11种杀虫剂对松墨天牛肌肉LIM蛋白基因表达的影响

松墨天牛（MonochamusalternatusHope）是松树的重要蛀干害虫,也是松材线虫（Bursaphelenchusxylophilus）的主要传播媒介。试验从松墨天牛文库中分离得到肌肉LIM蛋白基因的部分cDNA序列,长度为871 bp,命名为MaLIM（GenBank：KJ872589）;与赤拟谷盗（Tribolium castaneum）和家蚕（Bombyxmori）氨基酸相似性分别为77%和75%。用RT-qPCR测定了11种杀虫剂对MaLIM相对表达量的影响,结果表明,杀虫剂处理后MaLIM基因的表达量均有所下降,仅为对照的0.03~0.53。     

松墨天牛铁蛋白重链相似物的cDNA克隆及生物信息学分析

昆虫铁蛋白(ferritin)由两个亚基组成,类似于脊椎动物铁蛋白的重链和轻链.从松墨天牛(Monoc hamusahe rnatus)cDNA文库中筛选出erritin基因的重链同源物(HCH) cDNA序列,其开放阅读框(ORF)长669 bp,编码222个氨基酸,命名为Mafer,GenBank登录号为KJ872588,该序列推测的蛋白分子质量为25.8 ku,等电点为5.72.预测的松墨天牛ferritin信号肽长度为18个氨基酸残基,在5'非编码区没发现铁反应元件(IRE),N末端有保守的半胱氨酸,符合脊椎动物重链特点.相似性比对显示,松墨天牛ferritin与光肩星天牛(Anoplophora glabripennis)和桑天牛(Apriona germari) ferritin的相似性分别为93％和69％;系统进化树分析显示,松墨天牛与光肩星天在同一分支下,与黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)亲缘关系较远.     

唐鱼热休克蛋白60基因cDNA克隆及表达

采用RT-PCR和RACE技术,成功克隆了唐鱼(Tanichth ys albonubes)热休克蛋白60基因cDNA全长序列,命名为TaHSP60(GenBank登录号:HM234132).研究表明:该基因序列全长为2 486 bp,5′端非翻译区(URT)102 bp,3'URT 656 bp,开放阅读框(ORF)...     

松墨天牛ADP核糖基化因子1基因的序列及表达特性分析

为了探讨Ras基因超家族中ADP核糖基化因子1基因(ARF1)在昆虫生长发育进程中以及在温度胁迫下的表达特性,以松墨天牛为研究对象,从已构建的cDNA文库中筛选到松墨天牛ARF1基因,命名为MaARF1(Gen Bank:KY368168),对其进行序列分析以及不同虫态和不同温度胁迫下的表达特性分析。结果显示,MaARF1基因编码区序列长为549 bp,编码182个氨基酸。预测蛋白质二级结构主要由α螺旋与β片层组成,其次是无规则卷曲和β转角。通过DNAMAN软件比对发现,MaARF1与赤拟谷盗ARF1蛋白氨基酸序列完全一致,二者同源性为100%,且存在1个十四酰基化位点(G~2)和5个保守域(G_1 box—G_5 box)。通过RT-qPCR分析表明,MaARF1的表达量与松墨天牛的完全变态发育相关,各虫态不间断表达,幼虫期在2龄幼虫(L2)、5龄幼虫(L5)中表达量较高,蛹化期间(L5—P0)表达量表现为上升趋势,并在第2天蛹(P2)中达到最大值,羽化期间(P10—A0)表达量表现为下降趋势;MaARF1在不同温度胁迫下均有表达,低温与高温都会导致表达量下调,温度越高或越低,表达量下调越显著。因此,MaARF1可能主要影响松墨天牛蛹化和羽化这2个变态发育关键点,从而影响整个变态发育历程,同时其也可能参与了松墨天牛体内依赖温度的Ca~(2+)信号途径。     

