中国林蛙皮肤抗菌肽基因的cDNA克隆

抗菌蛋白蛙皮抗菌肽，是两栖类动物中存在的天然免疫物质，在蛙类中仍然保持着一定的活性。我们用提取中国林蛙皮肤总RNA，逆转录合成cDNA，PCR扩增得到DNA片段，并与GenBank上登陆的其他蛙类的皮肤抗菌肽序列进行比较，发现此序列是一个新的蛙皮肤抗菌肽序列。PCR产物与pMD18-T连接，得到阳性重组体pMD18-RTCD。将阳性重组体进行测序，分析蛙皮素的氨基酸序列，显示它属于蛙皮抗菌肽家族。此外，中国林蛙抗菌肽氨基酸序列包含C-末端残基，同时具有两栖类动物抗菌肽的特征。这些信息对将来研究两栖类动物的天然免疫的分子机制具有重要作用。为应用基因工程技术对我国林蛙抗菌肽基因进行克隆表达奠定了基础。     

东北林蛙皮肤及其腺体组织形态学观察

本文观察了东北林蛙皮肤及其腺体组织形态学结构,结果表明：东北林蛙体表各部位皮肤薄厚不一,头部背侧皮肤最厚（224.4±5.46μm）,后肢腹侧皮肤最薄（135.7±5.06μm）,但基本结构相同,由表皮和真皮组成。表皮薄,为复层扁平上皮;真皮疏松层有大量腺体分布,主要是粘液腺和颗粒腺。粘液腺广泛分布于全身皮肤,颗粒腺多见于背部皮肤,以躯干背侧褶处体积最大。色素细胞分布于真皮浅层,以背侧皮肤多见。     

大肠杆菌胁迫下东北林蛙皮肤抗菌肽分泌特性研究

以东北林蛙(Rana dybowskii)为试验对象,采用大肠杆菌(Escherichia coli)作为环境胁迫因子,通过RP-HPLC分析、抑菌活性和蛋白浓度比较,观察其皮肤分泌物的特异性分泌,以期揭示两栖类动物抵御环境微生物时皮肤分泌抗菌肽的变化规律。研究发现,用E.coli胁迫1~18d后皮肤分泌物粗提物洗脱峰数量明显减少了61.54%~84.62%,对4个持续出现的8、9、11和14号洗脱峰的抑菌活性试验显示,8、9号峰对G-和G+菌均表现较强的活性抑制,而11、14号峰仅对G+菌有较强的抑菌活性。此外,E.coli胁迫后第7天组皮肤分泌物的洗脱峰数量、持续出现峰的峰面积值及蛋白浓度与对照组比均明显增加,第23天组均恢复至较高水平。研究结果表明:两栖类皮肤抗菌肽可能在参与机体先天免疫系统防御和启动后天免疫应答的关键环节中发挥重要的桥梁作用。     

东北林蛙与黑龙江林蛙空气呼吸静止代谢率的研究

应用改进的封闭式流体压力呼吸仪,对实验室条件下东北林蛙和黑龙江林蛙的空气呼吸静止代谢率(RMR)进行了研究.结果表明:东北林蛙与黑龙江林蛙体温均与环境温度(Ta)呈正线性回归,且极显著正相关(P<0.01).在5～30℃之间6个温度条件下,东北林蛙与黑龙江林蛙雌雄个体的RMR均与Ta曲线正相关,相关性极显著(P＜0.01),东北林蛙RMR的回归方程为雄性RMR1=176.811-0.914Ta 0.573Ta2,r=0.875,af1=2,df2=27;雌性RMR2=158.997-8.335Ta 0.667Ta2,r=0.914,df1=2,df2=27.黑龙江林蛙RMR的回归方程为雄性RMR3=296.557-12.276Ta 1.282Ta2,r=0.861,df1=2,df2=27;雌性为RMR4=256.13-5.648Ta 0.899Ta2,r=0.921,df1=2,df2=27.无论雌雄个体黑龙江林蛙RMR水平都较东北林蛙高,2种林蛙RMR的差异是与呼吸频率和体表散热能力有关.     

