内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中高效表达研究

在实现了内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中高效表达的基础上,对表达条件进行了优化研究.根据枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)内切葡聚糖酶基因序列设计引物.采用PCR扩增到获得去除信号肽后约1.4kb的内切葡聚糖酶基因片段.以此片段成功地构建了pPIC-End载体.并转化至巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GSl 15.经过MD和MM平板筛选和酶活性测定,获得了高效表达的转化子GSl15-pPIC-End I、GSl15-pPIC-EndⅧ和GSl15-pPIC-EndⅧ.在摇瓶培养条件下,酵母工程菌表达优化条件:在pH4～8条件下均能稳定表达,诱导起始OD600=5表达水平最高,甲醇诱导最佳浓度为0.5%～1.O%,于250mL以上摇瓶培养对表达有显著的促进作用.三种工程菌在优化条件后诱导培养,酶活性可达860.7、760.3和786.2 U,分别为原始菌株酶活(63.78 U)的13.5、11.9和12.3倍.SDS-PAGE分析表明.表达产物分子量约为79.82 kD,热稳定性分析表明该酶在65℃保温30 min,可保持最高酶活的80%以上.     

内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中高效表达及表达条件研究

根据枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因序列设计引物,采用PCR扩增到获得去除信号肽后约1.4Kb的内切葡聚糖酶表达片段。以此片段成功构建了pPIC-End载体,并转化至巴斯德毕赤酵母GS115。经过MD、MM平板筛选和酶活性测定,获得了高效表达的转化子GS115-pPIC-EndⅠ、GS115-pPIC-EndⅦ、GS115-pPIC-EndⅧ。在摇瓶培养条件下,对酵母工程菌表达条件进行了优化研究：在pH4-8条件下均能稳定表达,诱导起始OD600=5表达水平最高,甲醇诱导最佳浓度为0.5%-1%,加大培养通气量对表达有显著的促进作用。三种工程菌在优化条件后诱导培养,酶活性可达860.7U、760.3U、786.2U,分别为原始菌株酶活（63.78U）的13.5倍、11.9倍和12.3倍。SDS-PAGE分析表明表达产物分子量约为79.82KDa,热稳定性分析表明该酶在65℃保温30min可保持最高酶活的80%以上。     

费氏弧菌β-内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学分析

以费氏弧菌（Vibrio fischeri）EM17基因组DNA为模板，通过PCR方法克隆了该菌的β-内切葡聚糖酶基因（GenBank Accession Number : EF533943）。将其插入到表达载体pGEX-6p-1中，转化大肠杆菌BL21（DE3），诱导表达。测序结果经DNAMAN软件分析，该基因与GeneBank中费氏弧菌 ES114基因组预测的β-内切葡聚糖酶基因同源性达到97.1％，但与GeneBank中其他β-内切葡聚糖酶基因同源性较低。酶学性质研究表明，该酶的最适反应温度为60℃，最适反应pH值为9.0。同时研究了6种金属离子对该酶活性的影响，结果显示该酶活性依赖金属离子的存在 Mg2+，Ca2+对酶有激活作用，Mn2+, Pb2+则严重抑制该酶的活性。     

融合基因umcel5N-CBM的构建、表达及融合酶性质分析

碳水化合物结合组件（carbohydrate—binding module,CBM）是一些糖基水解酶分子上的结构域,它在纤维素酶降解不可溶纤维素中起着重要的作用。本研究的目的是检测一个新的内切葡聚糖酶Umcel5N（GenBank登录号为ACH67609）加上一个碳水化合物结合组件后得到的融合酶是否获得降解结晶纤维素的能力。本文将编码内切葡聚糖酶Umcel5N的催化结构域（catalytic工能力domain,CD）的序列与编码Umcel6A的CBM序列通过接头序列进行基因融合,得到融合基因umCel5N-CBM,并实现了融合基因在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中的表达。研究结果表明,融合酶Umcel5N-CBM与结晶纤维素（avicel）以及滤纸粉末的结合能力比原始酶Umcel5N提高了约一倍,但未显示出降解结晶纤维素的新活性,说明在结晶纤维素的降解过程中,纤维素酶的催化功能域起到关键作用。     

