羊毛皮张和土壤中炭疽杆菌PCR检测方法的建立

建立了检测炭疽芽孢杆菌染色体特异性基因序列(Ba813)的PCR技术，并用于模拟污染的羊毛、皮张和土壤中炭疽芽孢(Sterne菌株、PasteurⅡ菌株)的检测。结果表明，该方法可特异、敏感地检出0．5g羊毛中Sterne菌株的452个芽孢和PasteurⅡ菌株的688个芽孢；0．5g皮张中Sterne菌株的452个芽孢和PasteurⅡ菌株的1032个芽孢；0．5g土壤中Sterne菌株的452个芽孢和PasteurⅡ菌株1376个芽孢。证实PCR可用于羊毛、皮张和土壤等外环境中炭疽杆菌芽孢的检测。     

炭疽芽孢杆菌PCR鉴定方法的建立

根据炭疽芽孢杆菌3种特异性毒力基因的序列,包括保护性抗原基因(pag)、荚膜基因(cap)和S-层蛋白基因(sap),建立多重PCR鉴定方法。该方法检测11株炭疽芽孢杆菌均为阳性,检测29株非炭疽的其他需氧芽孢杆菌属菌株均为阴性。该方法检测模拟血液样品的灵敏度是2×10~6 CFU/mL(每1mL血液样品最低含有2×10~6细菌),而样品增菌后的检测灵敏度是2×10~2 CFU/mL。制备加入炭疽疫苗菌株芽孢的模拟土壤样品,经增菌培养后,PCR检测灵敏度为3×10~4芽孢/g。另外,还设计了炭疽芽孢外壁结构蛋白基因BclA的鉴定引物,利用该引物的PCR扩增片段长度以及测序结果,能够有效区分Ⅱ号炭疽疫苗菌株和临床分离菌株,本研究能够为炭疽临床诊断和环境监测工作提供技术支持。     

几种动物传染病的卫生防控措施

1炭疽炭疽是由炭疽芽孢杆菌引起的人畜共患传染病,炭疽芽孢对环境抵抗力极强,一旦污染,传染性可保持若干年。本病呈地方流行,家畜食入被炭疽芽孢杆菌污染的饲料或水就可发病。防控措施是严禁牲畜到炭疽杆菌芽孢污染的地方放牧。禁止猪、牛、羊在圈外散养。对猪、牛、羊要注射无毒炭疽芽孢苗。炭疽灭活疫苗,每头牛皮下注射1毫升,每只羊皮下注射0.2毫升。     

贵州省一起皮肤炭疽疫情的病原学分析

为了对贵州省一起疑似皮肤炭疽疫情进行病原学检测和分析,以期为疫情的处置和防控提供科学依据,对患者皮肤渗出液、病死马肌肉及其刨剐地土壤样本进行炭疽芽孢杆菌分离培养,对疑似菌落采用革兰染色镜检、噬菌体裂解试验和青霉素抑制试验进行鉴定,进一步采用普通PCR和实时荧光定量PCR法(Real-time PCR)检测炭疽芽孢杆菌疑似菌株PagA、Cap及rpoB基因。结果共检出7株炭疽芽孢杆菌疑似菌株,其中从患者皮肤渗出液分离出1株菌,从土壤标本分离出6株菌。传统方法将7株疑似菌株鉴定为炭疽芽孢杆菌,普通PCR和Real-time PCR检测结果均显示7株菌株rpoB、PagA和Cap基因阳性。说明从患者皮肤渗出液和土壤标本均检出具有致病基因的炭疽芽孢杆菌,提示该起疫情为一起由炭疽芽孢杆菌所致的皮肤炭疽疫情。     