红麻谷胱甘肽还原酶基因(HcGR)的克隆及盐胁迫下表达分析

[目的]克隆红麻谷胱甘肽还原酶基因(HcGR)并分析其组织表达特性及不同盐胁迫下的表达模式,为深入研究HcGR基因在响应盐胁迫的分子调控机制提供理论参考.[方法]基于红麻转录组测序结果,克隆HcGR基因,对其序列进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR检测HcGR基因在红麻不同组织及不同盐度胁迫[CK(0 mmol/L NaCl)、T1(50 mmol/L NaCl)、T2(100 mmol/L NaCl)和T3(200 mmol/L NaCl)]下的表达情况.[结果]克隆获得的HcGR基因开放阅读(ORF)长度为1698 bp,其编码蛋白相对分子量为60 kD,由555个氨基酸残基组成,理论等电点(pI)为8.46,为亲水性蛋白,定位于叶绿体;HcGR蛋白二级结构以无规则卷曲为主,以α-螺旋、延伸链和β-转角为辅,所占比例分别为44.14%、27.75%、22.16%和5.95%,其三级结构由无规则卷曲、α-螺旋和延伸链3种结构元件相互盘绕而成;该蛋白与榴莲GR蛋白亲缘关系较近.HcGR基因在红麻根、茎和叶中均有表达,且相对表达量存在显著差异(P<0.05,下同),相对表达量排序为叶>根>茎,表明HcGR基因具有明显的组织表达特异性.在红麻的根和叶中,HcGR基因相对表达量随NaCl胁迫浓度增加整体上呈先升高后降低的变化趋势,且均在T1处理下达峰值,显著高于CK、T2和T3处理.HcGR基因在茎中的相对表达量随NaCl胁迫浓度增加呈波动变化趋势,但T1、T2和T3处理均高于CK,其中T1和T3处理显著高于CK.[结论]HcGR基因在红麻根、茎和叶中的表达具有明显组织特异性,且可被不同浓度NaCl诱导响应盐胁迫信号,并通过上调各组织中的转录水平以提高抗盐胁迫能力,故推测该基因在红麻抗盐胁迫机制中发挥重要调控作用.     

掌叶大黄4个MYB转录因子的分子克隆及胁迫表达

旨在克隆获得 RpMYB2、 RpMYB3、 RpMYB5、 RpMYB6基因ORF,并对其理化特性、系统进化关系、不同组织表达、激素与非生物胁迫下的表达等展开分析。研究结果表明, RpMYB2、 RpMYB3、 RpMYB5、 RpMYB6依次编码333、275、293、291个氨基酸,分子质量分别为34.781、30.525、31.243、33.313 ku,4个RpMYBs蛋白均为亲水性蛋白并具有较高的热稳定性,除 RpMYB2外其余3个基因结构主要为 α-螺旋和无规则卷曲,且均定位于细胞核。由蛋白结构域和保守基序分析发现, RpMYB2、 RpMYB5含有1个HTH-MYB结构域, RpMYB3、 RpMYB6含有2个HTH-MYB结构域,且不同MYB转录因子包含的保守元件数量及种类存在差异,系统进化分析显示 RpMYB2、 RpMYB5属于R1-MYB亚家族, RpMYB3、 RpMYB6属于R2R3-MYB亚家族,与其结构域分类一致。实时荧光定量结果显示,根中 RpMYB2、 RpMYB6转录本丰度最高, RpMYB3、 RpMYB5基因分别在叶片、叶柄中高表达。经200 μmol·L^-1脱落酸 (abscisic acid, ABA)处理, RpMYB5于24 h达峰值;200 μmol·L^-1茉莉酸甲酯 (methyl jasmonate, MeJA)诱导 RpMYB6 表达,表达量随时间推移呈逐渐上升趋势且于24 h最高（为0 h的10.30倍）,抑制 RpMYB3表达;200 μmol·L^-1水杨酸 (salicylic acid, SA)诱导 RpMYB6表达最为明显,3 h表达量上调至 0 h的21.84 倍。 RpMYBs 在非生物胁迫处理下表达也各有差异, RpMYB2受高温胁迫诱导表达, RpMYB3在损伤、高温胁迫下表达下调, RpMYB5在损伤胁迫下表达受抑制, RpMYB6响应高温、盐胁迫。     

小菜蛾储存蛋白基因的克隆与表达分析

克隆和分析了2个小菜蛾的储存蛋白基因——Px AJSP-1和Px BJHSP-2.其中,Px AJSP-1属于芳基贮存蛋白,而Px BJHSP-2属于富甲硫氨酸储存蛋白.进化树分析表明,它们在同一目昆虫中相对保守.利用实时荧光定量PCR分析其表达模式,发现Px AJSP-1和Px BJHSP-2在4龄幼虫和蛹期高表达,且在脂肪体中的表达量远高于其他组织.     

