GFLVCP 基因 RNAi 载体构建及其在转基因烟草中的干涉效果

为探讨RNAi策略在抗GFLV基因工程中的效果,通过RT-PCR克隆获得了310 bp的GFLV外壳蛋白基因保守片段,采用Gateway技术将该基因片段连入目标载体pHELLSGATE12构建了RNAi植物表达载体,并通过农杆菌介导法转入烟草中,RT-PCR检测表明目的基因片段已整合到烟草基因组中并在RNA 水平上得到表达,病毒接种结果显示阳性植株的发病率明显低于对照,说明在转基因植株中dsRNA表达可干涉GFLV侵染过程。     

大豆FAD2-1b 基因沉默载体的构建

旨在培育生物安全的转基因大豆。设计引物、采用RT-PCR从高蛋白大豆品种‘黑农35’中克隆大豆种子特异表达启动子GY1;从高油大豆‘黑农37’中克隆FAD2-1b基因内含子1;从5个转基因受体大豆品种中克隆FAD2-1b基因片段,作为正向臂和反向臂。连接这些目的片段,构建筛选标记基因为bar,启动子为GY1,内含子为FAD2-1b基因内含子1的双T-DNA载体。将双T-DNA载体转化大肠杆菌DH5α,扩增得到的重组质粒经酶切和序列分析鉴定正确,命名为pDT-FAD2I。本研究构建了针对大豆FAD2-1b基因的沉默载体,为进一步获得FAD2-1b基因沉默大豆,培育转基因安全的高品质大豆奠定了基础。     

叶用莴苣无缝克隆构建LsE3基因过表达载体和新RNAi载体及遗传转化体系优化

研究旨在应用新技术和新载体构建过表达和沉默载体,优化遗传转化体系,验证生菜LsE3基因功能,探究高温抽薹机制.以pCAMBIA1304和pFGC5941载体为材料,通过无缝克隆构建叶用莴苣转基因载体,并通过筛选培养基配方优化遗传转化体系.试验成功地以pCAMBIA1304为基础,插入源自pFGC5941的dsRNA表达...     

水稻苗期低温诱导表达新基因OsCOI的克隆、过表达载体的构建与转化

水稻苗期冷害是导致水稻减产的重要因素之一。为了发掘新的耐冷基因、诠释其耐冷分子机制并应用分子育种的手段提高水稻苗期耐冷性,前期已通过Northern表达分析,从已构建的水稻苗期低温诱导表达正向抑制差减cDNA文库中,发现了一个受低温诱导上调表达的功能未知的C2H2型锌指结构域蛋白新基因(特命名为OsCOI)。本研究进一步通过RT-PCR的方法从水稻中克隆了该基因,构建了其植物过表达载体,并通过农杆菌介导转入水稻基因组中,获得了其过表达转基因水稻株系,为进一步研究该基因的功能并探讨其在水稻耐冷分子育种中的应用价值奠定了基础。     

Rubisco小亚基基因片段的亚克隆及其瞬时表达载体的构建

1,5一二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶位于植物叶绿体中,是绿色植物中含量最丰富的蛋白,它催化CO2固定和光呼吸作用的第一步。从含Rubisco小亚基基因片段的pGR107-rbcS质粒中亚克隆出Rubisco小亚基基因片段,将PCR产物与pGEM-T：Easy载体连接,用EcoRI酶切鉴定酶切重组载体,利用低溶点胶回收大约300bp大小的Rubisco小亚基基因片段,将其回收片段与pSLJ75515瞬时表达载体连接,用EcoRI酶切鉴定,筛选出阳性重组体,即为pSLJ75515-rbcS瞬时表达载体。本实验为进一步研究Rubisco小亚基基因功能和基因沉默机制奠定了基础。     

HA标签的水稻水孔蛋白OsPIP2;7基因植物双元表达载体构建及转基因水稻的获得

为研究水稻水孔蛋白OsPIP2;7基因在非生物胁迫中的生物学功能,根据OsPIP2;7基因序列设计特异性引物,以水稻品种中花11的三叶龄叶片RNA反转录的cDNA第一链为模板,克隆OsPIP2;7。采用嵌套PCR的方法,将3×HA标签的碱基序列连接在去除终止子OsPIP2;7基因序列的3′端,然后将此核酸片段插入到植物双元表达载体pHB中,构建pHB-OsPIP2;7-3×HA载体。以中花11成熟胚愈伤组织为材料,采用农杆菌介导的方法进行遗传转化,经过在含有潮霉素的培养基上筛选和分化,获得阳性转化子。提取转基因植株的DNA,进行潮霉素阳性植株的筛选。将阳性植株进行RNA表达检测,获得OsPIP2;7基因表达量上升的转基因阳性植株。为了检测转基因植株中OsPIP2;7蛋白的表达情况,提取OsPIP2;7基因表达上升的转基因植株膜蛋白后,用HA抗体进行杂交的Western-blot检测结果显示,OsPIP2;7-HA蛋白在转基因阳性植株体内过量表达。获得的过表达OsPIP2;7转基因新材料,将为研究OsPIP2;7基因的生物学新功能提供试验基础。     