Taqman-MGB探针法检测炭疽杆菌

根据GenBank中炭疽杆菌的主基因组上gyrA基因,毒力因子px01上pagA基因和侵袭因子px02上的CapA基因分别设计引物和对应Taqman-MGB探针,建立了检测炭疽杆菌的实时定量PCR方法。该方法具有良好特异性,仅对炭疽杆菌检测结果为阳性,而与蜡样芽孢杆菌、苏云金杆菌、巨大芽孢杆菌、沙门菌、大肠杆菌、链球菌、铜绿假单孢杆菌无交叉反应,检测灵敏度最低可达100copies/μL。对24份皮毛盲样和120份送检样品检测结果表明建立的定量PCR方法与商业化定量PCR试剂盒的符合率为100%。Taqman-MGB探针方法灵敏、特异、重复性好,可应用于炭疽杆菌的快速诊断与监测。     

吉林省1起炭疽突发事件的病原菌分离和鉴定

从采集的羊肉和土壤样品中分离、鉴定炭疽芽孢杆菌,样品制备悬液,热处理杀死非芽孢的细菌,然后涂布PLET琼脂平板进行选择性增菌培养。疑似菌落首先使用炭疽特异性的引物进行PCR鉴定,然后进行噬菌体裂解和青霉素抑制试验的鉴定;鉴定非炭疽的菌落进行16SrDNA的测序分析。从可疑羊肉样品中成功分离、鉴定出炭疽芽孢杆菌,确定了本次突发事件的传染源。从屠宰地点采集的土壤样品中未检出炭疽芽孢杆菌,土壤中分离的疑似炭疽样菌落经16SrDNA测序和比对鉴定为蜡样芽孢杆菌等其他需氧芽孢杆菌属的细菌。     

炭疽芽孢杆菌携带前噬菌体的预测及耐药性与毒力分析

【目的】预测并分析炭疽芽孢杆菌携带前噬菌体的比例、前噬菌体携带抗生素耐药基因与毒力基因的情况,了解并分析炭疽芽孢杆菌前噬菌体对菌株耐药性与毒力的影响,为后续研究与应用炭疽芽孢杆菌前噬菌体提供借鉴。【方法】利用PHASTER在线分析软件预测炭疽芽孢杆菌携带的前噬菌体,采用抗生素耐药基因数据库(comprehensive antibiotic research database, CARD)和毒力因子数据库(virulence factors database, VFDB)预测前噬菌体携带的抗生素耐药基因和毒力因子。【结果】预测到1 421条炭疽芽孢杆菌前噬菌体,其中完整型前噬菌体267条,疑似型前噬菌体321条,不完整型前噬菌体833条。每株炭疽芽孢杆菌所携带的全部前噬菌体基因组占其基因组比例为3%～4%。771条前噬菌体携带1 075个耐药基因。耐药表型共有29种,分别来自28种不同的耐药家族,涵盖6种抗生素耐药的作用机制。394条前噬菌体编码688个毒力因子,归类为71种毒力基因和52种毒力因子。分析毒力因子可能的宿主菌株来源构成发现,除炭疽芽孢杆菌外,嗜肺军团菌亚种、蜡样芽孢杆菌、...     

炭疽芽孢杆菌PA-LF1融合蛋白的原核表达及其反应原性研究

【目的】构建炭疽芽孢杆菌弱毒株C40-202PA-LF1融合基因表达载体并对其进行原核表达和反应原性检测,为炭疽亚单位疫苗制备、炭疽诊断和疫苗免疫效果检测提供依据。【方法】根据GenBank中登录的炭疽芽孢杆菌PA和LF基因序列设计2对引物,利用PCR方法从炭疽芽孢杆菌弱毒株C40-202中分别扩增出PA和LF1基因片段,经XhoⅠ限制性内切酶消化后,通过黏性末端进行连接,获得PA-LF1融合基因片段,利用SWISS-MODEL分析软件分别对PA、LF1和PA-LF1融合蛋白进行三级结构预测;将融合基因片段克隆至pET32a(＋)质粒中,构建重组质粒pET32a-PA-LF1,并将重组质粒pET32a-PA-LF1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白表达,Western blotting鉴定融合蛋白并分析其反应原性。【结果】从炭疽芽孢杆菌弱毒C40-202株成功扩增出PA、LF1和PA-LF1融合基因;成功构建了炭疽芽孢杆菌PA-LF1融合基因表达质粒pET32a-PA-LF1,融合蛋白三级结构预测可折叠为正确的空间构象;构建的重组质粒经诱导表达、纯化和SDS-PAGE,获得分子质量为96 ku的融合蛋白,以包涵体形式表达;经Western blotting验证,纯化后的重组蛋白与经Ⅱ号炭疽芽孢苗免疫后的绵羊血清发生特异性结合,表明其具有良好的反应原性。【结论】PA-LF1融合蛋白具有良好的反应原性,可为炭疽诊断和疫苗免疫效果检测提供理论依据,同时也可作为一种炭疽亚单位疫苗的候选组分。     

