冰核活性真菌的分离与鉴定

 1997～1998年,从蚕豆等植物霜冻害标本中分离到了12株具有冰核活性的真菌,在-5.5℃下具有较强的冰核活性.室温下保存1年转入冰箱中保存半年的菌丝体培养液仍保持原有的强烈成冰核活性,表明其成冰核活性物质与冰核活性细菌有所不同.经鉴定,这12株冰核活性真菌均为燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum Sac.),这是国内有关冰核活性真菌研究的首次报道.     

我国生物冰核研究进展

我国从1986年起开展了冰核活性细菌的研究,已取得一定的进展。查明了我国冰核细菌种类、分布规律、冰核活性强弱程度,明确了影响冰核细菌冰核活性的某些因素和提出了菌种保存方法;验证了冰核细菌是诱发和加重植物霜冻的重要因素,研究揭示冰核细菌、低温强度和植物霜冻害三者的关系,并进行了药剂和生物防霜新技术研究;利用冰核细菌研制成功了冰蛋白降水催化剂,开展了促冻杀虫、克隆了编码冰蛋白的冰核活性基因及有关冰核细菌分子生物学应用技术研究;首次报道了大麦黄矮病毒冰核活性,对揭示未知生物冰核种类有一定意义。     

影响冰核细菌成冰活性的因素研究

 采用Vail小滴冻结法，定量定性测定了8种因素对INA细菌成冰活性的影响，结果表明：INA细菌浓度为5×10#+2—5×10#+8个/ml细菌，温度为-2℃-7℃范围内，当温度一定时，菌液浓度越高成冰活性越强；当菌液浓度一定时，温度越低成冰活性越强。冰核细菌最佳培养温度为20℃左右，25℃以上成冰活性逐渐降低。冰核细菌在4℃下保存20天成冰活性稳定不变，25℃以上时，温度越高成冰活性丧失越快。培养基组分不同，其成冰活性亦不同，若含有甘油或蔗糖组分，可增加成冰活性。用波长254nm紫外线照射INA细菌菌液1-30分钟时，对其成冰活性和杀灭作用的影响大小，与照射时间长短成正相关，若照射30分钟时，不仅INA细菌全部丧失成冰活性，而且也全被杀死。1%的胃蛋白酶能极显著地破坏成冰活性。pH2.0或pH4.0的酸性溶液和pH10的碱性溶液，都能破坏成冰活性。3种抗菌素都能杀死INA细菌，但不一定能破坏成冰活性，如对丁香假单胞菌(P.S)的成冰活性几乎毫无影响。凡是含有 铜类、硫类和脲类的杀菌剂以及重金属盐类、氯仿和乙醚都具有破坏INA细菌成冰活性的作用。     

冰核细菌对液体食品过冷却点的影响

 于 2 2℃下在KB培养基上培养冰核活性细菌 (Xanthomonascampestris菌株XcIN 1) ,对数生长期离心获得的细胞冰核活性最强。该细胞在 - 3℃时能够起到冰核的作用使纯水结冰。把冰核细菌与液体食品 (如蔗糖、蛋清、牛奶、番茄汁、苹果汁、橘汁、梨汁、酱油、豆酱和食醋 )混合 ,观察其对过冷却点的影响。结果是 ,加入冰核菌使液体食品的过冷却点提高了 0 .3～ 3.7℃ ,表明在冷冻食品工业中应用细菌冰核可以节约能源并提高效率     