同源重组快速构建百合LCHS2基因RNAi表达载体及其鉴定

为探讨CHS基因的下调表达对花朵着色的影响以及为百合观赏性状遗传改良提供技术支持,利用基于同源重组原理的Gateway技术,根据课题组从东方百合‘索邦’分离的LCHS2基因序列(Genbank登录号:GQ483376)和pENTR/D-TOPO载体要求,设计上游5'端添加'CACC'的一对特异引物,PCR扩增获得636 bp的干扰片段。通过TOPO克隆,将该片段克隆入载体pENTR/D-TOPO构建入门克隆载体pENTR/D-CHS,测序结果显示,与原序列同源性为100%。再经过LR反应使pENTR/D-CHS上的干扰片段替换掉目标载体pHellsgate12上的ccdB片段,快速构建了包含LCHS2基因干扰片段的RNAi表达载体pH12-CHSi,经限制性内切酶XhoI、XbaI酶切鉴定获得724 bp和722 bp的片段,与预期结果一致。pH12-CHSi电击法转化农杆菌GV3101,菌液PCR鉴定,出现636 bp的目的条带,表明RNAi表达载体pH12-CHSi已成功转入农杆菌。     

高温胁迫对水稻光合PSII系统伤害及其与叶绿体D1蛋白间关系

以水稻结实期的人工控温试验测定不同温度处理下水稻旗叶光合速率、叶绿素荧光参数的动态变化,并结合Western印迹与胶体金标记技术对叶肉细胞类囊体膜中D1蛋白的表达检测与活性定位,探讨了高温胁迫对D1蛋白存在形态与活性分布的影响,以及D1蛋白表达与叶片光合速率、PSII荧光参数的联系。结果表明,高温处理下叶片净光合速率下降、PSII潜在活性(F_v/F_o)和PSII光能转化效率(F_v/F_m)降低,且随着高温胁迫时间的持续和叶片功能的衰退,类囊体膜结构损伤越严重,光能转化效率越低;在D1蛋白的两类存在形态中,非磷酸化D1蛋白和磷酸化D1蛋白在高温胁迫下的表达量均有所下降,但前者下降更明显;高温处理下控制D1蛋白表达的叶绿体psbA基因在转录水平呈下调表达,使D1蛋白合成及周转过程受到抑制,进而类囊体膜PSII反应中心的功能受损与叶绿体光合效率下降,揭示高温胁迫对叶片PSII系统的伤害受D1蛋白磷酸化过程和psbA基因表达变化的共同作用,进而影响不同水稻品种在高温胁迫下的光合速率和耐热性。     

转基因水稻恢复系及其F1代Bt蛋白的时空表达分析

本研究以抗虫水稻恢复系9311(Bt)及其杂交种F1(Bt)为研究材料,以非转基因的9311为阴性对照,利用ELISA方法研究9311(Bt)及F1(Bt)各生育时期可溶性总蛋白和Bt蛋白的时空变化规律,为转Bt基因抗虫水稻的安全监管提供科学依据。结果表明：外源基因的导入没有引起水稻组织中可溶性总蛋白含量的明显变化;9311(Bt)的Bt蛋白表达量在整个生长周期的各个部位均高于相应的F1(Bt)植株;同一植株不同组织器官中Bt蛋白表达量为：叶片跃胚乳跃颖壳及茎秆跃根;同一植株不同发育期叶片Bt蛋白的测定结果整体表现为：营养生长阶段跃生殖生长阶段跃成熟衰老阶段。研究结果为转Bt基因抗虫水稻适宜检测时期的选择提供了一定的参考。     