两株类炭疽菌株的鉴定

检验炭疽沉淀素血清特异性的两株类炭疽菌Ｃ４１－１和Ｃ４１－３，经培养特性和生化特性的鉴定与蜡状芽孢杆菌基本一致。这两个菌株应归为蜡状芽孢杆菌。     

四种“爱丽丝”牌消毒剂对五种细菌的杀菌效果比较

采用定量悬浮试验法,选择大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和无毒炭疽芽胞杆菌等菌株,对四种未知成份（５％浓度）的消毒剂进行了杀菌效果比较。结果表明,Ⅰ号消毒剂对各菌的杀灭效果均很差,Ⅱ号对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的杀灭效果最好,Ⅲ号对多杀性巴氏杆菌的杀灭效果最好,Ⅳ号对大肠杆菌和炭疽杆菌的杀菌效果最好。比较而言,Ⅱ号消毒剂的杀菌效果最好,Ⅲ号、Ⅳ号次之。     

定量PCR技术的研究现状及应用概述

定量PCR的问世是继定性PCR（即常规PCR）后分子生物学方法学研究的一大飞跃，实现了对核酸信息量的分析比较，为疾病的诊断和治疗提供了更多、更有效的基因水平信息。本旨在介绍定量PCR技术的研究现状，包括PCR产物定量检测的几种常用技术以及近年来研究和应用较多的几种重要的定量PCR方法。同时，对定量PCR技术在分子生物学和临床上的应用也作了探讨。     

Real—time PCR和PCR方法快速检测犬细小病毒

为适应出入境口岸对进出境宠物快速检疫的需要,本研究在建立PCR方法检测犬细小病毒(CPV)的基础上,进一步采用Taqman探针技术建立了快速检测CPV的Real-time PCR方法.通过灵敏度对比试验,证实Real-time PCR方法比PCR方法检测灵敏度显著提高.通过对大量不同采样部位样品的检测证实,本研究建立的Real-time PCR和PCR方法具有较高的可靠性,并可显著提高CPV的阳性检出率.     

Real-time PCR方法和PCR方法检测虾白斑综合征病毒

由白斑综合征病毒引起的虾白斑综合征是国际兽医局（OIE）规定的必须上报的水生动物二类疫病。本研究首先通过设计新的PCR引物，提高了PCR检测白斑综合征病毒的阳性检出率。为进一步提高白斑综合征病毒检测的灵敏度，本研究采用TaqMan探针技术建立了快速检测白斑综合征病毒的real-time PCR方法，通过与常规PCR方法比较，证实其检测灵敏度显著提高。     

吉林鹿源狂犬病病毒野毒株磷蛋白基因的测序及分析比较

通过对狂犬病病毒鹿源野毒株(DRV)总RNA的提取,用RT-PCR方法扩增磷(N S)蛋白基因并与T载体连接、克隆,将其转化到大肠杆菌JM109细胞中,测定N S蛋白基因的序列,与其他已经发表的国际标准株、疫苗株等进行比较,分析其氨基酸的同源性和N S蛋白的分子生物学功能,为狂犬病病毒野毒株全基因序列的测定奠定基础。     

鸡马立克氏病的诊断与防治

贵州省某鸡场送检发病鸡6只,根据流行病学、剖解病变疑似马立克氏病,经肝脏进行细菌分离培养24 h后观察无细菌生长,琼脂扩散试验为阳性,马立克氏病毒核酸的PCR检测能扩增出目的条带,表明该病为马立克氏病病毒感染所致。     