棉花盐胁迫途径中蛋白磷酸化同源基因(GhSOS2)2种剪接体的克隆及表达分析

【目的】了解棉花在盐胁迫条件下相关基因的表达,并克隆与抗(耐)盐相关的重要基因。【方法】通过筛选棉花EST数据库,并对目标EST序列进行整合,对中棉所49在非盐胁迫和盐胁迫条件下进行处理并利用RT-PCR的方法克隆了质膜Na+/H+逆向转运蛋白途径中的1个蛋白磷酸化同源基因,命名为GhSOS2,并通过实时荧光定量PCR对其表达特征进行分析。【结果】序列分析表明,该基因成熟mRNA的剪接存在2种可选择性的剪接体,分别命名为GhSOS2a(GenBank登录号:GU188960)和GhSOS2b(GenBank登录号:GU188961),分别编码445和421个氨基酸残基。由于剪接方式的差异,导致GhSOS2a比GhSOS2b多出一个外显子(长度为72bp)。实时荧光定量PCR分析表明,GhSOS2a在非盐胁迫和盐胁迫条件下的根茎组织、叶组织均表达,但GhSOS2b仅在盐胁迫条件下的根茎组织、叶组织表达,且表达量远高于GhSOS2a。【结论】在棉花盐胁迫过程中,GhSOS2存在2种可选择性剪接体,而且可能主要是GhSOS2b参与棉花的质膜Na+/H+逆向转运蛋白途径并发挥一定作用。     

稀有鮈鲫芳香化酶基因的表达及内分泌干扰物（EDCs）暴露对其表达的影响

克隆稀有鮈鲫芳香化酶基因(cyp19a和cyp19b)片段,半定量方法检测其组织表达特异性,实时定量PCR检测2基因在孵化后18~50 d幼鱼的发育阶段表达情况,对成鱼进行3 d的乙炔基雌二醇(EE2,1 nmol/L)和壬基酚(NP,1μmol/L)药物暴露试验,实时定量PCR检测它们对2个基因表达的影响。结果显示,克隆获得759 bp的cyp19a和407 bp的cyp19b片段,cyp19a主要在卵巢中表达,cyp19b主要在脑中表达。在幼鱼发育阶段,cyp19a的表达没有显著差异,cyp19b在38 d后出现明显的下降;成体稀有鮈鲫cyp19a受到EE2极显著抑制(0.23倍,P<0.01),但NP抑制效果不显著(0.59倍),cyp19b在EE2和NP暴露后都有上调的趋势(1.83、1.02倍)。说明cyp19基因可以作为EDCs的作用靶分子,有助于对高等脊椎动物包括人类进行预测和风险评估。     

低温胁迫下外源激素对番茄SlMYB102转录因子表达量的影响

探讨在低温胁迫下,6种外源激素对番茄转录因子SlMYB102基因表达量的影响。对长至四叶一心的番茄幼苗进行外源激素喷施和低温处理,激素处理采用水杨酸(SA)、生长素(IAA)、赤霉素(GA3)、6-苄氨基嘌呤(6-BA)、脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)进行叶面喷施,以喷施去离子水作为对照。分别在4℃低温处理后的0、1、3、6、9、12、24 h取样,利用实时荧光定量PCR法检测番茄转录因子SlMYB102基因的表达情况。结果表明,在ABA、GA3、IAA、SA、6-BA、MeJA的诱导下,SlMYB102基因对6种激素均有响应,并呈上调表达模式。SlMYB102转录因子作为MYB家族中R2R3-MYB亚家族的一员,可能参与这些激素对于逆境胁迫的调控网络。     

