家蚕Ssu72蛋白基因的克隆及序列与表达分析

Ssu72(suppressor of sua7-1 clone 2)蛋白的命名源于对酵母sua7-1基因突变的抑制作用,推测其在真核生物RNA聚合酶Ⅱ作用的转录过程中有重要功能。从家蚕蛹cDNA文库中筛选到家蚕Ssu72蛋白基因(BmSsu72)的cDNA序列,利用生物信息学方法分析该基因ORF为579 bp,编码蛋白质含有192个氨基酸残基,具有完整的Ssu72保守结构域,三级结构包含9个α螺旋和4个β折叠,推测α螺旋和β折叠之间可能形成锌指结构。以家蚕蛹cDNA为模板PCR克隆到BmSsu72基因的完整ORF序列,通过构建载体pET-28a(+)-BmSsu72在大肠杆菌中表达并纯化了重组BmSsu72蛋白,进而利用纯化蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体。采用荧光定量PCR检测到BmSsu72基因随着家蚕的生长发育转录水平呈逐渐下降趋势,在卵期的转录水平最高,在蛾期的转录水平最低;该基因在5龄幼虫各组织中的转录水平以马氏管最高,卵巢和丝腺次之。Western blotting检测BmSsu72在家蚕5龄幼虫各个组织中均有表达,其中在丝腺中的表达水平最高。推测BmSsu72可能与家蚕丝腺的分泌相关。     

家蚕糖转运蛋白基因BmST3的克隆及序列分析与表达研究

糖转运蛋白在家蚕体内糖类化合物的转运与代谢过程中发挥重要作用。在电子克隆的基础上,通过RT-PCR方法克隆了家蚕糖转运蛋白基因BmST3(GenBank登录号:GQ871756)。生物信息学分析结果显示,该基因位于家蚕27号染色体,开放阅读框(ORF)长1434bp,编码477个氨基酸,预测蛋白有典型的Sugar_tr结构域和12个疏水的跨膜结构域,与埃及伊蚊、致倦库蚊、冈比亚按蚊、赤拟谷盗登录号分别为EAT47626、EDS35465、EAA11457、EFA05337的同源蛋白相似性均在60%以上。RT-PCR检测和基因芯片信号值分析结果显示,BmST3基因的表达具有组织特异性,在家蚕5龄第3天幼虫的9种组织中,主要在马氏管中大量表达,推测其可能在马氏管细胞膜内外物质的跨膜转运中发挥作用。     

家蚕Ring基因的克隆及序列特征与组织表达分析

Polycomb group(PcG)蛋白是多细胞有机体中的一类表观遗传抑制因子,Ring是Pc G蛋白家族的主要成员,在Pc G蛋白的转录抑制调控中行使重要功能,对昆虫和哺乳动物的发育至关重要。利用同源检索方法获得家蚕Ring基因(BmRing)的核苷酸序列,该基因位于家蚕第17号染色体的nscaf2865位点。BmRing的核苷酸序列由4个外显子和3个内含子构成,基因的c DNA3'端有2个多聚腺苷酸化信号(aataaa)和典型的poly(A)结构;BmRing编码由377个氨基酸组成的蛋白质,分子质量为41.8 k D,等电点为6.72,氨基酸序列具有3个同源异型结构域(homeobox domain,HD),46~85 aa为高度保守的典型的环指结构域(Ring finger),331~347 aa为跨膜区,N端位于膜外。通过STRING在线预测分析得到10个与BmRing有相互作用关系的蛋白质。系统进化分析显示BmRing与果蝇的Dm SCE、意大利蜜蜂的AmRing等的亲缘关系较近。以家蚕5龄第3天幼虫的卵巢c DNA为模板,克隆了BmRing基因,并利用半定量RT-PCR检测BmRing基因在5龄第3天幼虫的精巢、卵巢、头部和血细胞中有明显表达,而在其他组织中几乎不表达。获得的上述基础信息,有益于进一步研究BmRing的生物学功能。     