水稻编码SAND结构域基因的序列与功能初步分析

为研究水稻SAND结构域蛋白的序列和功能,利用Blast在水稻基因组中搜索编码SAND结构域的基因,然后构建增强表达载体并通过遗传转化研究基因功能。结果表明,水稻基因LOC_Os01g57240(命名为OsULT1)编码的氨基酸序列含有SAND结构域和ULTB-box共有序列,与其他植物ULT氨基酸序列相似性为49.3%~92.3%,具有较好的保守性;35S::OsULT1转基因株系部分颖花发育异常,出现内稃发育滞缓或退化、浆片过度发育或数目变多、雄蕊数目3~7枚、雌蕊2枚的现象;颖花内产生多余的小花,表明OsULT1对水稻花分生组织正常分化具有重要的调控作用。     

水稻籽粒氮代谢几个关键酶对花后高温胁迫的响应及其与贮藏蛋白积累关系

以早籼水稻嘉935和嘉353为材料,利用人工气候箱设高温(32℃)和适温(22℃)处理,探讨了高温对水稻籽粒氮代谢关键酶活性的影响及其与籽粒粗蛋白含量和各种氨基酸组成间的关系,并结合荧光定量PCR对水稻籽粒谷氨酰胺合成酶(GS) 2个同工型基因的表达及其温度响应进行了检测分析。结果表明,花后高温处理对谷草转氨酶(GOT)和谷丙转氨酶(GPT)的影响基本一致,均表现灌浆前期升高、后期下降的趋势,但花后高温处理下水稻籽粒中粗蛋白总量和各类氨基酸含量的增加,并不一定是其籽粒氮素物质的转运能力和蛋白质合成能力的增强所致;谷氨酰胺合成酶(GS)在高温处理下的生理活性普遍高于其相应时期的低温处理,其中,GS2是GS基因在水稻胚乳中高表达的一种同工型,在水稻灌浆后期的表达量甚至超过GS1,高温胁迫处理会通过改变GS1和GS2基因在籽粒中的转录水平,从而对水稻籽粒灌浆中后期的GS活性产生调控。     

水稻早衰突变体esl2的遗传分析和基因定位

利用EMS诱变水稻籼型恢复系缙恢10号, 从其后代中鉴定出一个早衰突变体esl2, 苗期正常, 孕穗期开始叶尖和叶缘黄化衰老。与野生型相比, 孕穗期和抽穗期光合色素含量均显著下降, 抽穗期倒一叶的超氧化酶歧化酶(SOD)活性、可溶性蛋白(SP)含量降低, 活性氧(ROS)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)和脯氨酸(PRO)含量或活性增加。超微结构观察表明, esl2衰老部位的细胞多中空且形状不规则, 伴随细胞裂解、细胞质溶解等特征; 同时, 叶绿体结构异常, 叶绿体膜溶解、基粒模糊, 基质片层疏松, 类囊体发育异常。遗传分析表明, 该突变体受一对隐性核基因调控。利用1 005株西农1A/esl2的F₂隐性定位群体, 最终将Esl2定位在第4染色体SSR标记RM17122和swu4-13之间, 物理距离约244 kb, 这为Esl2基因的克隆和功能研究奠定了基础。     

水稻叶片灰白转黄突变体pyr1的鉴定与基因定位

鉴定和克隆叶色突变基因对于深入了解叶绿素合成、降解途径的关系以及植物的光合作用有着重要的作用。从EMS诱变恢复系缙恢10号后代中鉴定出1个灰白转黄突变体pyr1,该突变体在苗期部分死亡,整张叶片呈现灰白色,在不同的生育时期叶片呈现不同的颜色,直到孕穗期叶片上部和叶缘表现黄色。苗期到抽穗期突变体叶绿素含量比野生型显著或极显著降低。透射电镜观察表明,突变体与野生型细胞结构无明显差异,但叶绿体发育异常,内部大量降解,基质片层退化。遗传分析表明该性状受1对隐性基因控制,利用326株F₂隐性定位群体将PYR1基因定位在第1染色体长臂上,位于标记RM11722和Ind1之间,物理距离约92 kb,本研究为PYR1基因的图位克隆奠定了基础。     

甘蓝型油菜含MATH结构域基因BnMT-1干扰载体的构建及遗传转化

本研究以甘蓝型油菜湘油15种子不同发育时期抑制差减文库为研究对象,设计特异性引物扩增得到一个与油脂代谢相关,含MATH结构域的基因片段,长度为327bp,命名为BnMT-1。根据RNA干扰的基本原理,将目的片段正反向插入到表达载体pFGC5941.nap查尔酮内含子两侧,经限制性内切酶酶切和质粒PCR扩增检测,证明已成功构建了干扰载体PP-MT。采用根癌农杆菌法将PP-MT干扰载体转入甘蓝型油菜中,对转化植株基因组DNA的PCR检测表明,干扰载体已转入到甘蓝型油菜中,共获得了两株转基因植株。这为进一步研究BnMT-1基因在甘蓝型油菜中的功能打下了基础。     

