPTG诱导6h的大肠杆菌中可高效表达分子质量约为42ku的重组蛋白,其分泌到细胞质中,不形成包涵体;Western-blotting检测结果证明,制备的抗血清有较好的抗原-抗体识别反应。【结论】成功实现了Dof1基因的原核表达,制备出的重组蛋白Dof1多克隆抗体可用于植物Dof蛋白表达水平的检测,可为Dof1基因的进一步研究奠定基础。     

水稻密码子优化的cry1Ca 基因在大肠杆菌中表达、纯化及抗体制备

将水稻偏好密码子优化并人工合成抗虫基因cry1Ca通过限制性内切酶酶切的方法构建原核表达载体pET-28bca,成功表达了带6个组氨酸标签的His-cry1ca融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的24%,表达的融合蛋白主要以包涵体的形式存在.对包涵体蛋白进行可溶性处理,亲和纯化出带6个组氨酸标签的融合蛋白,将其作为抗原免...     

球孢白僵菌CDEP2基因原核表达、蛋白纯化及多克隆抗血清制备

类枯草杆菌蛋白酶是昆虫致病真菌重要的毒力因子,利用合成的特异性引物通过RT-PCR扩增了球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因.将其与质粒pET28a连接,构建重组原核表达载体pET28-CDEP2,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE检测His-CDEP2融合蛋白以包涵体方式大量表达并对其进行纯化.用SDS-PAGE分离纯化的CDEP2蛋白免疫家兔,制备了多克隆抗血清.Western blotting免疫印迹检测分析表明,该抗血清对CDEP2蛋白有特异性识别能力,可用于对CDEP2蛋白功能的进一步研究.     

香蕉线条病毒ORF Ⅰ基因的原核表达及抗体制备

利用PCR方法从含香蕉线条病毒广东分离物(BSV-GD)部分基因组的质粒中扩增该病毒的ORF Ⅰ基因,将其克隆到pET-28b(+)原核表达载体中进行了融合表达.SDS-PAGE电泳发现,目的融合蛋白与预期大小一致,相对分子质量约为23 000,表达产物主要以不可溶的包涵体形式存在,将其变性溶解后利用N端的组氨酸标签进行纯化.以纯化产物为抗原免疫兔子制备了香蕉线条病毒的阳性兔抗血清,Western blot和ELISA分析表明,制备的兔抗血清为香蕉线条病毒的高效特异性抗血清,效价高达1:51 200.     

新烟草糖基转移酶原核表达质粒的构建及诱导

利用先期从烟草中克隆的一个糖基转移酶基因,通过PCR扩增得到该基因的ORF,将此片段与原核表达载体pTYB1连接,构建重组载体pT,然后转入大肠杆菌,并进行诱导表达,SDS-PAGE检测表达产物.结果表明,此基因的ORF可在大肠杆菌中表达,但表达产物以包涵体形式存在.     

猪圆环病毒2型ORF2基因原核表达蛋白间接ELISA检测方法的建立

[目的]建立一种检测PCV2血清抗体的间接ELISA方法。[方法]从已构建的克隆质粒pMD-ORF2上酶切回收ORF2基因的羧基端部分ORFc片段,克隆到pGEX-6P-1表达载体上,构建原核表达质粒pGEX-ORFc,转化入大肠杆菌BL21进行原核表达,用Western-blot法检测纯化蛋白,将其作为抗原包被酶标板,优化间接ELISA试验条件,从而建立检测PCV2血清抗体的间接ELISA方法。[结果]重组表达质粒的酶切鉴定证明已成功构建重组表达质粒pGEX-ORFc,其在E.coliBL21中诱导5、6 h时表达效果最好。纯化后的蛋白条带与原重组菌位置一致均在40.0 kD处,证明重组蛋白得到良好纯化。试验确定抗原最佳包被浓度为12.85μg/m l,血清稀释度为1∶40。3次重复检测表明,变异系数最大为7.12%。[结论]建立的ELISA方法对检测PCV2感染具有良好的特异性及重复性。     