低温胁迫下油棕WRKY转录因子基因的表达特性分析

[目的]研究低温胁迫下WRKY转录因子基因表达特性,并分析其与油棕抗寒性的相关性,为阐明WRKY转录因子在油棕生长和低温响应机制中的功能和作用提供理论参考.[方法]以油棕品种XJS30和SJ64为材料,对其进行低温驯化处理(0h、1d和7d)及冷处理(10℃4h、8℃4h、6℃4h、4℃4h和2℃4h),利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测不同处理时间的WRKY1、WRKY7、WRKY22、WRKY40和WRKY55基因表达特性,并分析其与油棕抗寒性的相关性.[结果]WRKY1和WRKY7基因在低温驯化结束时的表达量较冷处理结束时高,说明其在低温驯化过程中对XJS30的抗寒性构成发挥调控作用.WRKY22、WRKY40和WRKY55基因均在XJS30冷处理中表达量最高,说明其在冷处理过程中对XJS30的抗寒性发挥调控作用.WRKY1基因在低温驯化结束时的表达量较冷处理结束时低,说明其在冷处理过程中对SJ64的抗寒性发挥调控作用.WRKY7基因在低温驯化结束时的相对表达量较冷处理结束时高,说明其在低温驯化过程中对SJ64的抗寒性构成发挥调控作用.[结论]油棕的WRKY1、WRKY7、WRKY22、WRKY40和WRKY55基因均属于低温应激反应型基因.     

棉花盐胁迫途径中蛋白磷酸化同源基因(GhSOS2)2种剪接体的克隆及表达分析#br#

【目的】了解棉花在盐胁迫条件下相关基因的表达,并克隆与抗(耐)盐相关的重要基因。【方法】通过筛选棉花EST数据库,并对目标EST序列进行整合,对中棉所49在非盐胁迫和盐胁迫条件下进行处理并利用RT-PCR的方法克隆了质膜Na+／H+逆向转运蛋白途径中的1个蛋白磷酸化同源基因,命名为GhSOS,并通过实时荧光定量PCR对其表达特征进行分析。【结果】序列分析表明,该基因成熟mRNA的剪接存在2种可选择性的剪接体,分别命名为GhSOS2a(GenBank登录号：GU188960)和GhSOS2b(GenBank登录号：GU188961),分别编码445和421个氨基酸残基。由于剪接方式的差异,导致GhSOS2a比GhSOS2b多出一个外显子(长度为72 bp)。实时荧光定量PCR分析表明,GhSOS2a在非盐胁迫和盐胁迫条件下的根茎组织、叶组织均表达,但GhSOS2b仅在盐胁迫条件下的根茎组织、叶组织表达,且表达量远高于GhSOS2a。【结论】在棉花盐胁迫过程中,GhSOS2存在2种可选择性剪接体,而且可能主要是GhSOS2b参与棉花的质膜Na+／H+逆向转运蛋白途径并发挥一定作用。     

西洋菜锌铁转运蛋白NoZIP1 基因的 克隆及表达研究

对西洋菜锌铁转运蛋白基因NoZIP1进行克隆及表达分析,为研究其在西洋菜生长发育过程中的生物学功能奠定基础。利用RACE技术克隆西洋菜NoZIP1基因,用生物信息学方法分析获得的基因序列结构,利用实时荧光定量PCR研究NoZIP1基因在不同组织及不同培养条件下的表达特性。结果表明,西洋菜NoZIP1基因c DNA全长1 239 bp,包含完整的阅读框,编码356个氨基酸。实时荧光定量PCR分析显示,NoZIP1基因的表达在锌或者铁胁迫条件下根、叶中均有诱导上调趋势。     

