牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS3的研究进展

非结构蛋白NS3是致细胞病变型牛病毒性腹泻病毒的分子标记蛋白,它具有多种生物学功能。研究结果表明,NS3在病毒非结构蛋白的加工、成熟、基因组复制与转录过程中以及宿主细胞致细胞病变效应的产生中起重要作用。文章总结了NS3的生物学特性及其相关功能,为阐明NS3的致细胞病变作用机理奠定基础。     

牛病毒性腹泻病毒NS5A蛋白纳米抗体的筛选与鉴定

为防控牛病毒性腹泻的流行,淘选得到抗BVDV-NS5A的纳米抗体序列,并探究其结合活性。通过重组质粒pET30a-NS5A诱导表达并纯化蛋白,免疫羊驼,获得重组质粒pCANTAB 5E-VHH,构建了一个初始的抗BVDV-NS5A纳米抗体展示文库。利用3轮固相亲和筛选,对筛选后的单克隆抗体通过ELISA验证其特异性与结合力并测序、分析。构建出具有较好多样性的噬菌体展示文库,测得库容为5.3×10⁷ CFU/mL,插入率73.9%。通过评价和分析显示,得到20株不同氨基酸序列的纳米抗体,其中7株与NS5A蛋白具有较好反应性。针对抗BVDV-NS5A蛋白淘选纳米抗体,并证明得到的纳米抗体有较好的结合力。研究结果有望用于研发BVDV诊断试剂盒、抗BVDV的候选药物,同时也为后续BVDV的致病机制研究奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒2型E2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备牛病毒性腹泻病毒2型(BVDV2)E2蛋白的单克隆抗体,采用表达的E2蛋白免疫BALB/c小鼠,4次免疫后分离小鼠脾细胞并将其与SP2/0细胞融合,通过间接ELISA方法筛选,获得5株能稳定分泌抗BVDV2 E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。Western blot和IFA结果显示,其中1株为BVDV2特异性单克隆抗体,其细胞上清ELISA抗体效价达59049。亚型鉴定结果显示,单克隆抗体属于Ig G1,轻链为κ型。经腹水制备和纯化后,其纯度达85%以上,间接ELISA抗体效价达128000以上,经连续传代20代仍能稳定分泌单克隆抗体。通过杂交瘤融合后筛选出1株针对BVDV2 E2蛋白的单克隆细胞株,为开展免疫学研究和2型牛病毒性腹泻/黏膜病诊断检测方法的建立奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的鉴定

筛选建立了8株牛病毒性腹泻病毒（BVDV）单克隆抗体杂交瘤细胞，通过对其染色体的分析、单克隆抗体免疫球蛋白类型及病毒中和活性等指标的检测，表明8株单克隆抗体杂交瘤细胞的染色体数目均接近两亲本细胞的染色体数目之和；单克隆抗体免疫球蛋白类型均为IgG，其中6株为IgG1,2株为IgG2a，且以BVDV具有不同程度的中和能力。     

牛病毒性腹泻病毒抗原捕获ELISA方法的建立

用兔抗牛病毒性腹泻病毒(BVDV)多抗作为包被抗体,BVDV NS3单克隆抗体作为捕获抗体,建立了检测BVDV抗原的捕获ELISA方法,对各项反应条件进行优化,最终获得最佳工作条件为兔多抗1∶1 600稀释包被,NS3单抗1∶2 000稀释,酶标抗体工作浓度为1∶4 000稀释。特异性和敏感性试验结果表明,该方法对牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛分支杆菌无特异性交叉反应,其最低可检测7.9×103个TCID50的病毒量,与RT-PCR方法的相比较,符合率为100%。所建立的BVDV抗原捕获ELISA方法快速、特异、敏感,可用于BVDV抗原的检测。     

牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

在MDBK细胞上增殖牛病毒性腹泻病毒(BVDV)HN-1株，用蔗糖密度梯度离心法纯化后免疫BALB／c小鼠，应用淋巴细胞杂交瘤技术，取脾细胞并与NS0骨髓瘤细胞融合，经间接ELISA筛选，3次有限稀释法克隆，得到4株能稳定分泌抗BVDV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株：3A8、3C7、3C11和3E9。经鉴定，3A8、3C7、3E9株为IgG1亚类，3C11株为IgG2a亚类；杂交瘤细胞的平均染色体数目为99条。3A8、3C7、3E9、3C11与BCV、BRV均无交叉反应，但3A8、3C7、3E9与HCV、BDV存在交叉反应，而3C11与HCV、BDV无交叉反应，3C11显示出较好的特异性；杂交瘤细胞培养上清液及小鼠腹水McAb的ELISA效价分别为1：1000和1：200000，该杂交瘤细胞连续培养20代后仍能稳定分泌抗体。这些McAb的获得为BVDV的研究及快速诊断方法的建立奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白纳米抗体的筛选及反应原性检测

本研究旨在获得高效特异性的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3(P80)非结构蛋白的纳米抗体。用BVDV灭活疫苗免疫羊驼,测得抗体效价后分离全血中的淋巴细胞。通过噬菌体展示技术构建羊驼重链抗体可变区噬菌体展示文库。经过连续3次吸附-洗脱-扩增的生物筛淘,从中挑选出与BVDV-NS3蛋白结合的噬菌体。对经菌液PCR、琼脂糖凝胶电泳鉴定到的单域抗体(VHH)克隆进行基因测序和同源性比对。用ELISA方法验证筛选出的纳米抗体的反应原性,找到与BVDV-NS3蛋白亲和力高的纳米抗体。结果表明,获得插入率为92.8%、库容为1.84×1014 CFU/mL的噬菌体展示文库。ELISA结果和氨基酸序列分析显示,成功得到1条与BVDV-NS3蛋白具有良好反应性且与VHH同源性较高的纳米抗体序列。本研究利用大肠杆菌成功表达BVDV-NS3抗原蛋白,建立BVDV纳米抗体噬菌体展示文库,筛选到针对BVDV重要抗原蛋白相应的纳米抗体且与VHH同源性较高。试验结果为牛病毒性腹泻/黏膜病的防控、诊断、治疗及纳米抗体药物的研制提供参考。     

牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白纳米抗体的筛选及反应原性检测

本研究旨在获得高效特异性的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）NS3（P80）非结构蛋白的纳米抗体。用BVDV灭活疫苗免疫羊驼,测得抗体效价后分离全血中的淋巴细胞。通过噬菌体展示技术构建羊驼重链抗体可变区噬菌体展示文库。经过连续3次吸附-洗脱-扩增的生物筛淘,从中挑选出与BVDV-NS3蛋白结合的噬菌体。对经菌液PCR、琼脂糖凝胶电泳鉴定到的单域抗体（VHH）克隆进行基因测序和同源性比对。用ELISA方法验证筛选出的纳米抗体的反应原性,找到与BVDV-NS3蛋白亲和力高的纳米抗体。结果表明,获得插入率为92.8%、库容为1.84×10¹⁴ CFU/mL的噬菌体展示文库。ELISA结果和氨基酸序列分析显示,成功得到1条与BVDV-NS3蛋白具有良好反应性且与VHH同源性较高的纳米抗体序列。本研究利用大肠杆菌成功表达BVDV-NS3抗原蛋白,建立BVDV纳米抗体噬菌体展示文库,筛选到针对BVDV重要抗原蛋白相应的纳米抗体且与VHH同源性较高。试验结果为牛病毒性腹泻/黏膜病的防控、诊断、治疗及纳米抗体药物的研制提供参考。     

牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体捕获ELISA方法的建立

以纯化的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)作为抗原免疫BALB/C系小鼠,通过细胞融合和克隆筛选出稳定分泌BVDV抗体的杂交瘤细胞株,将杂交瘤细胞接种于BALB/C系小鼠的腹腔内诱生腹水,腹水单抗与BVDV均呈阳性反应.将5A9、2G3和5C2(分别结合不同的抗原结合位点)诱生的BVDV单抗纯化后等量混合包被酶标板,与鸡抗BVDV IgY(检测抗体)联合应用,建立BVDV抗原捕捉ELISA(AC-ELISA)方法.采用方阵滴定法确定单抗、鸡抗BVDV IgY的最适工作浓度,用阴性组织样品作为判定检测结果的D490临界值,最后以建立的AC-ELISA检测临床粪样棉拭子27份,结果表明:该方法敏感性、特异性高,与全血病毒分离结果的符合率迭86.36%;与全血和粪样RT-PCR检测结果的符合率分别为89.47%和94.74%.阴性对照RT-PCR、病毒分离和AC-ELISA检测均为阴性.     

抗鹿源牛病毒性腹泻-粘膜病病毒特异性单克隆抗体的制备与鉴定

为建立鹿源牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)检测方法,本研究制备了抗鹿源BVDV特异性单克隆抗体(MAb)。用纯化的BVDV免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经3次有限稀释法克隆和间接ELISA法筛选,获得2株稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株2A3和4B12。通过间接ELISA检测,MAb效价为:上清液及腹水分别为1∶512、1∶640和1∶12800、1∶16000;MAb的亚类鉴定结果表明,2株杂交瘤细胞分泌的抗体亚类均为IgGl亚类;经ELISA测定,2A3和4B12与BVDVC24V株、HCV、BDV、PRV均不发生交叉反应,但与BVDVCCSYD株发生交叉反应;IFA试验结果显示,4B12和2A3与接种BVDVN71株病毒液的细胞反应产生较强的特异荧光;抗原识别位点分析结果表明,2A3和4B12两株MAb所识别的抗原位点相同。这两株MAb的获得为鹿BVDV的检测方法的建立奠定良好的基础。     

牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白的生物信息学分析及多表位筛选

本研究旨在对牛病毒性腹泻病毒（BVDV）NS3蛋白进行生物信息学分析及T细胞和B细胞表位的筛选。从GenBank数据库中找到NS3蛋白的氨基酸序列,用Expasy ProtParam在线服务器分析所得序列理化性质。使用TMHMM Server分析跨膜结构域,使用DNAStar软件预测NS3蛋白的二级结构,为了更准确地预测蛋白质的二级结构,使用SOPMA分析软件进行了二次预测。使用Phyre2在线服务器预测NS3蛋白的三级结构,并用Raswin软件标出各个元素所处的位置。使用4种预测软件（BCPREDS、ABCpred、BepiPred和SVMTriP）分析NS3蛋白的线性B细胞表位,使用NetMHCⅡpan预测CD4⁺ T细胞表位,使用NetBoLApan和IEDB预测CD8⁺ T细胞表位,将所得到的结果进行T细胞和B细胞表位筛选。结果表明,NS3蛋白质由683个氨基酸组成,分子质量为75 ku,理论等电点（pI）为8.31,化学式为C₃₃₄₇H₅₃₄₆N₉₁₆O₁₀₀₉S₂₈,不稳定系数为35.93,平均亲水性（GRAVY）值为-0.267,表明NS3为稳定性亲水蛋白质。TMHMM结果显示,NS3蛋白不具有跨膜结构域。SOPMA结果表明,在NS3蛋白的二级结构中,α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲分别约占30.75%、22.55%、8.35%和38.35%,用DNAStar软件分别标出了α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲所处的位置。运用4种不同的B细胞预测软件筛选出8个线性表位：12-16、289-298、349-360、394-407、421-432、489-498、515-525和665-679位氨基酸。用NetMHCⅡpan筛选出4个T细胞表位：248-262、315-320、400-414和482-496位氨基酸。本研究为BVDV NS3蛋白优势抗原的筛选提供了理论依据。     