杏树上冰核细菌种类及其冰核活性与杏花霜冻关系的研究

 近年从我国河北省仁用杏树上采集了 60个标样 ,从中分离到 1 9株冰核细菌菌株 ,经细菌学鉴定确认是 2个属中的 2个种 :Pseudomonas syringaepv.syringae Van Hall1 92 0 ,有 9株 ,占 47.3% ;Erwinia uredovora (Pon et al.) Dye 1 963,有 1 0株 ,占 52 .6% ,前者冰核活性高于后者。按 - 3℃产生一个冰核所需细菌数量差异来划分冰核活性等级 ,测定结果表明 ,强菌株有 4株 ,占 2 1 .1 % ;中等菌株有 3株 ,占 1 5.8% ;弱菌株有 1 2株 ,占 63.1 % ;总体冰核活性属于中等。研究 INA细菌与花瓣霜冻关系结果表明 ,在低温胁迫下 ,INA细菌能大幅度提高花瓣相对电导率值 ,增大细胞原生质膜渗透性 ,提高过冷却点 2～ 3℃ ,能在 - 3～ - 4℃引起花瓣结冰而发生严重霜冻 ,比未接 INA细菌的对照提高结冰温度 2℃左右。该结果证明了 INA细菌是诱发和加重杏树花期霜冻的重要因素     

冰核细菌对液体食品过冷却点的影响

于 2 2℃下在KB培养基上培养冰核活性细菌 (Xanthomonascampestris菌株XcIN 1) ,对数生长期离心获得的细胞冰核活性最强。该细胞在 - 3℃时能够起到冰核的作用使纯水结冰。把冰核细菌与液体食品 (如蔗糖、蛋清、牛奶、番茄汁、苹果汁、橘汁、梨汁、酱油、豆酱和食醋 )混合 ,观察其对过冷却点的影响。结果是 ,加入冰核菌使液体食品的过冷却点提高了 0 .3～ 3.7℃ ,表明在冷冻食品工业中应用细菌冰核可以节约能源并提高效率     

冰核活性细菌研究进展及其在防霜技术中的应用

冰核细菌是诱发和加重植物霜冻的重要因子,通过减少和控制冰核细菌,在霜冻防治研究方面取得了一定效果．细菌冰核是一类蛋白质,称冰蛋白,由细菌冰核基因编码,据报道已有11种冰核细菌的冰核基因被克隆并在大肠杆菌中得到表达．综述了冰核细菌生物学及分子生物学特性,以及冰核细菌在防霜技术中的应用,阐述了冰核细菌的种类、影响冰核活性的成冰因素及冰核细菌和霜冻害的关系．药剂和生防菌能够防除植物上的冰核细菌．减轻或控制霜冻危害,是防御植物霜冻的一条新途径．     

冰核细菌冰核基因多态性的研究

 根据冰核细菌基因中的多拷贝重复编码区设计并合成简并引物inaZI[5'-GCCGGTTATGGCAGC(T)ACGCTGACC-3'],通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增20株不同种属的INA⁺和INA^-细菌菌株.结果表明:所有供试的冰核活性菌株均获得扩增产物,而非冰核活性菌株则无扩增产物.冰核基因的扩增产物呈多态性.     

利用转座子Tn5诱变冰核细菌获得无冰核活性菌株

 以云南省冰核细菌的优势种类丁香假单胞菌Pseudomonas syringae和菠萝泛菌Pantoea ananas为重组基因工程菌的受体菌,采用Tn5转座子诱变技术,以大肠杆菌Escherichia coli S17／pZJ25∶∶Tn5作为转座子诱变的供体菌,使Tn5插入并整合到冰核细菌基因组中,使冰核基因的线性连续性被破坏,失去冰核活性。大量筛选接合子,获得157株丧失冰核活性的菌株。     

冰核细菌的研究、应用现状和前景

冰核细菌是诱发和加重植物霜冻的重要因子,通过减少和控制冰核细菌,在进行霜冻防治研究方面,取得了一定效果.目前世界上已发现4个属23个种或变种的细菌具有成冰活性.细菌冰核是一类蛋白质,称冰蛋白,由细菌冰核基因编码,报道已有11种冰核细菌的冰核基因被克隆并在大肠杆菌中得到表达.综述了冰核细菌生物学及分子生物学特性,以及冰核细菌在霜冻防除、人工降雨、食品冷藏保鲜、高敏检测和促冻杀虫等方面的研究进展和应用前景.     