绵羊 PGRMC1 蛋白的cDNA克隆、序列分析及组织表达

\t\t\t\t\t目的\t\t\t\t\t孕激素受体膜组分1 (PGRMC1)在动物繁殖活动中有重要调节作用,本研究旨在探讨牦牛PGRMC1基因的序列及其在生殖轴的组织表达特性。\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t方法\t\t\t\t\t试验采集5头牦牛和5头黄牛的下丘脑、脑垂体、卵巢、输卵管和子宫,以GenBank上已发布的普通牛PGRMC1基因序列设计引物,采用RT-PCR方法克隆牦牛和黄牛的PGRMC1基因,并使用相关的生物信息学软件对克隆所得序列进行分析;采用qRT-PCR法检测该基因在牦牛和黄牛不同组织中的表达情况。\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t结果\t\t\t\t\t结果得到牦牛和黄牛PGRMC1基因cDNA序列(GenBank登录号：MF803753 和MF803754),编码区(CDS)全长都为585 bp,编码 194 个氨基酸。其编码蛋白中含有1个 Cyt-b5 保守结构域。qRT-PCR结果表明：PGRMC1基因在牦牛和黄牛下丘脑、脑垂体、卵巢、输卵管和子宫都有表达,牦牛和黄牛的垂体中的PGRMC1的表达差异显著(P<0.05),但在其他组织品种间差异不显著;牦牛PGRMC1在卵巢和垂体的表达量显著高于其他组织(P<0.05)。\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t结论\t\t\t\t\t本研究提示PGRMC1基因可能在牦牛卵泡发育、发情、排卵等繁殖机能调控中发挥重要作用。\t\t\t\t\t\t\t\t\t     

应答非生物胁迫的甘蔗硫氧还蛋白基因 ScTRXh2 的克隆

从甘蔗蔗茎cDNA文库中获得1个TRXI类第3亚组成员的硫氧还蛋白家族基因全长cDNA序列,命名为＆TRXh2（登录号：KF921298）．该基因全长752bp,开放阅读框长381bp,5’非翻译区长57bp,3’非翻译区长314bp,编码126个氨基酸残基,氨基酸序列与拟南芥TRXs具有高度同源性．实时定量PCR检测显示。该基因在甘蔗中为组成型表达,叶片和蔗茎中的表达量显著高于根和芽．在H：02和PEG逆境胁迫下,甘蔗＆TRXh2基因的应答模式基本相同,呈现初期（3h）略微下调,早中期（6h或12h）表达量明显上调,中后期（24、48、72h）显著下调并维持基本稳定的低水平表达．甘蔗＆TRXh2基因对NaCl胁迫的应答较快,虽然也呈现中期（12h）表达量显著上调,后期（24、48、72h）显著下调并维持基本稳定的低水平表达,但表达模式与也02和PEG胁迫应答有明显不同,表现在胁迫初期（3h）基因表达显著下调．上述结果提示,甘蔗Sc—TRXh2基因积极应答非生物逆境H2O2、PEG和NaCl的胁迫,在应答的基因表达谱模式上存在一些差异．     

应答非生物胁迫的甘蔗硫氧还蛋白基因ScTRXh2的克隆

从甘蔗蔗茎cDNA文库中获得1个TRXⅠ类第3亚组成员的硫氧还蛋白家族基因全长cDNA序列,命名为ScTRXh2(登录号:KF921298).该基因全长752 bp,开放阅读框长381 bp,5'非翻译区长57 bp,3'非翻译区长314 bp,编码126个氨基酸残基,氨基酸序列与拟南芥TRXs具有高度同源性.实时定量PCR检测显示,该基因在甘蔗中为组成型表达,叶片和蔗茎中的表达量显著高于根和芽.在H2O2和PEG逆境胁迫下,甘蔗ScTRXh2基因的应答模式基本相同,呈现初期(3 h)略微下调,早中期(6 h或12 h)表达量明显上调,中后期(24、48、72 h)显著下调并维持基本稳定的低水平表达.甘蔗ScTRXh2基因对NaCl胁迫的应答较快,虽然也呈现中期(12 h)表达量显著上调,后期(24、48、72 h)显著下调并维持基本稳定的低水平表达,但表达模式与H2O2和PEG胁迫应答有明显不同,表现在胁迫初期(3 h)基因表达显著下调.上述结果提示,甘蔗ScTRXh2基因积极应答非生物逆境H2O2、PEG和NaCl的胁迫,在应答的基因表达谱模式上存在一些差异.     

