中国林蛙抗菌肽基因在毕赤酵母中的表达及其活性检测

将中国林蛙皮肤抗菌肽基因(RC)克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,使之准确融合于а交配因子分泌信号,然后通过电击转化毕赤酵母宿主菌GS115/His-,构建pPIC9K/RC。将筛选出的高效表达的重组转化子用甲醇作诱导剂进行小瓶发酵,28～30℃诱导后,经Tricine SDS-PAGE检测,表达产物在а信号因子引导下分泌到培养基中。分泌到培养基中的表达产物能够抑杀细菌和抑制肿瘤细胞生长。对酵母重组子用酵母染色体DNA的通用引物和目的片段的引物进行PCR扩增。结果表明,中国林蛙皮肤抗菌肽基因能以单拷贝整合到毕赤酵母染色体基因组中并形成转录产物。     

东北林蛙皮肤抗菌肽基因在毕赤酵母中表达条件的优化

目的:确定毕赤酵母表达东北林蛙皮肤抗菌肽dybowskin-1ST基因的最佳诱导表达条件。方法:本研究将PCR合成的dybowskin-1ST基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建pPIC9K-dybowskin-1ST诱导型表达载体。表达载体经线性化后转化巴斯德毕赤酵母GS115,应用BMMY培养基诱导表达。采用单一变量法及正交试验法,对甲醇诱导的浓度、时间和温度进行了优化,通过SDS-PAGE电泳分析和体外抑菌试验检测目的肽表达丰度。结果:最佳诱导条件:甲醇终浓度为0.5%、诱导时间为72 h、诱导温度为28℃,在此条件下表达产物SDS-PAGE电泳条带灰度值为117,抑菌环直径为28.16mm,可为规模化的抗菌肽表达提供参考数据。     

抗菌肽Cecropin D基因在毕赤酵母中的表达与抗菌活性分析

为使抗菌肽Cecropin D在巴斯德毕赤酵母中高效表达,本研究根据Cecropin D全基因序列和毕赤酵母的偏嗜性设计合成4条寡聚西核苷酸,SOEing-PCR技术法合成Cecropin D基因序列,并克隆至酵母表达载体pGAPZαA中,构建重组表达质粒,将其线性化后电击转化毕赤酵母菌株SMD1168,经高浓度博莱霉素筛选,获得高拷贝转化子,菌液PCR鉴定表明Cecropin D基因已整合到酵母基因组中.在GAP强启动子调控下,重组Cecropin D高效分泌表达,产物耐高温耐酸碱,并对部分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑菌效果,对E.coliDH5 α和S.aureus Cowan I株的MIC值分别为2.17 μg/mL和4.55 μg/mL.     

杂合抗菌肽Mel-MytB在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性测定

为了获得抗菌活性较强的抗菌肽,将蜂毒肽（Melittin）与贻贝素B （Mytilin-B）的核心功能序列杂合,以Melittin （3-14）和Mytilin-B （13-27）的成熟肽段作为模板序列,根据巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）偏好密码子,采用SOE方法合成杂合抗菌肽Mel-MytB（MEM）基因。改造后的基因克隆到pPICZα-A质粒,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-MEM,而后经Sac Ⅰ酶切线性化后电转入毕赤酵母受体菌X-33。结果表明,在醇氧化酶（AOX）启动子调控下,分子质量约3.0 ku的Mel-MytB杂合抗菌肽获得表达,具有热稳定性和酸稳定性,煮沸40 min、pH 2.0~10.0范围内抑菌活性基本不变。抗菌特性研究结果表明,该表达产物具有广谱抗菌活性,其对大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923/ATCC6538、肠道沙门氏菌ATCC13076、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、副溶血弧菌ATCC17802、创伤弧菌ATCC27562、枯草芽孢杆菌ATCC6633的MIC值分别为5.1、2.2、2.0、4.6、7.6、9.4、13.2和59.4 μg/mL。因此,重组抗菌肽Mel-MytB在疾病防治和动物饲料添加剂等方面具备较好的应用前景。     

重组猪蛔虫抗菌肽cecropin P1在毕赤酵母中的表达及抑菌活性

根据已发表的蛔虫抗菌肽cecropin P1基因编码序列设计引物,采用RT-PCR方法从猪肠道蛔虫中扩增出cecropin P1基因,并将其插入到酵母分泌型表达载体pPIC9K中α-因子信号肽下游的SnaBⅠ和NotⅠ位点之间,构建成cecropin P1基因的酵母分泌型表达载体pPIC9K/cecropin P1。载体经SalⅠ酶切线性化,电转化到组氨酸缺陷型的酵母宿主菌GS115中,然后利用以葡萄糖为碳源的培养基（MD）和以甲醇为碳源的培养基（MM）筛选出组氨酸His＋型和甲醇利用正型（Mut＋）酵母重组体,再经G418加压筛选得到高拷贝cecropin P1基因的重组酵母。经PCR检测证明cecropin P1基因已整合到毕赤酵母的染色体中。重组酵母经摇瓶发酵培养和甲醇诱导,通过Tricine-SDS-PAGE检测,重组酵母能够分泌表达重组cecropin P1,同时表达的cecropin P1对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑菌活性。     

