山羊口疮病毒的PCR诊断及防治

利用半套式PCR对四川省攀枝花市某羊场疑似羊口疮病毒感染的6份山羊口腔痂皮病料进行了分子诊断。结果表明:采集的6个样品均检测到羊口疮病毒片段,确定该羊场有口疮病毒感染。采用综合防治方法进行防治,该羊场口疮病毒的发病率和死亡率大大降低,取得了很好的防治效果。     

羊口疮病毒的分离与鉴定

本试验利用犊牛睾丸细胞、羔羊睾丸细胞、MDBK、BHK-21细胞对采自内蒙古赤峰的疑似羊口疮发病羊群的唇部痂皮组织进行接种传代,分离出1株病毒,通过透射电镜负染观察和PCR检测对该分离株进行鉴定。参照GenBank中羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)ORF059 (F1L)基因的核苷酸序列,设计并合成1对特异性引物,成功地对分离株的F1L基因进行克隆、测序,并与多株参考毒株进行了同源性比对分析,结果显示经透射电镜负染观察到典型的副痘病毒粒子,与参考毒株序列相比均具有较高的同源性,均为96%以上,结果表明该分离株为ORFV,命名为OV/nm-hd。     

湖北省羊口疮病毒的分离鉴定

利用MDBK传代细胞系对湖北通山县某羊场疑似羊口疮(Orf)的黑山羊病料进行分离,通过病毒理化特性试验、动物回归试验和PCR等方法对分离的毒株进行鉴定。结果表明,病料悬液接种MDBK细胞后出现细胞病变,接种病料的羊只出现典型的Orf症状,扩增出羊口疮病毒(Orf virus)B2L基因,该毒株与台湾山羊株(EU935106.1、DQ904351.1)相似性最高(均为99%),亲缘关系最近。本研究成功分离鉴定到一株ORFV,命名为ORFV/HB/09。     

羊口疮病毒威海株的分离鉴定

利用犊牛睾丸原代细胞对山东省威海市某奶山羊养殖场疑似羊口疮（Orf）山羊病料进行病毒分离,通过细胞病变观察、病毒滴度和聚合酶链反应（PCR）等方法对分离毒株进行鉴定。结果表明,研磨处理的病毒液接种于犊牛睾丸原代细胞后盲传至第5代出现病变,测得第6代分离株病毒滴度为106．5 TCID50／mL。扩增羊口疮病毒特异性 B2L 基因,发现该毒株与34个羊口疮毒株核苷酸序列同源性高达99％,包括福建株（KC588399．1、KC568398．1）。本研究成功分离鉴定了羊口疮病毒山东威海株。     

重庆地区羊口疮病毒的分离鉴定及F1L基因的原核表达

本试验旨在对重庆地区羊口疮病毒(ORFV)进行分离培养及鉴定,并研究其F1L基因序列在大肠杆菌中的表达情况.利用MDBK细胞对疑似ORFV感染的羔羊痂皮中的病毒进行分离培养;对F1L基因序列进行PCR扩增,引入限制性内切酶NotⅠ和EcoRⅠ,构建重组质粒pET-32a-F1L,转化至大肠杆菌BL21菌株后,对阳性菌株进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE检测和Western blotting鉴定.结果表明,所获得的毒株为ORFV,其F1L基因在大肠杆菌中的表达产物大小约为57.4 ku,主要以包涵体形式存在,5 h为最佳诱导表达时间,并具有良好的反应原性.     