人工养殖东北林蛙生长与发育规律的初步研究

2008年4—10月,在黑龙江省佳木斯市某东北林蛙养殖场,对1龄、2龄和3龄人工养殖东北林蛙的体重（Y）、体长（1）、前臂及手长（f）、后肢长（X）和头宽（z）体尺指标进行测量与分析。结果表明：1龄、2龄东北林蛙在7月的绝对生长率最大,3龄东北林蛙在5月和8月的绝对生长率高于其他月;1龄、3龄东北林蛙5月的相对生长率最大,2龄东北林蛙5月和7月的相对生长率大于其他月;不同种源的1龄东北林蛙体重差别显著（P〈0．05）;东北林蛙各体尺指标之间的相关性均显著（P〈0．01）;利用多元线性回归建立了东北林蛙体重与其他体尺指标的最优回归方程为Y=-18．374＋4．417x＋1．246z（R=0．923、R^2=0．853、校正R^2=0．851）。     

中国林蛙抗菌肽Temporin-1 CEa基因的真核表达载体构建

为了建立大量获取中国林蛙抗菌肽的方法,根据GenBank中的中国林蛙皮肤抗菌肽Temporin-1CEa基因的mRNA序列(EU624139)设计一对特异性引物,以提取的中国林蛙皮肤总RNA反转录出的cDNA为模板,将扩增的编码序列与pEASY-T3克隆载体连接获得Tem-T3;利用酶切、连接等分子生物学手段,将GFP基因连入Tem-T3克隆载体,再经酶切获得Tem-GFP片段,并插入真核表达载体pcDNA3.1,最终得到Tem-GFP-pcD-NA3.1重组质粒;利用脂质体转染法将该质粒转入绵羊成纤维细胞,48 h后可在荧光倒置显微镜下观察到GFP的绿色荧光表达;qPCR数据分析显示,与对照组相比,转染Tem-GFP-pcDNA3.1的绵羊成纤维细胞中融合蛋白Tem-GFP的表达量可提高约300倍。本研究为构建Temporin-1CEa基因山羊乳腺特异表达载体提供依据。     

东北林蛙捕食行为研究

2010年7～9月,利用焦点动物取样法并结合全事件取样法对东北林蛙的捕食行为研究表明：对运动敏感的视觉特性对东北林蛙的捕食行为有重要影响,其所能捕获的对象均为移动物体;东北林蛙整个捕食行为存在多种模式和环节,分别由相应条件触发;猎物的形状、运动方向和活动性的强弱均影响东北林蛙的捕食行为;相对于移动的目标,振动和闪动的目标更容易引起东北林蛙的捕食;东北林蛙对猎物运动的敏感度较高,但处理食物能力较弱。     

环境因子对东北林蛙胚胎期和变态期影响的研究进展

东北林蛙因其具有药用价值与经济价值,日益受到人们的重视。近年来,我国学者开展了关于东北林蛙养殖和生态学的研究。文章着重介绍温度对东北林蛙生长发育、性别分化的影响和营养因子对东北林蛙变态期的影响,同时就环境因子对东北林蛙不同发育阶段影响的研究现状进行了综述,并分析了在东北林蛙养殖中应注意的与环境相关的问题。     

东北林蛙人工养殖存在问题及发展对策

分析了人工养殖东北林蛙存在的一些问题,阐述了人工养殖东北林蛙的发展对策。认为人工养殖东北林蛙应该以半人工养殖方式为主。如何解决技术难题是东北林蛙全人工养殖发展的首要问题。目前,东北林蛙全人工养殖技术还不成熟,不适宜推广普及。     