环状抗菌肽cyclopsychotride在毕赤酵母X-33中的表达及其活性鉴定

为提高重组外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达,试验采用毕赤酵母(Pichia pastoris)偏嗜性密码子改变抗菌肽cyclopsychotride的碱基序列,通过SOEing法合成后连接到pPICZα-C质粒上,从而获得分泌型重组酵母表达载体pPICZα-C-cyclopsychotride,再通过限制性内切酶BlnⅠ线性化,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞X-33中。结果表明:经PCR检测后及Zeocin抗性筛选,获得高拷贝转化子;通过琼脂孔穴扩散法检测,酵母表达上清液对革兰阳性菌和革兰阴性菌有抑菌活性;抗菌肽cy-clopsychotride经沸水、酸碱及胃蛋白酶处理后仍具有抗菌活性。     

果蝇抗菌肽的合成及在毕赤酵母中的表达

抗菌肽(Antibacterial peptides , ABP)是一类具有广谱抗菌活性的小分子短肽,研究较多的是来源于果蝇(Drosophila melanogaster)的抗菌肽,其中Cecropins是抗菌谱较广、活性较强的一种.     

新型欧洲鳗鲡抗菌肽elecilin在毕赤酵母中的表达

前期采用差减杂交的方法筛选到新型欧洲鳗鲡抗菌肽elecilin,其基因全长为477 bp,编码159个氨基酸,理论分子量约17.4 kDa。为了获得具活性的大量表达的抗菌肽,本研究利用毕赤酵母表达了elecilin。首先将elecilin基因克隆至酵母分泌表达载体pPICZaA,构建了重组分泌表达质粒pPICZaA-elecilin,电击转化毕赤酵母X-33。经Zeocin筛选和PCR鉴定,获得重组酵母菌,通过甲醇诱导,SDS-PAGE和Western blot鉴定,证实诱导后的培养基中存在与预期分子量大小相一致的蛋白,能被His-tag单克隆抗体识别,表明利用酵母成功表达了欧洲鳗鲡抗菌肽elecilin。这为进一步研究该抗菌肽的功能及作为饲料添加剂的应用奠定了基础。     

环状抗菌肽cyclopsychotride在毕赤酵母X -33中的表达及其活性鉴定

为提高重组外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达,试验采用毕赤酵母(Pichia pastoris)偏嗜性密码子改变抗菌肽cyclopsychotride的碱基序列,通过SOEing法合成后连接到pPICZα -C质粒上,从而获得分泌型重组酵母表达载体pPICZα -C- cyclopsychotride,再通过限制性内切酶B...     

抗菌肽Cecropin AD在毕赤酵母中的组成型表达及中试发酵研究

构建表达抗菌肽Cecropin AD蛋白的真核重组表达质粒pGAPZα-A-CAD,并转化酵母菌Pichia pastoris X-33,Zeocin抗性筛选阳性重组子,通过PCR鉴定、Tricine-SDS-PAGE分析和琼脂孔穴扩散法筛选获得抗菌肽CAD组成型表达菌株,并采用pH-溶氧监控策略进行工程菌Pichia pastoris X-33/pGAPZα-A-CAD的50 L中试发酵研究。结果表明,本实验成功实现了抗菌肽CAD在毕赤酵母Pichiapastoris X-33中的组成型表达pGAPZα-A,Tricine-SDS-PAGE分析显示在4.0 kDa处有明显的目的条带,工程菌经50 L发酵罐培养48 h后收获的上清液,100℃热处理10 min后,对金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠杆菌ATCC25922等均有明显的抑杀作用。抗菌肽的组成型表达方法在本研究中得到了成功应用,中试研究为以后的规模化生产和应用奠定了基础。     