冰核细菌的定量分离研究

 冰核细菌可能是自然界中诱发和加重霜冻敏感植物发生霜冻害的重要原因之一。由于单个的冰核细菌细胞并不具有冰核活性,因此,研究植物上冰核细菌的种群数量或密度是研究冰核细菌与植物霜冻害关系的关键。从云南省的元江、寻甸、河口、呈贡、临沧、陆良、宣威、曲靖、富民、昆明市官渡区及越南老街等地采集到108种植物共166个标样中,有45个标样分离共到71株冰核细菌,标样中冰核细菌的检出率为27.1％,最低密度为6.0×10⁴ CFU/g,最高密度为5.12×10⁹ CFU/g。其余121个标样经再次分离未检测冰核细菌,占总标样数的72.9％。在云南植物上,用稀释平板法可检测冰核细菌的最低密度为2.0×10⁴ CFU／g.     

1株高冰核活性细菌的分离与鉴定

从发生冻害的植物组织中分离到1株冰核细菌MB03,该菌株在-3℃时在2 min内的冻结率达到96.5%,而产生1个冰核所需要的细胞数约为2.9×103个,其冰核活性明显高于冰核细菌标准菌株和其它分离菌株.进一步对MB03进行了鉴定,经个体形态与培养特征观测、部分生理生化反应、G C摩尔分数测定、16SrDNA序列对比分析、菌落原位杂交探测特异性基因和PCR扩增冰核基因等鉴定,确定该菌为丁香假单胞菌(P5eudomonas syringae).     

诱发枇杷霜冻害的冰核细菌拮抗菌分离与筛选

[目的]筛选出具有防除枇杷INA细菌的拮抗菌.[方法]从枇杷根际土壤中分离冰核细菌拮抗菌,对其进行抑菌圈、杀菌能力、破坏冰核活性蛋白能力测定.[结果]从不同海拔地区的根际土壤中共分离得到128个菌株,其中有拮抗效果的有55株,平皿拮抗效果强的有15株,再经拮抗系数比较得到9株强拮抗菌菌株,最后筛选出l株杀菌率达98％、破坏冰核蛋白能力达100％的拮抗菌BL-36.[结论] BL-36既有杀菌效果又有破坏冰核蛋白能力,是具有较好利用前景的防除诱发枇杷霜冻害冰核细菌、减轻枇杷霜冻害的生物防治材料.     

冰核细菌Erwinia ananas 110 冰核基因iceA的原核表达及冰核活性分析

为获得具有高冰核活性的基因工程菌,从冰核细菌Erwinia ananas 110扩增冰核基因iceA,将其克隆到pMD19–T载体上,转化大肠杆菌DH5α,单、双酶切鉴定并测序;阳性克隆目的片段亚克隆到表达载体pET–23a(+)上,转化大肠杆菌DH5α,单、双酶切鉴定重组质粒;阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,并经IPTG诱导表达。SDS–PAGE电泳检测表明,冰核基因iceA能够并以包涵体形式表达,相对分子质量约为180 000。冰核活性测定结果表明,重组菌BL21(DE3)pLysS/pET–ice的冰核活性与野生冰核细菌Erwinia ananas 110在–5、–4、–3、–2 ℃下无明显差别。     

冰核细菌对棉铃虫结冰温度影响的研究

 以棉铃虫为对象，采取喷雾和喂食两种接种方法，研究了冰核细菌对昆虫的结冰温度的影响。结果表明：两种方法接种的冰核细菌均能明显提高棉铃虫的结冰温度，但不同接种方法间存在差异。喷雾接种的虫体结冰温度比对照高5.14-10.79℃,接种1天后就将结冰温度提高5.90℃，在棉铃虫化蛹后还能将结冰温度提高7.71℃。喂食接种虫体接种两天后才与对照的结冰温度之间出现明显的差异，能将结冰温度提高2.25-4.56℃,化蛹后仅能将结冰温度提高0.93℃。试验证明，冰核细菌能在昆虫体上起到异源冰核的作用，从而提高虫体的结冰温度。为探索一条利用生物冰核降低越冬害虫的过冷却能力，诱发虫体在较高温度下发生结冰，破坏细胞组织，造成虫体死亡，以此来提高越冬害虫的死亡率，压低来年虫源，减轻危害的促冻杀虫新途径提供了科学依据。     

