基于高通量测序的技术检测梨树病毒

【目的】 研究运用基于高通量测序的技术检测梨树病毒,为梨树病毒的检测提供新方法。【方法】 于2014年、2017年、2018年4月中旬采集库尔勒香梨花朵若干,分别进行转录组测序,将得到的序列经过转录本拼接、层次聚类和基因功能注释,筛选出注释为植物病毒的序列作为候选病毒序列。利用RT-PCR方法检测随机采集的香梨枝条样品,验证高通量测序结果的可靠性。【结果】 根据3组转录组测序数据的生物信息学分析结果,分别对注释为来源于植物病毒的66、202和921条基因序列进行分析。3种梨树中已报道的病毒,分别是苹果茎痘病毒、苹果茎沟病毒和苹果褪绿叶斑病毒,以及梨树中未报道的芸薹黄化病毒。采用设计的特异性引物,通过RT-PCR技术对筛选出的4种病毒进行扩增验证,结果扩增出苹果茎痘病毒和苹果茎沟病毒的目的片段。【结论】 高通量测序技术可作为检测梨树病毒的一种快速、有效手段。     

百合无症病毒的RT-PCR检测

以百合病株为材料,针对百合无症病毒(LSV)的CP基因序列,设计合成了一对特异引物,并通过RT-PCR技术扩增出与预期大小相一致的870 bp片段,而对照无任何产物,应用该方法对田间百合中的LSV的带毒情况进行检测,检出率达80%,检测灵敏度高,专一性强,为百合的病毒检测提供了一种分子生物学检测方法.     

百合无症病毒的RT-PCR和IC-RT-PCR检测

 应用DAS-ELISA,RT-PCR和IC-RT-PCR技术检测百合无症病毒（LSV）。 结果表明:RT-PCR和IC-RT-PCR分别可从2 ng和200 ng百合叶片组织中检测出LSV,分别是DAS-ELISA敏感度的1 000倍和10倍。百合鳞茎的不同取样部位对PCR检测结果的影响较大,RT-PCR难以从鳞片和根部检测出病毒,但IC-RT-PCR可以检测出病毒。     

百合无症病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立

百合无症病毒(Lily symptomless virus,LSV)是侵染百合科植物的主要病毒之一。根据该病毒不同分离株外壳蛋白基因(coat protein,CP)的保守序列,设计特异性引物与荧光探针,建立了LSV的实时荧光RTPCR检测方法。利用该方法检测LSV的2个阳性样品,均能够得到典型扩增曲线,而在百合斑驳病毒、烟草环斑病毒、番茄环斑病毒等其他病毒阳性样品中没有典型的扩增曲线,表明了该方法的特异性。与普通RTPCR法相比,此方法灵敏度提高10倍。应用该方法,2012年6月至今,宁波出入境检验检疫局从荷兰进境的67批百合种球样品中检出53批百合无症病毒阳性,检出率为93%。     

万载龙牙百合主要病毒的检测及其检测技术的建立

采用RT-PCR法,检测了万载龙牙百合的主要病毒;通过RT-PCR反应条件的确定,建立了万载龙牙百合主要病毒的RT-PCR检测技术。结果表明:万载龙牙百合感染了百合斑驳病毒,没有感染黄瓜花叶病毒和百合无症病毒;百合斑驳病毒的RT-PCR检测技术为:50℃逆转录30 min;94℃预变性5 min;94℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,30个循环;72℃最后延伸7 min。     

万载龙牙百合主要病毒的检测及其检测技术的建立

采用RT-PCR法,检测了万载龙牙百合的主要病毒;通过RT-PCR反应条件的确定,建立了万载龙牙百合主要病毒的RT-PCR检测技术。结果表明:万载龙牙百合感染了百合斑驳病毒,没有感染黄瓜花叶病毒和百合无症病毒;百合斑驳病毒的RT-PCR检测技术为:50℃逆转录30 min;94℃预变性5 min;94℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,30个循环;72℃最后延伸7 min。     

复合RT-PCR检测猪乙脑病毒和猪流感病毒方法的建立

根据GenBank上已发表的猪乙脑病毒(JEV)的E基因序列和猪流感病毒(SIV)的NP基因序列,设计合成了2对特异引物,分别建立了JEV和SIV的单项RT-PCR诊断方法,通过对扩增条件的筛选,最终成功地建立了JEV和SIV的复合RT-PCR诊断方法,利用一次RT-PCR反应,即可同时扩增JEV的349 bp和SIV 155 bp的特异性片段,而猪瘟病毒(HCV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、正常细胞(PK-15)核酸扩增结果为阴性,对JEV和SIV的最低检出量分别为100和10 pg的cDNA. 该方法适合对JEV和SIV的联合检测和鉴别诊断.     