嗜水气单胞菌胁迫下东北林蛙皮肤MyD88和TRAF6基因表达的动态变化

采用高通量测序获得东北林蛙(Rana dybowskii)MyD88和TRAF6mRNA序列设计引物,将蛙类易感微生物嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)经东北林蛙腹腔注射后,用荧光定量PCR技术分析蛙皮肤MyD88和TRAF6mRNA表达水平的变化,以期揭示东北林蛙在识别嗜水气单胞菌后,其机体TLR信号通路中相关分子的免疫效应。数据显示,处理后12h试验组皮肤MyD88和TRAF6mRNA的表达量与对照组相比有明显升高且达到峰值,分别为2.38倍和8.12倍,其中TRAF6mRNA表达水平尤为显著,在24h~48h仍处于较高水平,分别为对照组的4.32倍和2.54倍。结果表明,嗜水气单胞菌胁迫能促使东北林蛙机体TLR信号通路中的MyD88和TRAF6mRNA的表达量上调。本研究探讨了微生物侵袭时东北林蛙的TLR信号调控机制,为认识两栖类机体的先天免疫系统奠定了一定的理论基础。     

人工养殖东北林蛙生长曲线的拟合与分析

为了解东北林蛙的生长规律,运用Gompertz、Logistic和Von Bertalanffy3种非线性模型分别对东北林蛙一龄和二龄生长期间体重数据进行了曲线拟合和分析。结果表明:3种模型都能很好地模拟东北林蛙的生长曲线,但Logistic曲线模型的拟合效果最好。结果显示,运用3种模型对东北林蛙进行生长曲线的拟合和分析是可行的。     

生态地理因子与东北林蛙虹彩病毒带毒率相关性研究

生态地理因子对蛙类虹彩病毒带毒率的影响目前还缺少定量研究,为了确定东北林蛙虹彩病毒带毒率与生态地理因子之间的关系,对黑龙江省小兴安岭、完达山和张广才岭的鹤北、东方红和阿城等7个地区进行了实地调查,对采样地点的经纬度、海拔、气温等生态地理因子进行测量,并对东北林蛙带毒率进行PCR检测确认;林蛙虹彩病毒带毒率与生态地理因子之间的关系进行皮尔逊相关性分析。结果表明,21个采样点的生态地理因子对东北林蛙虹彩病毒带毒率的影响不显著,但其中气温的影响高于其他因子。值得注意的是,张广才岭山系的经度、纬度、温度对林蛙虹彩病毒带毒率影响显著,这可能是因为在小兴安岭和完达山的某些非生态地理因子对该地区林蛙虹彩病毒带毒率的影响超过了所研究的生态地理因子,生态地理因子已经不是影响林蛙虹彩病毒带毒率的主要原因。     

中国林蛙皮肤抗菌肽的分离纯化及部分特性研究

从长白山林蛙养殖场购买林蛙 ,用冷水清洗林蛙 ,断头后迅速剥离皮肤 ,清洗血液后剪碎 ,经 80 %的甲醇抽提 3次 ;再经组织捣碎机捣碎 ,用 80 %的甲醇抽提 2次 ;再经葡聚糖凝胶过滤。实验结果表明 ,林蛙皮肤中小分子活性多肽经葡聚糖凝胶过滤得到纯度较高的抗菌活性肽 ;林蛙皮肤中小分子活性多肽对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌都具有一定的抗菌作用 ;经醋酸纤维薄膜电泳 ,表明其具有较强的阳离子特征 ;SDS - -PAGE电泳分析表明为单一区带 ,林蛙皮肤中小分子抗菌活性多肽的相对分子量为 6 .2 8ku。     

铁岭地区人工养殖东北林蛙的遗传多样性研究

<正>东北林蛙别名哈士蟆,是一种传统的珍稀药用动物,其输卵管的干燥物即哈士蟆油,其皮肤含有广谱的抗菌活性物质[1-2],主要分布于我国东北地区长白山脉。东北林蛙一般生活在临近海滨的丘陵至海拔900 m左右、山区植被较好的湿润环境中。由于东北林蛙具有很高的经济价值,目前辽宁省林蛙的养殖规模和林蛙产业总产值已经非常可观。相对于其他动物而言,东北林蛙对养殖环境的要求十分高,圈舍小气候对林蛙生长发育的影响显著[3-5],辽宁地区大多     