日本乙型脑炎病毒抗NS3和NS5蛋白单克隆抗体的制备

本研究在大肠杆菌中表达了日本乙型脑炎病毒(JEV)非结构蛋白NS3和NS5,并纯化NS3和NS5蛋白,免疫小鼠获得脾淋巴细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合筛选得到2株抗NS3蛋白单克隆抗体1H7和2D4,3株抗NS5蛋白单克隆抗体3C4、3H7和3F10。试验通过酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western blotting和间接免疫荧光检测(IFA)检测了单克隆抗体的活性。结果显示,所有的单克隆抗体1∶100稀释进行IFA和1∶500稀释进行Westernblotting时均具有高特异性和高敏感性。抗JEV NS3和NS5蛋白单克隆抗体的成功制备为进一步研究JEV的蛋白结构和致病性奠定基础。     

抗牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的制备及双抗夹心ELISA检测方法的建立

为建立牛病毒性腹泻病毒(BVDV)双抗夹心ELISA检测方法,本研究将BVDV 890病毒株(BVDV-2)浓缩并纯化后免疫BALB/c小鼠,经常规技术进行细胞融合并筛选得到一株稳定分泌IgG的杂交瘤细胞株,命名为3F9。以BVDV单克隆抗体(MAb)IgM为捕获抗体,生物素标记的3F9为检测抗体,初步建立BVDV特异的双抗体夹心ELISA检测方法(BAS-ELISA)。采用建立的BAS-ELISA方法检测35份临床病牛血清样品,检出阳性样本13份;与RT-PCR的符合率达到94.29%;表明本研究所建立的BAS-ELISA方法可用于BVDV感染的临床诊断,为BVDV的免疫学研究奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白研究进展

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是引起牛病毒性腹泻-黏膜病(BVD-MD)的病原,感染后可造成牛腹泻、流产、繁殖障碍、持续感染等症状,且急性BVD致死率较高,对我国乃至世界养牛业造成了严重影响。目前,国内外对BVDV的研究主要聚焦在其结构蛋白方面,对于在BVDV复制、转录、翻译中起重要作用的非结构蛋白的研究较少,缺乏对BVDV非结构蛋白的功能进行系统的总结。论文对BVDV非结构蛋白功能方面近年来的研究进展进行了汇总,以期对今后牛病毒性腹泻黏膜病的致病机制、诊断及预防提供参考。     

牛病毒性腹泻病毒基因组结构与蛋白功能研究进展

牛病毒性腹泻病毒为黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的代表种,这个属的成员中还包括羊边界病毒(BDV)和猪瘟病毒(CSFV)。病毒基因组为单股正链RNA。论文就牛病毒性腹泻病毒已定位的4种结构蛋白、8种非结构蛋白以及3′和5′非翻译区的基因结构特征及其编码蛋白的合成与功能研究进行了综述,为牛病毒性腹泻的防控和疫苗研制提供参考。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的多克隆抗体制备及鉴定

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组E2蛋白的兔源多克隆抗体,本研究利用表达BVDV E2蛋白的重组质粒pET30a-E2转化E.coli BL21(DE3),经诱导表达获得重组E2蛋白。Western blot检测显示纯化蛋白能够与BVDV参考阳性血清反应。以纯化的重组E2蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,病毒中和试验测定其中和效价为1:2048,间接免疫荧光和western blot试验表明其具有良好的反应性和特异性。本研究制备的BVDV重组E2蛋白兔源多克隆抗体可应用于BVDV的检测,同时为进一步建立检测BVDV E2蛋白的ELISA方法奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

采用RT-PCR扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白基因并克隆至原核表达载体pET-28a,转化到宿主表达菌BL21后经IPTG诱导表达和Ni柱纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组N蛋白,其大小约为58 ku。将纯化重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞融合,PEDV间接ELISA方法筛选,制备获得4株能稳定分泌PEDV抗体的杂交瘤细胞株1C9、4C8、4F8和6A11。Western blot和间接免疫荧光试验证明其与PEDV均有特异性反应,单抗亚类鉴定均属于IgG1,轻链为κ型。杂交瘤细胞培养上清ELISA抗体效价为1∶1 600~6 400,腹水ELISA抗体效价达1∶1.024×105以上;4株细胞连续培养20代,其ELISA抗体效价基本一致。本研究为PEDV感染的诊断和致病机制研究提供了有用工具。