羊口疮病毒大足株的分离鉴定

本研究旨在了解重庆地区羊口疮病毒(orf virus,ORFV)流行情况。从重庆大足等地区羊场采集18份临床疑似羊口疮病料,提取病料DNA,经PCR鉴定为ORFV阳性;将阳性病料做常规处理,接种羔羊睾丸细胞(LT),并盲传至5代,观察接毒LT细胞病变,将F5代细胞培养物进行间接免疫荧光试验(IFA)、PCR扩增、测序、同源性比对、遗传进化分析和TCID_(50)测定。结果显示,经PCR检测,18份疑似羊口疮病料ORFV核酸阳性率为61.1%(11/18);大足株病料接种LT细胞36 h后,长梭型细胞变圆、融合、呈拉网状、皱缩,72 h后大部分细胞脱落;间接免疫荧光试验在显微镜下观察到细胞浆中出现特异性绿色荧光,且荧光绕核分布;F1至F5代细胞培养物经PCR扩增出特异性目的条带,大小为1 137 bp;将测序结果与GenBank中19株ORFV B2L基因进行同源性比对,其核苷酸同源性在97.9%～100%之间,与美国SA00分离株同源性达100%,且遗传进化分析显示处于同一进化分支,亲缘关系较近;测定F5代细胞培养物TCID_(50)值为10~(-5.68)/0.1 mL,在细胞中能稳定增殖。综上所述,本研究成功分离并获得1株ORFV,为后续ORFV研究提供了生物材料,同时为防控重庆地区的羊口疮奠定基础。     

羊口疮病毒大足株的分离鉴定

本研究旨在了解重庆地区羊口疮病毒（orf virus，ORFV）流行情况。从重庆大足等地区羊场采集18份临床疑似羊口疮病料，提取病料DNA，经PCR鉴定为ORFV阳性；将阳性病料做常规处理，接种羔羊睾丸细胞（LT），并盲传至5代，观察接毒LT细胞病变，将F5代细胞培养物进行间接免疫荧光试验（IFA）、PCR扩增、测序、同源性比对、遗传进化分析和TCID₅₀测定。结果显示，经PCR检测，18份疑似羊口疮病料ORFV核酸阳性率为61.1%（11/18）；大足株病料接种LT细胞36 h后，长梭型细胞变圆、融合、呈拉网状、皱缩，72 h后大部分细胞脱落；间接免疫荧光试验在显微镜下观察到细胞浆中出现特异性绿色荧光，且荧光绕核分布；F1至F5代细胞培养物经PCR扩增出特异性目的条带，大小为1 137 bp；将测序结果与GenBank中19株ORFV B2L基因进行同源性比对，其核苷酸同源性在97.9%~100%之间，与美国SA00分离株同源性达100%，且遗传进化分析显示处于同一进化分支，亲缘关系较近；测定F5代细胞培养物TCID₅₀值为10^-5.68/0.1 mL，在细胞中能稳定增殖。综上所述，本研究成功分离并获得1株ORFV，为后续ORFV研究提供了生物材料，同时为防控重庆地区的羊口疮奠定基础。     

青海省刚察县羊口疮病毒的分离与鉴定

利用MDBK细胞从青海省刚察县某藏羊养殖小区发病羊唇部痂皮中分离获得一株病毒,通过临床症状、PCR检测以及组织病理学观察等方法对该株病毒进行了鉴定,证实分离株为羊传染性脓疱病毒(Orf Virus,ORFV),命名为ORFV-QHGC01。参照Gen Bank中ORFV F1L基因的核苷酸序列,设计合成一对特异性引物,对ORFV-QHGC01株F1L基因进行了克隆、测序,并推导出其氨基酸序列。序列分析表明,分离株F1L基因片段长987bp,编码328个氨基酸,与Genbank中AF097215、AY040081、AY040082、AY040083、AY040084、AY040085、FJ808075、HQ221964、JQ271535株的核苷酸序列同源性分别为:96.7%,95.6%,96.1%,96.2%,97.5%,97.2%,96.5%,95.3%,98.3%。系统发育进化树结果表明,ORFV-QHMH01分离株与参考毒株JQ271535的亲缘关系较近,这表明不同地区分离株的F1L基因具有较好的保守性。     