基于易错PCR技术的中性内切葡聚糖酶基因的定向进化

纤维素酶的工业应用一直受酶活性低,成本高的限制,为了提高中性内切葡聚糖酶的活性,本研究利用易错PCR技术对来自枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis )C-36的内切葡聚糖酶基因进行定向进化研究,在酶分子水平上改造内切葡聚糖酶分子.实验获得了最佳突变株b-15和b-28,其内切葡聚糖酶活力比亲本酶分别提高了2.1和3.6倍.序列分析表明:突变体b-15有6个碱基发生了突变,分别是A360G、T402A、A419T、T648A、A1208G和A1397T,导致4个氨基酸突变,分别是N134K、Q140L、N403S和Q466L;b-28只有1个碱基发生了突变,导致了398位Lys突变为Arg.通过SWISS-MODEL服务器模拟酶的三维结构,分析表明,b-15改变的4个氨基酸分别位于催化结构域的第4和第5个α螺旋之间的转角和结合结构域的第5个β折叠及第9和第10个β折叠之间的转角;b-28的突变位于结合结构域的第4个β折叠.同时,对获得的两株突变株b-15和b-28用正交试验优化产酶条件,优化后的酶活分别达到4.542和5.136 U/mL,是优化前的2.2和1.5倍.实验获得了酶活性提高的内切葡聚糖酶菌株,为进一步在分子水平研究内切葡聚糖酶的功能和其应用打下了基础,也为高酶活酶分子在其他高表达系统的表达提供了基础材料.     

绿色木霉葡聚糖内切酶Ⅰ基因的定点突变及酶学性质的研究

将绿色木霉葡聚糖内切酶EGⅠ基因eg1亚克隆到表达载体pSE380,构建出重组质粒pSE380-eg1,转化到大肠杆菌JM109中表达,利用金属亲和层析对EGI进行纯化,纯化后的酶比活力达到3.8U/mg,其最适反应温度为48℃,最适pH为5.2。同时对EGⅠ的氨基酸残基G291位进行随机定点突变,筛选到一株突变酶G291S,其比活力为野生酶的2.2倍,Km值为野生酶的0.66倍,最适反应温度和最适反应pH值未发生改变。     

枯草芽孢杆菌ZJF-1A5 β-葡聚糖酶基因的克隆、序列分析和表达

β-1,3-1,4-葡聚糖酶是重要的工业用酶,可有效减少大麦β-葡聚糖在啤酒酿造中所造成的麦汁过滤困难和啤酒的非生物性浑浊等负面影响.但内源β-葡聚糖酶在麦芽干燥和糖化过程中丧失了大部分活性.而微生物来源β-葡聚糖酶与麦芽内源酶有相同的底物专一性,且热稳定性优于麦芽内源酶.本研究对Bacillus subtilis mutant ZJF-1A5葡聚糖酶基因进行克隆、序列分析和表达,并对酶在细胞中的分布和酶的热学性质进行了研究.     

内生解淀粉芽胞杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bglS)的克隆与表达及酶学特性分析

β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶普遍存在于植物内生芽胞杆菌中,为了探讨其功能,以内生解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TB2菌株基因组为模板,克隆了β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶基因(bglS).测序结果表明,该基因的ORF全长732 bp,编码一条243个氨基酸的蛋白,理论分子量约为27.33 kD,等电点约为6.89,其ORF序列已登录GenBank(Accession No.EU368224).Blast同源性分析结果表明,该基因的ORF序列与植物互作生防解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens FZB42,GenBank Accession No.CP000560)的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因核苷酸序列的一致性达97.3%,氨基酸序列的一致性达97.1%.将β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶基因全长克隆至pUC18载体上,利用基因自身的启动子构建重组表达载体pUC-bglS,并导入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株中表达.SDS-PAGE分析表明,BL21::pUC-bglS菌株表达了27 kD左右的蛋白;该酶的最适反应温度为55℃,在50℃以下保温60 min后残余80%以上酶活;最适反应pH为6.2,在pH4.4～6.8 4℃保温30 min残余85%以上的酶活;Ca2+和Fe肛可提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活性,而Cu2+、Zn2+、Mg2+和Mn2+对其活性具有显著的抑制作用.实验结果为进一步研究植物内生解淀粉芽胞杆菌TB2 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的功能和应用打下了基础.     