冰核活性细菌成冰的分子生物学基础及其在食品冷冻中的应用

对冰核活性细菌成冰的分子生物学基础、在食品冷冻中的应用及其安全性问题进行了综述,并对冰核活性微生物在食品冷冻中的应用前景进行了展望.     

云南诱发霜冻害冰核活性细菌的鉴定

 1990年冬,从云南省宾川、大理、昆明、陆良等地采集受霜冻危害小麦、蚕豆、蕃茄上的33个标样,分离出12个冰核活性的细菌菌株.鉴定结果是Erwinia herbicola waranaanas及Pseudomonas syrindae.首次证明云南有冰核活性细菌.     

冰核细菌的研究方法

 简单回顾了冰核细菌研究的历史,根据我们多年来的研究工作经验,详细介绍了冰核细菌研究的基本方法和简单实用的试验研究经验,包括样品的采集、分离及冰核活性的测定等。     

杨树冰核细菌溃疡病发病的主导因素

在我国东北地区、杨树上普遍存在的冰核活性（INA）细菌，能在温度-4℃以下产生冰核活性，主要种类为：成团泛氏菌[Pantoea agglomeransGavinietal=Erwinia herbicola]、菠萝泛氏菌[Pantoea ananas(Serrano)Mergaert et al=E.ananas]、大黄欧文氏菌[Erwinia rhapontici(Millard)Burkholder]、噬夏孢欧文氏菌[Erwinia uredovara(Pon.et al)Dye]和丁香假单胞菌[Pseudomonas syringae pv.syringue Van Hall]。它们主要分布于感病寄主的冻枝、冻死芽、枝干肿包、溃疡瘤、病枝、真菌溃疡病斑等部位，春秋两季为活动期和侵染期，出现频率最高，占细菌分离数的50%以上，泛氏菌占优势，在病部内外均有分布，内部较多，杨树冰核活性细菌在春秋季节霜冻条件下能造成杨树冻达，并引起肿茎型细菌溃疡病，是病害发生的主导因素，研究还证明，杨树冰核活性细菌能增强真菌溃疡病菌的侵染，促进真菌溃疡病的发生。     

北京地区杏树冰核活性细菌种类及其消长动态规律的研究

 【目的】弄清冰核活性细菌（INA细菌）在杏树上分布种类及分布与年消长动态规律，对于通过防治INA细菌防御杏树晚霜冻害具有重要的意义。【方法】对北京杏主产区27个杏栽培品种及山杏进行调查，采用形态及生理生化方法进行种类鉴定，采用小液滴冻结法测定冰核活性。【结果】共分离到22株-5℃有活性INA细菌菌株，被确定为2个属中的3个种： 假单胞菌丁香致病变种（Pseudomonas syringae pv.syringae）10株，占45.5%；成团泛生菌（Pantoea agglomerans）9株，占40.9%；凤梨泛生菌噬夏孢子致病变种（Pantoea ananas pv.uredovora）3株，占13.6%。成团泛生菌为杏树上首次发现的INA细菌，‘玉巴达’杏树上的INA细菌（P. agglomerans）数量分布存在3个高峰期：花期（3月末至4月初）、果实发育期（5至6月初）、越冬初期（12月），夏秋季及寒冬难以分离到INA细菌。【结论】INA细菌分布数量与杏树所处地理位置及生态条件有关，杏不同器官上分离到的INA细菌的频率也存在差异。