羊口疮病毒云南流行毒株的分子鉴定

2010年底至2011年初,云南省普洱市放牧山羊发生以口唇、眼、鼻、乳房、肛门、外阴部出现丘疹、水疱,继而形成脓疱、痂皮及痂垢为特征的传染病,经PCR、SYBR Green I及TaqMan real-time PCR检测,结果PCR扩增出1225bp预期大小的片段,SYBR GreenI及TaqMan real-timePCR均扩增出标准的S形曲线,并根据绝对定量标准曲线,计算出送检组织样品抽提DNA中羊口疮病毒含量为1.83241×107copies/μl,同时将PCR产物进行测序,所得序列与NCBI GenBank中羊口疮病毒基因组(AY386264)ORFVgORF010基因的DNA序列符合率达99%(967/981bp),最终确诊引起此次山羊疫病流行的病原为羊口疮病毒。     

羊口疮病毒黑龙江省分离株的分离鉴定

为确定黑龙江大庆地区某羊场发生的疑似羊口疮(Orf)的病原,本研究采用MDBK细胞培养途径从病羊的口唇部位的痂皮病料中分离出1株病毒.通过电镜观察和IFA鉴定证明该分离株为Orf病毒,命名为OV/HLJ/04.其F1L基因核苷酸序列测定和进化分析显示,OV/HLJ/04与国内报道的山西株(HQ221964)的遗传关系密切,同源性达到98.2％.将该病毒分离株进行回归本动物试验,接种羔羊发生严重的羊口疮.     

杨凌某羊场羊口疮病毒的分离鉴定

为获得杨凌地区羊口疮病毒野毒株,在某羊场采集具有典型羊口疮症状的病羊口唇部结痂并研磨,无菌过滤后取500μL接种于犊牛睾丸原代细胞。盲传4代,测定细胞病变的第5代病毒的滴度,用羊口疮病毒B2L和F1L基因的特异性引物进行PCR检测。结果显示,第5代病毒能够致犊牛睾丸原代细胞出现细胞病变(CPE),病毒滴度为107.66 TCID50/mL;扩增出了羊口疮病毒B2L和F1L基因的片段,其大小分别为540bp和437bp,与用于设计引物的参考毒株序列的相似度分别为96.57%和96.43%,可确定为羊口疮病毒的相应基因片段,获得了羊口疮病毒分离株。     

羊口疮病毒的研究进展

羊口疮(orf)病毒又称传染性脓疮(ecthyma contagiosum)病毒,属于痘病毒科副痘病毒属,能引起反刍动物和人发病,在我国西部地区流行比较广泛,是家畜疫病防控中重要的一种病原。     

羊口疮病毒的研究进展

羊口疮（orf）病毒又称传染性脓疮（ecthyma contagiosum）病毒．属于痘病毒科副痘病毒属．能引起反刍动物和人发病．在我国西部地区流行比较广泛．是家畜疫病防控中重要的一种病原。     

羊口疮病毒青海株的分子鉴定及其遗传进化分析

青海祁连地区某规模化养殖场羊群疑似感染羊口疮,为准确鉴定此地羊口疮病原并对流行毒株进行遗传变异研究,采集疑似羊口疮病毒感染的羊唇部结痂组织并进行PCR鉴定,对鉴定的3株ORFV毒株的抗原基因B2L和F1L及毒力基因VIR和GIF分别进行克隆、测序及遗传进化分析。从病料中鉴定出3株ORFV,并分别命名为ORFV1/Ovis/QL/Qinghai/2021/China、ORFV2/Ovis/QL/Qinghai/2021/China和ORFV3/Ovis/QL/Qinghai/2021/China。经分析显示,ORFV1、ORFV2和ORFV3的B2L、F1L、VIR和GIF与数据库中ORFV参考株的相应的基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为99.21%～97.27%和99.74%～97.35%、99.12%～95.41%和99.12%～92.69%、98.19%～95.29%和96.72%～91.26%、99.62%～95.21%和100.00%～93.96%。基于ORFV的4个基因遗传进化树分析表明,中国青海祁连ORFV毒株分别聚在中国株的进化分支上(B2L基因),印度毒株和中国毒株...     