枯草芽孢杆菌ZJF-1AS ββ-葡聚糖酶基因的克隆、序列分析和表达

β-1，3．1，4-葡聚糖酶是重要的工业用酶，可有效减少大麦β-葡聚糖在啤酒酿造中所造成的麦汁过滤困难和啤酒的非生物性浑浊等负面影响。但内源β-葡聚糖酶在麦芽干燥和糖化过程中丧失了大部分活性。而微生物来源β-葡聚糖酶与麦芽内源酶有相同的底物专一性，且热稳定性优于麦芽内源酶。本研究对Bacillus subtilis mutant ZJF-1A5葡聚糖酶基因进行克隆、序列分析和表达，并对酶在细胞中的分布和酶的热学性质进行了研究。     

草酸青霉外切葡聚糖酶基因(cbh1)克隆及其在毕赤酵母中的表达和重组外切葡聚糖酶特性分析

木霉的纤维素酶系中通常缺少β-葡萄糖苷酶,导致了终产物抑制,木霉生长速度明显没有青霉快,因此,来源于青霉的纤维素酶受到了越来越多的重视.通过热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术从草酸青霉(Penicillium oxalicum)M菌株中克隆得到外切葡聚糖酶基因cbh1(GenBank登录号:HQ843504).该基因全长为1 641 bp,无内含子序列,编码547个氨基酸,具有Glu236,Asp238和Glu241典型催化残基,推测属于糖基水解酶第7家族.将cbh1克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,构建重组表达质粒pPIC9-cbh1,电击转入毕赤酵母(Pichia pastoris )GS 115菌株.阳性重组子经测序及活性分析表明,cbh1基因成功分泌表达,表明来源于草酸青霉的外切葡聚糖酶基因首次在毕赤酵母中获得成功表达.重组酶活性分析表明,其活性可达56IU/mg,最适反应pH、温度分别为6.0和55℃,且pH和温度稳定性均较好.研究结果认为,cbh1基因的克隆丰富了纤维素酶的基因资源,其在毕赤酵母中的成功表达也为该类纤维素酶基因高效工程菌株的构建提供了基础.     

一种绿色木霉纤维素内切酶基因的克隆及其定点突变对酶活力的影响

纤维素资源是地球上最丰富的可再生资源,纤维素酶的酶活力和生产成本制约着纤维素的利用.本研究从多年户外放置的朽木(Populus bonatii)中分离出一株真菌G-1,经18S rDNA序列分析鉴定为绿色木霉(Trichoderma viride).从G-1中分离出一种纤维素内切酶基因(endoglucanase,EG;GenBank登录号:HM116999.1).通过重叠引物延伸法对EG进行定点突变,得到一个突变序列EG-mut,将EG和EG-mut分别插入分泌型表达载体pPIC9K,并导入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris),筛选到两个菌株,经刚果红染色和DNS法对酶活性测定,显示其内切酶的活性分别达到20.915 U/mL和24.110 U/mL,酶活力高于本实验中得到的其它重组菌株.结果表明某些定点突变可以揭示影响酶活的重要功能域.     

地衣芽孢杆菌β-1,3-1,4葡聚糖酶基因的克隆和表达

提取地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)基因组，通过PCR克隆了该菌的β-1，3-1，4．葡聚糖酶基因全长。该基因全长818bp,ORF为732bp,编码243个氨基酸，计算分子量为27.35kD，等电点为8．31。经Blast分析，该序列与短小芽孢杆菌(B．pumilus)同源性最高(99％)，而与基因库中地衣芽孢杆菌的同源性为94％，该基因已被GenBank接受(AY225317)。用BamHI和XhoⅠ双酶切目的片断和表达载体pET-30a( )后相连接，构建重组表达载体pET-lic，并导人大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株中表达。酶学特性表明：SDS-PAGE电泳在27kD左右有表达蛋白带，该工程菌总酶活达67．34U／mL，是出发菌的60倍，最适温度在50℃左右，最适pH在5～6之间。该工程菌可作为材料构建耐热性好和酶活高的杂合基因工程菌。     