抗菌肽Eumenitin序列修饰后的毕赤酵母重组表达载体构建

为了构建高效低毒的新型抗菌肽,将抗菌肽Eumenitin及其序列修饰后获得4条新型短肽的毕赤酵母真核表达载体,采用生物信息学方法对Eumenitin及其衍生肽的理化参数进行预测,基因序列经毕赤酵母密码子优化后,克隆至pMD19T-simple载体上,鉴定后连接至毕赤酵母表达载体pGAPZαA上,构建的重组表达质粒经Avr Ⅱ线性化后,电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中,涂布于YPDSZ平板上,进行表型筛选和高拷子筛选,并对5条短肽的溶血率进行测定。结果显示:Eumenitin及其衍生肽均为较稳定的疏水性多肽,空间结构以α螺旋为主,且序列中不含有信号肽。经PCR、双酶切鉴定和核苷酸序列测定,成功构建了5条短肽的毕赤酵母重组表达载体,经设计改造后的抗菌肽溶血性均较低。本研究结果为后续进行重组蛋白的表达以及抑菌活性研究奠定了基础,以期获得抗菌活性强、溶血性低、高表达的新型抗菌肽。     

鸡生长激素在毕赤酵母中的表达、纯化和活性鉴定

生长激素（growth hormone,GH）与受体结合调节靶细胞的功能在机体的生长发育及代谢过程中起着极其重要的作用。为获得高纯度具有生物学活性的鸡生长激素（chicken growth hormone,cGH）,试验将C端融合了6个组氨酸的cGH成熟片段基因序列克隆入毕赤酵母表达载体pPIC9K中,使用电转法将重组质粒导入毕赤酵母GS115,以1%的甲醇诱导重组菌（GS115-pPIC9K-cGH）96 h,表达大小约为25 ku的目的蛋白cGH,经Ni离子亲和层析和聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶层析获得95%以上的cGH重组蛋白。实时荧光定量检测结果表明,纯化的cGH重组蛋白可刺激鸡肝癌细胞LMH内的胰岛素样生长因子Ⅰ（insulin-like growth factor Ⅰ,IGF-Ⅰ）基因的mRNA表达上调,表明所发酵纯化的重组蛋白cGH具有生物学活性,这为其结构和功能的研究及生产应用奠定了基础。     

猪β-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其活性

为了高效表达分泌型的猪β-干扰素,将去除信号肽的编码梅山猪β-干扰素成熟多肽基因(mPoIFNβ)插入酵母-大肠杆菌穿梭载体pPIC9K,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFNβ。将以SalⅠ线性化的pPIC9K-mPoIFNβ用化学方法(LiCl),与鲑鱼精DNA(ssDNA)共转化入毕赤酵母菌株GS115,转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后获得阳性菌株,再经高浓度G418筛选到多拷贝菌株。以1%甲醇连续诱导4 d,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明:表达产物为22 ku和26 ku的混合物,在GS115中的表达量约为80 mg/L,占分泌型总蛋白的29.4%~30.8%,表明猪β-干扰素基因在毕赤酵母中获得了高效分泌表达。对表达产物进行理化分析发现,重组酵母菌表达的蛋白耐酸(pH2),对热(56℃)部分敏感,并能被特异性的抗猪β-干扰素抗体中和而不与抗猪γ-干扰素抗体反应。以细胞病变抑制法(CPE50)测定干扰素抗病毒活性,在MDBK(牛肾细胞系)中表达的猪β-干扰素的抗VSV比活性达到2.0×106U/mg;对口蹄疫病毒在IBRS-2细胞中的增殖也有明显的抑制作用。     

重组猪β防御素2在毕赤酵母中的表达及其鉴定

根据GenBank猪β防御素2(pBD-2)的氨基酸序列,参照酵母偏爱的密码子,设计无信号肽序列的pBD-2的基因编码序列,并由公司合成.将合成的基因通过SnaB Ⅰ和Not Ⅰ位点插入到酵母表达载体pPIC9K的α因子信号肽序列下游,构建成pBD-2基因的分泌表达载体pPIC9K/pBD-2.利用电穿孔法将经Sal Ⅰ线性化的pPIC9K/pBD-2质粒导入毕赤酵母GS115中,通过G418加压筛选得到His+Mut+表型的高拷贝转化子.经PCR检测证明pBD-2基因在毕赤酵母染色体上得到整合.阳性重组酵母经摇瓶发酵培养和甲醇诱导,用SDS-PAGE方法在发酵上清中检测到重组pBD-2的存在,说明构建重组酵母菌能够分泌性表达pBD-2.琼脂孔穴扩散法检测结果显示,pBD-2对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性.     