小麦K2型脱水蛋白DHN14响应非生物胁迫的功能分析

【目的】研究脱水蛋白DHN14的功能及其在植物响应非生物胁迫中的潜在作用。【方法】从小麦品种"郑引1号"克隆获得脱水蛋白基因DHN14,对其进行生物信息学分析,利用实时定量PCR分析该基因在逆境胁迫下的表达水平,构建脱水蛋白DHN14基因的原核表达载体(重组菌pET28a-DHN14),经IPTG诱导表达后,在非生物胁迫下,研究该蛋白对大肠杆菌及乳酸脱氢酶(LDH)的保护作用。【结果】克隆获得脱水蛋白基因DHN14的CDS为339 bp,编码112个氨基酸,该蛋白含有2个保守的K片段,属于高亲水性无序蛋白,其分子质量为24 ku,等电点(pI)约为6.28;多序列比对分析表明,DHN14蛋白与WCOR726(Triticum aestivum)脱水蛋白的亲缘关系最近;实时定量RT-PCR结果表明,脱水蛋白基因DHN14受干旱、低温和ABA诱导表达;在20 mmol/L金属离子(Co~(2+)、Ni~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+))胁迫下,表达DHN14重组蛋白的大肠杆菌的活力明显高于对照,表明该蛋白在大肠杆菌中对金属离子胁迫具有保护作用;用1.0 mmol/L过氧化氢进行胁迫处理,重组菌DHN14存活率显著增高,说明脱水蛋白DHN14能够提高大肠杆菌对过氧化氢胁迫的耐受性;在低温和脱水胁迫下,DHN14脱水蛋白对乳酸脱氢酶的活性具有保护作用。【结论】小麦脱水蛋白DHN14能够响应非生物胁迫,提高对低温、干旱、金属离子、过氧化氢的耐受性。     

桔小实蝇丝氨酸蛋白酶基因（BdorSer）的克隆与表达分析

【目的】克隆桔小实蝇丝氨酸蛋白酶基因（Bactrocera dorsalis serine protease,BdorSer）,研究BdorSer在不同组织和不同发育时期的表达情况,探索其可能参与的生理过程。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆BdorSer,对其编码蛋白氨基酸序列信息和进化关系进行分析;采用实时荧光定量PCR（real-time PCR）方法,研究BdorSer mRNA在桔小实蝇不同组织及不同发育时期的相对表达量。【结果】克隆获得了BdorSer,该基因ORF全长1 239 bp。氨基酸序列一致性分析表明,BdorSer与拟暗果蝇（Drosophila pseudoobscura）丝氨酸蛋白酶（登录号XP_001352960）氨基酸序列的一致性最高,为65.8%。实时荧光定量PCR分析表明,BdorSer mRNA在桔小实蝇雌雄虫的不同组织中都有表达,且在触角中的表达量最高,分别是雌虫胸部的43.6和26.8倍。BdorSer mRNA在生殖节中表现出较大的性别差异表达特征,雄虫生殖节中的mRNA表达量是雌虫的18.25倍。BdorSer mRNA几乎在昆虫发育的各个时期都有表达,其中在卵及1,2,3龄幼虫中的表达量分别是10 d 蛹的 0.68,1.63,4.31和15.8倍。BdorSer mRNA随蛹的发育其表达量逐渐减低,1,4,7 d蛹中的表达量分别是10 d蛹的325,125和41倍。【结论】克隆获得了BdorSer,其表达的BdorSer蛋白可能在雄虫的生殖生理中发挥了作用,同时也可能参与了桔小实蝇的变态发育过程,尤其是1 d蛹的发育过程。     

水稻核糖体蛋白（OsRPL14）基因的克隆及表达分析

通过荧光差异显示（fluorescent differential display,FDD）以及RT-PCR技术,得到一个水稻核糖体蛋白基因。该基因的cDNA全长为565bp,编码一个具有134个氨基酸残基的多肽,推测分子量是15.4kD。与其他植物中核糖体蛋白L14的相似性为82.84%～88.06%,命名该基因为OsRPL14。在低温（8℃）及干旱条件处理下,该基因表达量在根和茎中都有比较明显的增加趋势。推测该基因在逆境反应中起着重要作用。