陕西榆林某羊场羊口疮病毒的分离鉴定

为获得陕西榆林地区羊口疮病毒野毒株,以榆林地区某羊场疑似羊口疮(Orf)的山羊口唇部结痂为材料,将结痂研磨悬液接种于犊牛睾丸原代细胞进行传代培养,通过特征性细胞病变(CPE)观察、PCR检测、动物回归试验等对分离的毒株进行鉴定。结果表明,经研磨的病料悬液接种于犊牛睾丸原代细胞后,盲传至第4代时产生细胞病变,测得病毒滴度为10~(7.66) TCID_(50)/mL。对分离毒株的B2L基因克隆测序、同源性对比分析结果显示,该毒株与与国内报道的多株羊口疮毒株核苷酸序列均具有较高的同源性,其中与甘肃株(KC485343.1)福建株(KC568399.1)的同源性均达到99%。用纯化病毒液划痕接种2月龄羔羊后,在其唇部和腹股沟内侧出现丘疹和脓疱等ORFV感染的典型的羊口疮症状。表明成功获得了羊口疮病毒陕西榆林株。     

羊口疮病毒内蒙古株的分离与初步鉴定

[目的] 确定内蒙古地区规模化养殖场发生的疑似羊口疮的病原。[方法] 无菌采集疑似羊口疮病料7份,经剪碎、研磨、离心等处理后接种山羊皮肤成纤维细胞（goat skin fibroblasts,GSFs）培养;对分离到的病毒毒株进行电镜观察;利用B2L基因引物进行特异性PCR鉴定,对获得的B2L基因序列测序,构建系统发育树,并进行同源性分析。[结果] 3份病料经GSFs培养48 h后出现明显病变,分离的病毒经负染后在电镜下观察呈卵圆形,病毒粒子长220~250 nm,宽125~200 nm,符合羊口疮病毒（orf virus,ORFV）粒子的形态特征,并将其命名为NM-ORFV-1株、NM-ORFV-2株、NM-ORFV-3株。分离株经B2L基因PCR鉴定获得1 137 bp的扩增产物,与预期一致;系统发育树及同源性分析显示,NM-ORFV-2株与NM-ORFV-3株遗传关系密切,处于同一分支,且与ORFV KP336704（中国）分离株的亲缘关系最近,同源性达到99.4%;NM-ORFV-1株与NM-ORFV-2株及NM-ORFV-3株处于不同分支,NM-ORFV-1株与NM-ORFV-2株的同源性为99.1%,与NM-ORFV-3株的同源性为99.0%,且与ORFV JQ904789（中国）疫苗株亲缘关系最近,同源性为99.6%。[结论] 内蒙古地区规模化养殖场疑似羊口疮病例的病原是ORFV。     

安徽地区羊口疮病毒VIR基因PCR检测及遗传进化分析

采集安徽某地区两个山羊场中疑似感染ORFV的羔羊唇部结痂病料,采用PCR方法对毒力基因VIR进行了扩增,并获得了目的片段VIR-1和VIR-2。同时将PCR产物克隆至p MD18-T载体,鉴定后测序。序列分析结果表明,两个羊场的毒力基因VIR-1和VIR-2基因片段与参考毒株的相关基因核苷酸同源性分别为95.8%~100%和95.4%~99.6%。基因进化树比较显示,两分离株分别与美国AY424975.1株和甘肃KF916586.1株的亲缘关系最近。     

羊痘病毒和羊口疮病毒二重PCR鉴别检测方法的建立

针对羊痘病毒（capripoxvirus，CaPV）的A29L基因和羊口疮病毒（orf virus，ORFV）的H3L基因，设计、合成了2对特异性引物以进行二重PCR。结果表明，该方法可以在数小时、在同一反应体系中清晰地区分CaPV和）ORFV，其PCR产物大小分别为413bp和708bp，与预期的片段大小相符，序列分析证实目的基因序列与已发表的序列一致；该检测方法的灵敏度可达1个病毒蚀斑形成单位（PFU）。采用二重PCR对12株CaPV、ORFV和相关病毒、细菌培养物，以及22份田间样品进行检测，与预期结果完全一致，且与相关病毒或健康羊组织样品无交叉反应。结果表明，该方法具有快速、敏感、特异等优点，可作为临床样品中CaPV和ORFV的鉴定和诊断的有效方法。