百合上黄瓜花叶病毒的一步RT-PCR检测

根据黄瓜花叶病毒的外壳蛋白基因序列设计、合成引物,采用Trizol快速提取百合感病组织和健康组织的总RNA,运用RT-PCR两步法和一步法都可从感病组织中扩增出与预期的335 bp大小一致的目标片段,而健康组织无此扩增产物。两种方法相比,一步RT-PCR法特异性强、灵敏度高、省时经济、程序简单,达到了快速检测的目的。     

高通量测序技术在植物病毒分类中的应用

植物病毒寄生可引起植物病毒病,甚至对植物造成毁灭性伤害.高通量测序技术(high-throughput sequencing, HTS)提供了一种快速、低成本、深度测序的解决方案,在病毒鉴定、新病毒检测和病毒基因组多样性等研究中具有优势,促进了植物病毒分类的研究.本文概述了HTS技术检测病毒的进展、在植物病毒学领域应用案例和该方法检测病毒的优缺点,旨在说明HTS技术对病毒鉴定、新病毒发现和病毒分类的重要贡献,提出新病毒检测和鉴定是亟待解决的问题,为植物病毒病的预防提供参考.     

龙山卷丹百合无症病毒的检测

以龙山卷丹百合的病叶作为试材,采用DAS-ELISAS检测法对样品进行百合无症病毒的检测,检出率为58.3%;提取总RNA为模板,通过RT-PCR扩增其外壳蛋白基因,大小为287 bp,和预期条带大小一致。经Blast比对发现,该基因片段与Genbank上发表的LSV CP基因序列同源性达92%以上。     

侵染观赏百合的黄瓜花叶病毒血清学检测方法研究

采用摩擦接种和PEG沉淀法对侵染观赏百合的黄瓜花叶病毒(CMV)进行了提纯,提纯病毒具有典型的核蛋白吸收峰曲线,D260 nm/D280 nm=1.236;利用提纯的CMV免疫大白兔制备抗血清,经微量沉淀法测定,其效价为1∶1024;用硫酸铵沉淀法提纯IgG,制备了辣根过氧化物酶标抗体,利用自制抗血清对DAS-ELISA、间接-ELISA和DIBA-ELISA检测侵染观赏百合的CMV灵敏度和检测范围进行了比较试验,结果表明DAS-ELISA检测的灵敏度较高,是间接-ELISA和DIBA-ELISA灵敏度的4倍;间接-ELISA和DIBA-ELISA的检测范围比DSA-ELISA宽.对21个观赏百合样品的CMV检测结果表明,DIBA-ELISA的检出率为66.67%,间接-ELISA的检出率为38.09%,二者的检出率分别比DAS-ELISA的检出率(23.81%)提高了42.86%和14.28%.     

百合病毒脱毒及检测技术研究进展

阐述百合病毒的种类和危害,系统地介绍热处理、茎尖培养、珠芽培养、热处理结合茎尖培养、病毒抑制剂结合茎尖培养等5种脱毒方法,以及利用指示植物、电镜技术、酶联免疫和分子生物学技术检测百合主要病毒的方法。     

RT-PCR检测齿兰环斑病毒技术的建立

根据已报道的齿兰环斑病毒(ORSV)外壳蛋白(CP)基因序列,进行同源性比较,设计了一对各为20bp的引物.通过优化试验条件,建立了稳定的RT-PCR检测ORSV体系,其检测灵敏度可达0.01ng·mL-1.将此方法与ELISA进行比较,结果表明,RT-PCR检测灵敏度比ELISA高1000倍.应用这两种方法同时检测了138瓶兰花组培苗样品,其中RT-PCR检测出32瓶兰花组培苗感染病毒,而ELISA只能检测其中的18瓶.     