重组蛋白sHLA-G1的原核表达与纯化

为了进一步在蛋白质水平对人白细胞抗原HLA-G进行分析,利用已经构建好的克隆质粒pGEM-T-HLA-G1,进一步构建了重组原核表达质粒pET28a-sHLA-G1。SDS-PAGE检测表明,重组蛋白sHLA-G1在大肠杆菌(E.coli)中得到稳定表达,原核表达的重组蛋白sHLA-G1主要以包涵体形式存在。包涵体蛋白经充分洗涤、尿素溶解后用钴离子树脂纯化,并用SDS-PAGE和Western印迹进行了分析,鉴定结果表明,该蛋白纯度达到90%以上,并能与HLA-G特异性抗体87G反应。该研究结果为进一步的复性工作奠定了基础。     

大肠杆菌k88ac菌毛蛋白亚基因的克隆、表达及亲和层析纯化

利用PCR技术,从E.coli C83902中扩增出不含信号肽序列的K88ac菌毛蛋白亚基基因片段,将其克隆到表达载体pQE-30中,构建了原核表达载体pQE30-K88ac,并转入E.coli XL1-Blue中。经IPTG诱导后,由T5启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的以包涵体形式存在的K88ac蛋白,在变性条件下对目的蛋白进行纯化,并获得了高纯度的融合蛋白。     

传染性造血组织坏死病毒糖蛋白基因的原核表达及抗原性分析

应用RT-PCR方法扩增了传染性造血组织坏死病毒IHNV-ZYX株编码的糖蛋白(G)基因,将G基因克隆至原核表达载体pET30b,并在大肠杆菌Rosetta( DE3)中得到了表达.SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到了预期大小的G蛋白.提取G蛋白的包涵体,并制备抗血清.间接ELISA和Western-blott...     

尼罗罗非鱼Hsc70的原核表达和多克隆抗体制备

通过原核表达系统表达尼罗罗非鱼热休克蛋白Hsc70,纯化该蛋白并制备其多克隆抗体。对尼罗罗非鱼热休克蛋白进行生物信息学分析,设计特异性引物,扩增出Hsc70基因,通过双酶切与pET-28a构建重组质粒表达载体,并转入大肠埃希菌B21中通过诱导剂IPTG进行原核诱导表达,表达产物用SDS-PAGE鉴定并用镍柱进行纯化。将纯化后的重组蛋白免疫日本大耳兔制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体效价,Western blot检测抗体特异性。结果表明,原核表达系统成功表达了尼罗罗非鱼热休克蛋白Hsc70,重组蛋白分子量约为75 ku,主要以包涵体形式表达。经镍柱纯化得到高纯度的Hsc70;该蛋白免疫日本大耳兔获得特异性多克隆抗体,效价为1∶2 048 000;Western blot检测到一条75 ku的特异性条带,表明该抗体能特异性地识别尼罗罗非鱼Hsc70蛋白。尼罗罗非鱼Hsc70蛋白在大肠埃希菌中成功表达,制备的重组蛋白和多克隆抗体为深入研究尼罗罗非鱼Hsc70的功能提供了分子工具。     

卵形鲳鲹RelB蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

【目的】制备卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）RelB蛋白（TroRelB）多克隆抗体,为深入研究TroRelB蛋白的结构、功能及蛋白—蛋白相互作用打下基础。【方法】将TroRelB基因与pET-32a表达载体连接构建pET-32a-TroRelB重组质粒,转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）感受态细胞,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,以Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化的TroRelB重组蛋白免疫Balb/C小鼠制备多克隆抗体,应用ELISA和Western blotting分别检测抗体效价及特异性。【结果】以构建的pET-32a-TroRelB重组质粒转化BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导能成功表达获得TroRelB重组蛋白,其相对分子量为84.0 kD,且主要以包涵体的形式进行表达。经Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化透析的TroRelB重组蛋白浓度为0.498 mg/mL,能被抗His标签抗体识别。以纯化TroRelB重组蛋白免疫Balb/C小鼠获得抗TroRelB血清（多克隆抗体）,ELISA检测结果显示其抗体效价为1:256000;Western blotting检测结果显示,5和15 ng的TroRelB重组蛋白均可特异性结合TroRelB多克隆抗体,而阴性对照（免疫前血清）未出现预期条带。【结论】原核系统诱导表达的TroRelB重组蛋白主要以包涵体的形式进行表达,且携带有His标签,以其免疫Balb/C小鼠制备获得的TroRelB多克隆抗体具有较强的特异性和较高的抗体效价,可用于深入研究TroRelB蛋白的生物学功能及揭示卵形鲳鲹的免疫机制。     