家蚕精巢特异性蛋白激酶基因Bm-TSSK的克隆及序列与表达分析

睾丸特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(testis-specific serine/threonine kinase,TSSK)首先在哺乳动物中被发现,是一类在精子发生过程起重要作用的蛋白激酶。通过EST同源筛选方法,用人(Homo sapiens)的TSSK2、TSSK4、TSSK6基因cDNA和小鼠(Mus musculus)的TSSK1、TSSK3、TSSK5基因cDNA为探针在GenBank家蚕EST数据库中搜索同源基因,通过在家蚕基因组数据库的同源性检索以及电子克隆,获得一条家蚕精巢特异性蛋白激酶基因的序列,命名为Bm-TSSK(GenBank登录号:JN159476)。据此预测序列设计引物,成功地在家蚕精巢组织中克隆了Bm-TSSK基因完整的开放阅读框(ORF),序列分析及同源性比对表明:Bm-TSSK序列长1 402 bp,ORF为1 041 bp,没有内含子,推测编码346个氨基酸残基,在编码氨基酸序列20～284区域有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的结构域;该基因推导的氨基酸序列在进化上与赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、熊蜂(Bombus terrestris)、顶切叶蚁(Acromyrmex echinatior)的亲缘关系较近,相似度分别为81%、86%和85%。基于定量PCR和基因芯片的数据分析显示Bm-TSSK在家蚕5龄第3天幼虫的精巢特异性高表达,推测Bm-TSSK参与了家蚕精子的形成。     

家蚕热休克蛋白70家族基因的染色体定位及表达特征

热休克蛋白70家族(Hsp70)是非常保守的蛋白家族,每个物种的Hsp70家族都有多个成员,每个成员都可能具有特殊的功能。为了能够对家蚕Hsp70家族各成员进行科学命名和了解其特有的功能,分析家蚕Hsp70家族成员的编码基因及其在染色体上的定位,并通过实时荧光定量PCR方法检测这些基因在5龄第3天幼虫中肠、脂肪体和丝腺组织中的转录表达情况。家蚕诱导型Hsp70家族成员Bmhsp70A和Bmhsp70B的编码基因集中分布在第27号染色体上,有多个拷贝;组成型Bmhsp70家族成员的编码基因则分布在不同的染色体上,一般仅有1个拷贝。家蚕Hsp70家族基因中有10个能转录并翻译蛋白质产物的成员,还有1个能正常转录但不能正确翻译的假基因。实时荧光定量PCR结果表明:在常温(25℃)条件下,组成型Bmhsp70家族基因Bmhsc70-4和Bmhsc70-3的表达水平较高,而其它基因成员的表达水平则相对较低,诱导型Bmhsp70家族基因成员在常温下也有一定程度的基础表达;40℃热激2 h后,Bmhsp70家族所有基因的表达水平都有所升高,其中诱导型Bmhsp70家族基因Bmhsp70B和Bmhsp68的转录表达上升水平远高于组成型Bmhsp70家族基因Bmhsc70-3和Bmhsc70-4。不同表达类型的家蚕Hsp70家族基因成员在5龄幼虫中肠、丝腺和脂肪体中的表达情况不同,热激2 h后的表达变化规律也不完全相同,提示家蚕Hsp70家族成员具有各自特殊的功能。     

家蚕G蛋白α亚基基因BmGα12的克隆及序列分析与融合表达

异三聚体G蛋白是真核细胞感知外界信号后将信号传递到细胞内的重要分子,参与生物体内广泛的信号转导途径。采用生物信息学方法和RT-PCR、RACE技术克隆了家蚕G蛋白α亚基基因BmGα12的全长cDNA序列,该序列全长1374 bp,开放阅读框(ORF)1 128 bp,编码375个氨基酸。将构建的表达载体pET-41b(+)-Gα12转化E.coli BL21宿主菌进行诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot检测显示,BmGα12可在E.coli BL21中高效表达,GST-BmGα12融合蛋白主要以包涵体形式存在,其分子质量约71 kD。系统进化分析显示BmGα12与大鼠和人Gα12/Gα13的亲缘关系较近,初步推测BmGα12介导的信号传导同样在细胞生长、胚胎发育中起重要作用。     

家蚕SoxE基因的全长cDNA克隆和表达谱分析

Sox基因家族是在动物中发现的一类重要的转录调控因子。基于生物信息学和RACE策略,从家蚕胚胎中克隆了一个与果蝇E族Sox基因成员同源的基因的全长cDNA,命名为BmSoxE(GenBank登录号:HQ728280)。BmSoxE的cDNA序列全长为1 398 bp,编码222个氨基酸。生物信息学分析显示,BmSoxE蛋白序列含有典型的HMG-box结构域和数个磷酸化位点。组织表达谱分析发现,BmSoxE基因在家蚕生殖腺中高量表达;时期表达谱分析表明,从家蚕的幼虫期一直到成虫期,Bm-SoxE基因的表达维持在较高水平,暗示BmSoxE基因在家蚕性别决定和分化中可能发挥了调控作用。     