牛乳溶菌酶在毕赤酵母中的分泌表达及活性分析

为真核表达牛乳溶菌酶,本研究在通过酵母偏爱密码子改造并人工合成LYZ1基因的基础上,将LYZ1基因经克隆构建了高效表达具有生物活性牛乳溶菌酶的分泌型表达载体pPICZα-A-LYZ1,将其经SacⅠ酶切线性化后电转化毕赤酵母菌株GS115中,通过Zeocin筛选和PCR鉴定后的阳性重组菌用甲醇诱导60h后,进行SDS-PAGE和western blot鉴定,用溶壁微球菌对其进行活性检测,并对其进行体外抑菌效果检测分析。结果表明:分泌表达的重组目的蛋白约16ku,而且抗血清具有良好的反应原性。活性检测表明,培养液中重组溶菌酶活性达到2842u/mL。体外抑菌试验结果表明,重组牛乳溶菌酶对标准葡萄球菌及大肠杆菌菌株具有较好的抗菌作用,而对无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌作用较弱。     

猪源抗菌肽PBD-1在毕赤酵母中的表达及鉴定

本试验旨在实现猪β防御素1 (poricine-β-defensin 1,PBD-1)在毕赤酵母中的表达,获得有抗菌活性的抗菌肽PBD-1。根据PBD-1的氨基酸序列和酵母密码子偏好性,设计优化其核苷酸序列,利用SOE-PCR技术获得PBD-1基因序列,克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建重组质粒pPIC9K-PBD-1,经SacⅠ线性化后转入毕赤酵母SMD1168中。PCR筛选得到阳性酵母表达菌株,经甲醇诱导后得到分子质量约4.5 ku的抗菌肽PBD-1。抗菌特性研究结果表明,表达产物抗菌肽PBD-1对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌均有较好的抑制效果。     

蝉新型抗菌肽Cryptonin在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定

根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子的偏嗜性,通过SOEing法合成改造后的Cryptonin基因片段。基因克隆到pPICZα-C质粒中,获得分泌型重组酵母表达载体pPICZα-C-Cryptonin。pPICZα-C-Cryptonin通过限制性内切酶SacⅠ酶切线性化后,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞X-33内。PCR检测Cryptonin基因与毕赤酵母染色体稳定结合,Zeocin抗性筛选,得到高拷贝转化子。在AOX(醇氧化酶)启动子调控下,Cryptonin蛋白获得分泌表达,其相对分子质量约为2700。表达产物耐热性强,在100℃条件下10min内抗菌活性不变,煮沸30min以上仍具有活性。琼脂糖孔穴扩散法检测显示表达产物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有很好的抑菌活性。     

禽传染性支气管炎病毒M基因在毕赤酵母中表达与蛋白反应活性检测

将禽传染性支气管炎病毒(IBV)M基因克隆到毕赤巴斯德表达载体pPIC9K中,构建了重组表达载体pPIC9K-M,电击转化毕赤巴斯德酵母GS115,经MD和MM平板筛选和PCR鉴定后,采用G418抗性梯度筛选得到高拷贝重组菌株GS115/pPIC9K-M His~+Mut~+,重组菌株用1%的甲醇诱导分泌表达,并对表达产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析.结果表明,IBV M基因在毕赤酵母中成功获得了表达,表达蛋白的相对分子质量约为33 000,能与IBV阳性血清特异性结合.将表达蛋白初步纯化后作为包被抗原,ELISA检测结果显示表达蛋白与特异性抗体反应良好,表明表达的M蛋白生物学活性良好.本研究表达的IBV M蛋白可作为制备IB诊断抗原的基础材料,对IB的防治有重要理论和实用价值.     

人组织蛋白酶K在毕赤酵母中的表达、纯化及活性测定

在动物和人的骨代谢疾病中,组织蛋白酶K是木瓜蛋白酶家族中的一种半胱氨酸蛋白酶,是负责骨吸收过程中溶骨的主要关键酶,是新药物的分子作用靶点。通过毕赤酵母表达系统表达出重组组织蛋白酶K,进一步用离子交换和分子筛系统进行纯化得到高纯度有活性的重组组织蛋白酶K。运用FluStar荧光酶标仪测定390 nm(激发光)和460 nm(发射光)波长下荧光强度的变化并计算出组织蛋白酶K的酶活力为119.6 U,为进一步筛选骨质疏松等骨代谢疾病的新药提供参考。     

抗菌肽LL-37在毕赤酵母SMD1168中的高效表达及活性鉴定

为获得高效表达的抗菌肽LL-37,根据人源抗菌肽LL-37的氨基酸序列,选择毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子的偏嗜性,通过SOEing法改造合成LL-37基因片段,克隆到pGAPZαA质粒中,获得分泌型重组酵母表达载体pGAPZαA-LL-37。pGAPZαA-LL-37通过限制性内切酶AvrII酶切线性化后,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞SMD1168。经Zeocin抗性筛选,得到高拷贝转化子,PCR检测表明LL-37基因与毕赤酵母染色体稳定结合。在GAP启动子调控下,LL-37蛋白获得分泌表达,其上清表达量约为237mg/L。表达产物耐热性强,在100℃条件下30min内仍保持一定的抗菌活性。表达产物对大肠杆菌DH5α、大肠杆菌D31和猪链球菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为1.56μg/mL、3.12μg/mL和6.25μg/mL。