嗜水气单胞菌重组Aer毒素的纯化和抗原性分析

对原核表达的重组嗜水气单胞菌Aer毒素进行初步纯化,比较了它与天然Aer毒素的抗原性,为建立检测该毒素的免疫学方法奠定了基础。将原核表达的重组Aer毒素经SDS-PAGE后,切下目的蛋白,利用电洗脱法将蛋白洗脱出来,后经透析、PEG8000浓缩、定量,对獭兔进行免疫,采集血清,提纯IgG,在W estern b lotting试验中可与天然Aer毒素起反应,说明,体外表达的重组Aer毒素保留了天然Aer毒素所具有的抗原性。同时,将嗜水气单胞菌AHCS02菌接种于兔鲜血平板,30℃、培养15 h后,将具有β-溶血的单菌落于LB液体培养基中培养后,用饱和硫酸铵法提取上清液中的天然Aer毒素,用甲醛脱毒后,以同样免疫方法免疫獭兔,免疫结束后,采集血清提取IgG,在W estern b lotting试验中,可以检测到重组Aer毒素。试验说明:原核表达的重组Aer毒素和天然Aer毒素诱导獭兔产生的血清IgG抗体可以互相识别重组Aer毒素和天然Aer毒素,重组Aer毒素和天然Aer毒素有相似的抗原性。     

嗜水气单胞菌重组Aer毒素的纯化和抗原性分析*

 对原核表达的重组嗜水气单胞菌Aer毒素进行初步纯化,比较了它与天然Aer毒素的抗原性,为建立检测该毒素的免疫学方法奠定了基础。将原核表达的重组Aer毒素经SDS-PAGE后,切下目的蛋白,利用电洗脱法将蛋白洗脱出来,后经透析、PEG8000浓缩、定量,对獭兔进行免疫,采集血清,提纯IgG,在Western blotting试验中可与天然Aer毒素起反应,说明,体外表达的重组Aer毒素保留了天然Aer毒素所具有的抗原性。同时,将嗜水气单胞菌AHCS02菌接种于兔鲜血平板,30 ℃、培养 15 h 后,将具有β-溶血的单菌落于LB液体培养基中培养后,用饱和硫酸铵法提取上清液中的天然Aer毒素,用甲醛脱毒后,以同样免疫方法免疫獭兔,免疫结束后,采集血清提取IgG,在Western blotting试验中,可以检测到重组Aer毒素。试验说明：原核表达的重组Aer毒素和天然Aer毒素诱导獭兔产生的血清IgG抗体可以互相识别重组Aer毒素和天然Aer毒素,重组Aer毒素和天然Aer毒素有相似的抗原性。     

猪口蹄疫病毒受体整合素β8亚基配体结合域的原核表达和多克隆抗体制备

病毒受体是决定病毒宿主特异性和组织嗜性的重要因素.利用原核细胞表达了猪口蹄疫病毒受体整合素β8亚基的配体结合域(LBD)片段,分离纯化目的蛋白后免疫兔,制备兔多克隆抗体.以含有猪β8亚基全长cD-NA的质粒为模板,经PCR扩增得到位于β8成熟肽氨基端的LBD基因片段,与带有GST标签的原核表达载体pGEX 4T-1相连,构建原核表达质粒pGEX/β8LBD,测序确认读码框正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),以IPTG诱导表达重组β8LBD融合蛋白.通过SDS-PAGE和Western blot鉴定后提取包涵体,以电泳分离纯化的重组融合蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,鉴定血清效价和特异性.结果显示,实现了重组猪β8LBD融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达,SDS-PAGE显示分子量约为46 000,主要以包涵体形式存在于菌体中.制备的兔多克隆抗体效价达1∶12 800以上,该血清可与目的蛋白发生特异性反应.这将为进一步研究猪整合素β8亚基在宿主体内的分布及其在口蹄疫病毒致病过程中的作用奠定基础.