家蚕淀粉酶基因(Bmamy2)的分子克隆及表达特征和序列分析

淀粉酶在生物体内的碳水化合物代谢中起重要作用。根据预测的基因序列设计引物,克隆了一个家蚕淀粉酶基因(Bmamy2),获得完整的编码区序列(全长1 752 bp,编码583个aa)。用推导的氨基酸序列与其它物种的淀粉酶基因作相似性比较和系统发育分析,发现所克隆的Bmamy2基因是一个起源很早的拷贝,在细菌、果蝇、非洲蟾蜍、人和鸡等多种生物中存在与之同源的基因。该基因编码蛋白的功能结构域预测有2个起催化作用的关键氨基酸发生突变,推测该基因可能失去了催化水解碳水化合物的功能。RT-PCR和基因芯片检测结果表明,该基因在家蚕5龄第3天幼虫的中肠和脂肪体中表达,且在中肠中的表达丰度较高。     

家蚕细胞周期素家族基因的克隆及结构特征与表达分析

细胞周期素(cyclin)是推进细胞周期进程最主要的调控因子之一,并与个体发育及肿瘤形成等有关。为研究细胞周期素家族基因在家蚕组织中的表达情况,利用家蚕基因组数据库信息设计引物克隆了家蚕细胞周期素家族的5个基因,对基因序列结构的分析结果表明,cyclinA、cyclinB、cyclinB3基因分别有7个外显子,cyclinE基因有8个外显子,cyclinL1基因只有1个外显子;cyclinA及cyclinE基因存在较多的剪切方式,cyclinA主要包含大小为2 141和2 173 bp的2种转录本,其变化在第7外显子,cyclinE则含有1 422、1 290及1 194 bp等大小不同的序列,变化集中于第5～7外显子,而cyclinB、cyclinB3及cyclinL1基因则相对稳定。克隆的家蚕细胞周期素家族基因的组织表达存在差异:cyclinA基因只在精巢中表达,cyclinB3基因只在精巢和卵巢中有明显的表达,cyclinE基因在丝腺、脑、脂肪体、中肠、马氏管、精巢、卵巢及血液8种组织都有表达,cyclinB和cy-clinL1基因在除丝腺或血液外的其他7种组织检测到表达。研究结果为进一步探究不同细胞周期素在昆虫蜕皮、变态等生理过程中的功能提供了参考。     

家蚕防御素基因的序列特征与表达模式分析及原核表达试验

家蚕防御素(defensin)是家蚕抗菌肽家族的主要成员之一,为家蚕先天性免疫的重要效应因子。采用生物信息学方法分析家蚕防御素基因BmdefA、BmdefB的序列中各有2个外显子,2个基因分别定位于家蚕第4号和第13号染色体上;等电点预测BmdefA带有负电荷,属于罕见的阴离子型抗菌肽,而BmdefB带有正电荷,属于常见的阳离子型抗菌肽;预测2个基因编码的成熟肽分子质量均在4 kD左右。用RT-PCR方法检测BmdefA在家蚕整个发育过程中有表达,且在检测的幼虫和成虫各组织中均有表达;BmdefB从幼虫5龄第3天到成虫期表达,雄性表达量高于雌性,且在5龄第3天幼虫的生殖腺、脂肪体和血细胞中高水平表达。家蚕防御素BmdefA、BmdefB具有不同的分子特性和表达特征,暗示它们在家蚕先天免疫过程中可能行使不同的功能,甚至可能具有不同的抗菌机理。构建融合GST标签的家蚕防御素基因原核表达载体,通过在大肠杆菌细胞内诱导表达,获得可溶性的目的蛋白,使用GST亲和层析柱初步纯化表达的融合蛋白并进行Western blotting鉴定,为进一步研究BmdefA、BmdefB的体外活性和抑菌机制奠定基础。     

家蚕蛋白激酶C受体基因( Bmrack )的克隆及序列分析

蛋白激酶C受体蛋白(RACK)除作为细胞内蛋白激酶C的受体之外,还作为细胞内重要的支架蛋白调节细胞功能。应用生物信息学方法对家蚕RACK蛋白的编码基因Bmrack进行电子克隆,获得了1224 bp的重组序列,基因编码区长960 bp,编码319个氨基酸,蛋白分子质量为36.04 kD,等电点为8.07。从家蚕幼虫脂肪体基因组DNA中PCR克隆了Bmrack基因,序列总长为2 122 bp,含有4个内含子和5个外显子,通过家蚕WGS比对,结果与其中5条序列的一致性为99%,且修复了其中8个缺口。聚类分析表明RACK蛋白的氨基酸序列在鳞翅目昆虫中非常保守。     