Collimonas sp.ZL261蛋白酶基因的克隆、表达及其酶学特性

分离自西藏色季拉山海拔4530 m高山草甸土壤的山冈单胞菌(Collimonas sp.)ZL261代谢产物具有很高的蛋白酶活性,为了明确其蛋白酶种类及其作用特点,本文采用限制性内切酶法构建了菌株ZL261的基因组文库,利用透明圈法筛选其胞外蛋白酶活性克隆,对其基因及蛋白结构进行了分析,进一步研究了该酶的表达和酶学特性。结果表明:该蛋白酶基因(命名为capro)包含一个长为1092 bp的完整开放阅读框(GenBank:KF992845),其编码蛋白由363个氨基酸组成;序列比对和同源性分析结果显示,该氨基酸序列与食真菌山冈单胞菌(Collimonas fungivorans)Ter331胞外蛋白酶序列(NC015856)相似性最高,为83%;一级、二级和三级结构分析均显示该蛋白含M35金属蛋白酶家族(EC 3.4.24.20)保守结构域。蛋白酶基因在大肠杆菌DH5α中异源表达获得了约38 kDa的目的蛋白。ZL261粗酶液对金属蛋白酶抑制剂EDTA敏感,最适作用pH值为7,最适温度30℃,在10℃时仍保持70%以上酶活力。综合分析可知,该蛋白酶为中性低温金属蛋白酶。具有较好的开发应用潜能。研究结果为微生物蛋白酶的开发提供了新型种质资源,也为探求不同生境微生物蛋白酶的系统进化关系提供了基础信息。     

甘薯茎线虫(Ditylenchus destructor)β-1,4内切葡聚糖酶基因(Dd-eng-1b)cDNA全长的克隆与序列分析

β-1,4内切葡聚糖酶是植物寄生线虫口针分泌的一类细胞壁降解酶,在植物线虫的侵染过程中具有重要的作用。本文以甘薯茎线虫为材料,用RT-PCR和RACE方法,获得了β-1,4-内切葡聚糖酶基因的cDNA全长,并将该基因命名为Dd-eng-1b (GenBank登录号为FJ430142)。此cDNA全长序列为1640bp,包括一个1443bp的完整ORF,编码一含481个氨基酸的蛋白,其理论分子量与等电点分别为50.89KD,pI为6.94。序列比对分析表明含有糖基水解酶的保守结构域,属于纤维素酶第五家族成员,N端具有19个氨基酸残基组成的信号肽,C端含有细菌式样的纤维素结合域(CBDⅡ)。cDNA与基因组DNA重叠分析表明,此基因包含4个内含子,长度分别为36bp、76bp、187bp和344bp,切割点符合5‘-GT...AG-3’的规律。系统进化树分析表明,该基因与细菌 Bacillus.subtilis和Erwina carotovora 分泌的纤维素酶属于同一支。     

宏基因组漆酶基因片段的克隆与分析

漆酶(Laccase,EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶,能够有效降解木质素物质,在环境碳素循环中占有重要的地位。近年来以环境宏基因组DNA为模板,设计简并引物及PCR扩增方法研究环境微生物基因来监测环境微生物已成为土壤微生物多样性研究的新方法[1]。如Luis等[2]通过对森林土壤微生物中漆酶基因的研究来监测该地区的微生物多样性;Lyons等[3]通过对高盐度沼泽地土壤微生物中漆酶基因的研究来监测该地区的微生物多样性;张桂敏等[4]通过对土壤微生物中木聚糖酶基因的研究来监测该地区的微生物多样性。但是,国内尚无研究环境微生物漆酶基因多样性及监测环境微生物功能的报道。同时漆酶在化工染料     

甘薯茎线虫β-1,4内切葡聚糖酶基因(Dd-eng-1b)cDNA全长的克隆与序列分析

β-1,4内切葡聚糖酶是植物寄生线虫食道腺分泌的一类细胞壁降解酶,在植物线虫的侵染过程中具有重要的作用.以马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)为材料,用RT-PCR和RACE方法,获得了β-1,4-内切葡聚糖酶基因的cDNA全长,并将该基因命名为Dd-eng-1b(GenBank登录号为FJ430142).此cDNA全长序列为1 640 bp,包括1个1 443 bp的完整ORF,编码1含481个氨基酸的蛋白,其理论分子量为50.89 kD,等电点pI为6.94.序列比对分析表明,含有糖基水解酶的保守结构域,属于纤维素酶第五家族成员,N端具有19个氨基酸残基组成的信号肽,C端含有细菌式样的纤维素结合域(CBD Ⅱ).cDNA与基因组DNA重叠分析表明,此基因包含4个内含子,长度分别为36、76、187和344bp,切割点符合5'-GT……AG-3'的规律.系统进化树分析表明,该基因与细菌Bacillus subtilis和Erwina carotovora分泌的纤维素酶属于同一支,推测该基因可能来源于细菌的水平基因转移.     