RT-PCR技术检测猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)

根据猪PRRSV的ORF7基因序列,设计并合成了1对引物,以PRRSV RNA为模板,筛选最佳反应条件,建立了检测PRRSV的RT-PCR方法。应用该方法对病毒细胞培养物进行基因扩增,均获得了分子量为443bp的特异性目的片段,而对PCV2、PRV、CSFV及Marc-145细胞进行同条件检测,结果均为阴性;PRRSV扩增产物测序结果与文献报道的PRRSV其他毒株序列同源性达92%~98%。敏感性试验表明,该体系可检测到2.39TCID50的PRRSV;对2004~2005年送检的81份临床样品进行检测,阳性率为23.4%。上述研究结果表明,建立的RT-PCR特异性好、敏感性高,可用于猪繁殖与呼吸综合征的诊断和流行病学调查。     

利用DAS-ELISA检测侵染观赏百合黄瓜花叶病毒的研究

从制备的黄瓜花叶病毒———观赏百合分离物(CMV-Li)抗血清中提纯了IgG,并用过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶(HRP)标记,建立了检测CMV-Li的DAS-ELISA(double antibody sandwich-enzyme-linked immumnosor-bent assay)系统,利用此检测系统并结合生物学方法,对临洮切花百合田间病样和百合不同部位带毒量进行了检测,结果发现CMV-Li的侵染率为23.81%,叶片的带毒量明显高于花和鳞茎.     

鸭坦布苏病毒一步法RT-PCR检测方法的建立和应用

鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)是一种新发现可引起鸭产蛋下降的新型黄病毒,建立一种病原学检测方法对于疫病的诊断和流行病学研究具有重要意义。在对DTMUV序列的比对分析的基础上,设计了1对特异性引物,通过优化PCR反应条件,建立了DTMUV的一步法RT-PCR检测方法。该方法具有特异、快速、敏感、准确等特点,可以检出1.82个TCID50的病毒核酸。对2010年至2011年6月份前的106份产蛋下降鸭群临床病料进行了检测,结果显示样品阳性率为46.2%,表明DTMUV在浙江及其周边省份的产蛋鸭群具有较高的感染率。     

河北省马铃薯Y病毒株系分子鉴定及其RT-PCR检测

根据马铃薯Y病毒(PotatovirusY,PVY)的外壳蛋白基因序列,设计合成了一对寡核苷酸引物,从感染PVY的马铃薯田间病叶组织中提取出病毒的RNA,进行cDNA合成及PCR扩增,得到一条长度约800bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的基因片段大小一致,本试验建立了快速、灵敏、简便的PVY检测的方法。将RT-PCR扩增产物克隆到质粒pGEM-T上,并进行了序列分析。结果表明,克隆的cDNA片段由801个核苷酸组成,编码267个氨基酸组成的理论分子量为29kD蛋白,与PVY外壳蛋白的大小一致,与基因库登记的代表性株系相比,它们之间的核苷酸序列同源性为89 6%～98 8%,氨基酸序列的同源性为93 3%～98 5%,说明PVYCP基因具有高度的保守性(记为PVY-HBEI),与国内报道的PVY-CHU、PVY-ZHJ和PVY-ZHOU株系的氨基酸序列同源性分别为96 6%、98 5%和97 8%,与PVYN和PVYO株系的氨基酸序列同源性分别为93 6%和97 8%,从分子水平上确定PVY-HBEI归属于普通株系(PVYO株系)。     

猪乙型脑炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据猪乙型脑炎病毒(JEV)基因序列,设计合成了一对引物,以JEV疫苗株为模板,建立了检测JEV的RT PCR方法。应用该方法对JEV疫苗株RNA进行扩增,获得与预期大小相符,长度为430 bp的特异性目的片段;RT PCR产物测序结果与文献报道的JEV不同毒株的序列同源性达到98%~100%;敏感性测定该RT PCR可扩增到10 pg的JEV-RNA。结果表明,建立的RT PCR方法对JEV的检测敏感性高、特异性强。     

基于高通量测序分析海带表面细菌群落结构

为研究大连登沙河湾和正明寺海带养殖区海带Saccharina japonica表面及其周围海域海水的细菌群落结构,分别于2015年1月、2月和4月,采用Illumina Miseq PE300高通量测序平台对样本基因组DNA的16S r RNA基因V3~V4区PCR扩增片段进行测序分析。结果表明:从两个海区健康海带和海水中获得优化序列分别为130 158条和124 658条,海带序列可归为8个门和99个属,海水序列可归为14个门和135个属;在门水平,海带首要优势门为厚壁菌门(69%),其次为变形菌门、蓝细菌门、放线菌门和拟杆菌门(1%),海水首要优势门为变形菌门(46%),其次为厚壁菌门、拟杆菌门、蓝细菌门和放线菌门(1%);在属水平,海带主要优势属为乳球菌属(40%)和芽孢杆菌属(10%),其次为Solibacillus、假单胞菌属和节杆菌属(3%),海水首要优势属为弧菌属(21.58%)和乳球菌属(28.29%),其次为科尔韦尔氏菌属、弓形杆菌属和亚硫酸杆菌属(2%)。研究表明,两个海区海带细菌群落组成相似,海带和海水细菌群落组成则明显不同。