家蚕丝心蛋白轻链基因的克隆及品种间的比较

从蚕品种浙蕾×春晓的蛹中提取基因组DNA ,用PCR的方法克隆出家蚕丝心蛋白轻链基因 3’端 ,包含第 2到第 7外显子区 5 5kb的DNA片段。经测序并与蚕品种J- 139丝心蛋白轻链基因相同区域的比较表明 ,蚕品种间丝心蛋白轻链DNA序列同源性为 95 6 % ,氨基酸序列同源性为 98 8%。     

家蚕感染BmCPV相关未知功能蛋白LOC101742613的基因克隆及表征特征分析

在感染家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrovirus,BmCPV)的家蚕中肠组织中发现一个表达量明显下调的未知蛋白LOC101742613,与棉铃虫(Helicoverpa armigera)的未知蛋白LOC110378285的序列一致性为51%。利用PCR技术克隆获得了编码该蛋白质的cDNA,其序列全长为1 114 bp,最大开放阅读框(ORF)为993 bp,编码的蛋白质由330个氨基酸残基组成,预测蛋白质分子质量为36.6 kD,等电点为4.31。实时荧光定量PCR分析发现目的基因主要在家蚕的脂肪体、精巢、卵巢和头部组织中表达,且家蚕中肠感染BmCPV后48 h和72 h其mRNA的表达量显著下调,分别为对照组的7.3%和2.1%。通过构建重组表达载体pET28a/BGIBMGA014203对去掉信号肽的目的蛋白进行原核表达,表达产物经SDS-PAGE电泳分析发现重组蛋白主要在包涵体中,分子质量约为37 kD。研究结果为进一步阐明目的基因的生物学功能奠定了基础。     

家蚕膜蛋白基因(BmTmC27)的序列分析及组织特异性和原核表达

从家蚕蛹cDNA文库中筛选获得一条家蚕膜蛋白基因序列,通过编码氨基酸序列的同源性比对表明其可能是家蚕的未知功能序列,命名为BmTmC27(GenBank登录号:DY231073.1)。生物信息学分析结果表明该基因全长833 bp,由558 bp的开放阅读框、102 bp的5'端非翻译区和173 bp的3'端非翻译区组成,编码蛋白由185个氨基酸组成且含有4个跨膜区,预测蛋白分子质量为20.94 kD,等电点为7.38。将该基因片段与BmNPV的polh基因连接后克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建原核融合表达载体pGEX-4T-1-polh-BmTmC27,经IPTG诱导、SDS-PAGE分析表明目的蛋白以包涵体形式在E.coli BL21(DE3)中表达。利用多角体蛋白可溶于碱性环境的性质,采用调节pH值的方法纯化融合表达的重组蛋白GST-Polh-BmT-mC27,然后经TEV酶消化获得BmTmC27蛋白。荧光定量PCR分析BmTmC27在家蚕5龄幼虫不同组织中的表达存在明显差异,其中在脂肪体、中肠和气管中的转录水平较高。利用GST沉降技术研究了BmTmC27的互作蛋白,与对照组相比,发现了4条特异性互作蛋白条带。研究结果有助于进一步探究BmTmC27的生物学功能,也为膜蛋白的表达和纯化提供了一种新方法。     

家蚕体节极性基因(Bmdpp)的克隆与表达研究

体节极性基因dpp是昆虫发育过程中的关键基因。采用生物信息学的方法,利用家蚕EST数据获得了家蚕dpp基因(Bmdpp)cDNA序列。该cDNA序列全长1 206 bp,ORF1 146 bp,编码381个氨基酸,预测蛋白分子质量38.6 kD,等电点9.18。将克隆的Bmdpp基因完整CDS序列亚克隆到pET-28a(+)表达载体,转化、诱导后经SDS-PAGE电泳检测到约40 kD与预测分子质量相符的目的蛋白条带。对Bmdpp在家蚕胚胎不同发育时期的表达分析发现,该基因在受精6~14 h的表达量很低,甚至没有表达。这一表达模式和果蝇dpp基因在胚胎发育过程中的表达模式相似,推测Bmdpp在家蚕早期胚胎发育的背-腹轴分化中起作用。