玫瑰黄链霉菌几丁质酶基因的克隆及拼接表达

应用PCR扩增克隆到玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus)的几丁质酶基因chiC的整个催化域部分,将其与包含信号肽区、纤维素结合区、几丁质结合区三个结构功能域的链霉菌(S.lividans)chiC基因片段相连接,插入pET23b( )质粒上,构建表达载体pLCH,用来转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109(DE3),转化子进行破壁之后在胶体几丁质酶培养基上表现活性。     

麻鸭IL-18成熟蛋白基因的克隆、表达及其表达产物的生物学活性检测

应用RT-PCR技术,直接从麻鸭(Tadorna ferruginea)脾淋巴细胞总RNA中扩增出麻鸭IL-18成熟蛋白(mDuIL-18)基因,克隆到pGEM-T Easy载体。测序结果表明获得了mDuIL-18基因,其大小为513bp,并将该基因亚克隆到原核表达载体pQE30。SDS-PAGE可检测到分子质量为19.76kD的重组蛋白,Western blot证实该重组蛋白可与兔抗鸡IL-18血清发生特异性反应。表达产物以包涵体形式存在,经变性和复性处理后明显促进鸭T细胞转化。用mDuIL-18(150或200ng/鸭)和禽流感病毒(AIV)疫苗免疫鸭2周后,血凝抑制(HI)抗体平均滴度达到7.5～7.7log2,而只用AIV疫苗免疫和用mDuIL-18(100ng/鸭)和AIV疫苗免疫的HI抗体平均滴度仅达到6.3～6.6log2,表明mDuIL-18提高AIV灭活油乳苗诱导的免疫应答。     

热纤梭菌内切β-1，4-葡聚糖酶基因celD在大肠杆菌中的表达及酶学特性分析

热纤梭菌是一种嗜热的厌氧细菌,能产生一种叫纤维素小体的多酶复合物(Bhat et al.,1997),是实现纤维素工业转化的一个较有希望的菌种(于洪日等,1989)。同时热纤梭菌能够产生耐热的纤维素酶,通常在酸性和碱性的pH以及90℃以上的高温下仍能稳定存在,并且可以在广泛的底物上发酵而     

草鱼过氧化氢酶全长cDNA的克隆、序列同源分析与组织表达

过氧化氢酶（catalase,CAT）是生物体内抗氧化防御系统的关键酶之一,在清除过氧化氢而避免机体产生氧化应激的过程中起重要作用。本研究从草鱼（Ctenopharyngodon idellus）肝胰脏中克隆了CAT完整编码序列（complete coding sequence,CDS）。该CAT序列（GenBank登陆号：FJ560431）全长2263bp,包括完全开放阅读框（ORF）1575bp、5＇非编码区（UTR）118bp和3＇UTR570bp。其ORF编码525个氨基酸残基,理论分子量为59.59kD,等电点为7.02。在草鱼CAT cDNA的终止密码子附近,其3＇UTR具有长且完整的AC重复序列,与斑马鱼、鲢鱼及啮齿类动物CAT的3＇UTR AC重复序列相似。序列比较表明,草鱼CAT的核苷酸及推测氨基酸序列与其它多种物种的一致性均较高,其一致性分别为93.4%～43.0%和98.1%～63.3%。同时,草鱼CAT cDNA的推测氨基酸序列具有与其它动物高度保守的特征性基序,包括亚铁血红素结合信号序列＂RLFSYPDTH＂、酶活性中心序列＂FDRERIPERVVHAKGA＂及3个催化位点残基His74、Asn147和Tyr357。此外,草鱼CAT还具有保守的亚铁血红素结合口袋与NADPH结合位点。根据草鱼CAT基因的上述特征,推测其属于CAT基因家族中的单功能或典型CAT基因亚群。采用实时荧光定量PCR（Q-PCR）检测草鱼CAT的组织表达特征。结果显示,草鱼CATmRNA在所检测的11种组织器官中均有表达,其中在肝中表达水平量较高,在红肌、白肌和脂肪中表达量较低。本研究结果将有助于进一步探讨鱼类CAT基因的结构与功能,并为研究其抗氧化分子机理奠定基础。