四种两栖类动物皮肤分泌物的生物活性比较

抗菌肽是生物界中广泛存在的一类具有生物活性的小肽,是带正电荷的两性分子[1]。许多科学家曾认为宿主天然防御系统的主要参与者是白细胞(如肥大细胞)、血清蛋白(如补体)、吞噬细胞(如巨     

东北林蛙开发与利用的研究现状

林蛙是极具研究价值的经济动物之一，其全身是宝，对林蛙的开发主要集中在林蛙油、林蛙肉及林蛙皮活性肽几方面，主要应用于保健食品，药品及化妆品上。     

中国林蛙南移人工养殖的生态适应性研究

观察并研究了中国林蛙从东北迁移到浙江之后 ,在人工养殖过程中出现的生长变缓、死亡率增高、行为习性改变和幼蛙的发育过程不良等现象。分析了南方环境生态因子变化对林蛙所造成的环境胁迫 ,及由此带来林蛙在冬眠和繁殖上的影响。认为饲料供应、光周期和环境温度是决定林蛙在南方生长发育的限制因子 ,并从技术上提出了改进措施。     

低温胁迫对东北林蛙雄性成体GP、PEPCK比活性的影响

采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法、蒽酮比色定糖法分别检测低温胁迫下东北林蛙血糖和肝糖原、肌糖原的含量,并通过6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联比色法、乳酸脱氢酶偶联比色法分别检测低温胁迫下东北林蛙肝脏、肌肉糖原磷酸化酶(Glycogen phosphorylase,GP)和肝脏、肾脏磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)的比活性,以探讨低温对东北林蛙GP、PEPCK比活性的影响。结果表明:随着环境温度降低,东北林蛙血糖水平逐步升高,糖原含量逐步降低,与对照组相比,各低温组血糖升高极显著(P<0.01),而肝糖原和肌糖原含量降低极显著(P<0.01);与对照组相比,0℃组、-1℃组肝脏、肌肉组织GP比活性升高极显著(P<0.01),且肝脏、肾脏PEPCK比活性升高极显著(P<0.01)。说明低温胁迫促使东北林蛙糖原含量降低,糖原分解和糖异生限速酶比活性升高,进而血糖含量升高,提示血糖作为抗冻保护剂在东北林蛙冬眠中发挥重要作用。     

骨龄学方法对林蛙生长发育特性的研究应用

采用骨龄学方法,对半人工养殖的120只东北林蛙（Ranadybowskii）进行年龄鉴定,将样本分为6个年龄组（2～7龄）,并在此基础上研究了林蛙的性成熟年龄、生长速率及性别二型性等。结果表明：林蛙性成熟年龄为3岁;雌蛙平均体长（64．79±8．41）mm显著大于雄蛙平均体长（60．83±4．46）mm（P〈0．05）...     

不同饲料营养水平对东北林蛙蝌蚪生长发育的影响

选取人工孵化的野生东北林蛙蝌蚪随机分为 10组 ,每组 5 30只 ,分别饲喂 10种不同蛋白质水平和组成的饲料。每 5d将蝌蚪称重并采样 1次 ,测定蝌蚪活体重、变态活体重、变态率等指标。结果表明 ,饲料营养对东北林蛙蝌蚪的生长发育及变态幼蛙的体重有明显影响 :林蛙蝌蚪的生长发育与饲料蛋白源无关 ,而与饲料粗蛋白水平有关。林蛙蝌蚪的最大体重、变态幼蛙的体重与饲料CP水平呈正线性相关 ,其相关系数分别为 0 80 0和 0 85 9;蝌蚪期、蝌蚪变态时间均与饲料CP水平呈负线性相关 ,其相关系数分别为 - 0 96 6和- 0 892 ;林蛙蝌蚪饲料的适宜粗蛋白水平应为 15 %～ 2 2 %。