羊传染性脓疱病毒内蒙分离株F1L基因的克隆与序列分析

本试验通过对羊传染性脓疱病毒内蒙分离株(OV/nm-05)进行总DNA提取,参考GeneBank中OrfVirus(Strain NZ2)株F1L基因序列设计一对引物,应用PCR技术特异性地扩增出该毒株的F1L基因的片段,并将其克隆到pGEM-Teasy载体后进行测序,得到该病毒F1L基因序列。应用计算机软件将测定序列与参考毒株OV/7、Strain NZ2、OV/C2、OV/mi-90、OV/Torino、OV/2的F1L基因序列进行比较。结果表明羊传染性脓疱病毒内蒙分离株与Strain NZ2同原性最高,达99.1%,与OV/Torino最低,但也为96.3%。说明羊传染性脓疱病毒内蒙分离株F1L基因与其他参考毒株之间差异不大。     

安氏隐孢子虫PCR检测方法的建立

经BLAST检索,以HSP70基因设计一对引物(5'-CAATCGAATTGGATTCTTTGTC-3'和5'-CACCTTCAAAT-ACTTGAATAAGT-3')对奶牛安氏隐孢子虫进行了PCR试验.结果显示所建立的PCR检测方法只能特异扩增隐孢子虫GD株DNA,而对照样本如微小隐孢子虫、弓形虫、圆孢子虫、纤毛虫、肝片吸虫、血矛线虫、莫尼茨绦虫、牛粪便以及大肠杆菌均为阴性;通过对6个浓度梯度的虫体DNA进行PCR反应,结果表明当样本中含有445个隐孢子虫卵囊的DNA时,即可扩增产生清晰可辩的条带.测得该序列长度为494bp,序列分析为牛型C.andersoni.表明该引物能特异扩增C.andersoni,敏感性较高,适合于奶牛安氏隐孢子虫的检测.     

南京地区池塘水中嗜水气单胞菌的分离鉴定与相关毒力基因检测

嗜水气单胞菌在自然界广泛存在,是一种典型的人-兽-鱼共患病病原菌。本研究收集南京市多处湖泊池塘水样,采用增菌、平板分离培养、生化试验和种特异性16S rRNA基因扩增等进行嗜水气单胞菌的分离鉴定;采用PCR技术检测分离株毒力基因的分布,进一步通过动物试验确定是否为致病性菌株。结果,从28份水样中共检出嗜水气单胞菌7株,检出率达25%;其中致病性菌株4株,占被检嗜水气单胞菌总数的57.14%(4/7)。本研究有助于了解南京市水体环境中嗜水气单胞菌的污染情况,为进一步预防该菌所引起的相关疾病的发生和传播提供理论依据。     

绵羊嗜皮菌病PCR诊断方法的建立

为建立动物嗜皮菌病的PCR检测方法,根据GenBank发表的刚果嗜皮菌属的部分16s-rRNA基因序列,设计了1对特异性引物.经PCR扩增,从发病绵羊皮肤病料提取的基因组DNA得到了大小约500 bp的DNA片段.将PCR产物克隆并测序表明,与GenBank发表的刚果嗜皮菌基因序列的同源性为90.632%.而猪胸膜肺麦放线杆菌、大肠杆菌、葡萄球菌、肠球菌扩增结果为阴性;PCR的敏感性试验显示,这时引物能够检测到1 ng的DNA.表明此PCR方法特异性好,敏感性高,可用于嗜皮菌病的快速诊断.     

应用PCR技术检测沙门氏菌

参照文献报道的根据沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因片段所设计的引物序列,合成了１对长２５ｂｐ的引物,对沙门氏菌属Ａ－Ｆ各群中共１６株沙门氏标准菌株和其他１２株非沙门氏菌标准菌株进行ＤＮＡ抽提扩增、结果沙门氏菌ＰＣＲ产物都出现４９５ｂｐ的特异性ＤＮＡ扩增带,而非沙门氏菌均未出现扩增条带,证明这对引物具有沙门氏菌属特异性。