水稻OsNCED4基因的克隆及功能初探

脱落酸(abscisic acid,ABA)是一种抑制植物生长的植物激素,因能促使叶子脱落而得名,在植物逆胁迫中发挥关键作用。由NCED基因编码的9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED),是ABA在高等植物中的关键酶。本研究已成功从水稻Ilmibyeo(O.sativa L.ssp.japonica)基因组中克隆得到Os NCED4,生物信息学分析表明,Os NCED4基因位于水稻第7号染色体上,ORF全长1749 bp,无内含子结构,编码582个氨基酸,具有NCED家族的RPE65保守结构;以该基因和其启动子序列构建组织表达载体pOsNCED4::GUS、pCaMV35S::OsNCED4:EGFP和RNAi干扰载体p Ca MV35S::OsNCED4:RNAi,用于基因表达和功能分析,并利用农杆菌介导的方法,成功获得了相应遗传载体的转基因植株;GUS染色结果表明,该基因在叶片、叶耳、小穗等组织部位均有表达;RT-PCR结果显示,Os NCED4在水稻不同生育期的根、茎、叶、叶鞘和穗子中均有不同程度的表达,但表达量具有明显的差异;亚细胞定位结果显示,OsNCED4基因编码的蛋白定位于细胞核;与野生型植株相比,RNAi植株的花粉育性无明显差异,而结实率显著下降。该研究结果为进一步研究水稻OsNCED4基因表达的调控,以及为水稻生长发育上的功能研究提供了科学依据。     

紫外线(UV-B)照射对水稻产量及稻米蛋白质含量的影响

以抗紫外线UV-B的日本粳稻品种Sasanishiki为材料,1999年和2000年在大田条件下,探讨了不同生育时期的UV-B处理对水稻产量、糙米的大小及蛋白质含量的影响.结果表明,营养生长期(移栽至幼穗分化)、生殖生长期(幼穗分化至抽穗)及抽穗成熟期的UV-B处理对Sasanishiki的产量及其构成因素的影响不显著;生殖生长期(幼穗分化至抽穗)与     

水稻(Oryza sativa L.)捕光叶绿素a/b结合蛋白基因全长cDNA的克隆和特性分析

根据捕光叶绿素a/b结合蛋白基因（cab）家族中的保守序列设计PCR引物,扩增出的约310 bp cDNA小片段为分子杂交探针,对构建的水稻cDNA文库进行杂交筛选,并结合PCR分析确定阳性克隆中cDNA片段的大小。通过对插入的cDNA片段最长的阳性克隆进行测序分析验证,克隆了水稻中1个cab基因全长cDNA,命名为cab-n8（GenBank登记号：AY     

水稻开花期花粉活力和结实率对高温的响应特征

采用远红外增温设施在水稻开花第1 d分别对4个水稻品种（南粳41、武香粳14、扬粳6号和汕优559）进行5 h（10:00~15:00）高温处理（40℃）,然后转入常温,观测当天及其后4 d开花颖花的花粉活力及同期开花颖花成熟期的结实对高温的响应特征。结果表明,高温处理后,处理后各天颖花的花粉活力均显著下降（P< 0.05）,但随开花日序的后移其下降幅度逐步减小。其中,下降最大为处理当天或其后1 d,花粉在柱头和培养基上的萌发率以及花粉I-KI溶液的可染率分别平均降低了16.00、25.85和11.74个百分点,而处理后4 d的降幅仅为8.49、6.63和6.02个百分点。相同的趋势也表现在同期开花颖花的结实特征上,高温处理的当天和其后4 d开花颖花的结实率分别平均下降了14.04和5.95个百分点;而高温处理当天的空粒率和秕粒率平均分别提高了10.06和3.98个百分点,处理后4 d分别提高了3.98和1.97个百分点。另外还发现,高温处理下品种间存在一定差异,其中,汕优559的花粉活力和籽粒结实受高温的影响最小。相关分析发现结实率、空粒率和秕粒率与柱头花粉的萌发率、花粉在培养基上的萌发率均呈显著直线相关,而花粉I-KI溶液的可染率仅与空粒率存在显著相关（P< 0.05）。可见,水稻遭遇短期高温后,随着开花日序的后移高温对颖花形成的潜在热害逐渐降低,在生产实践中花粉在柱头和培养基上的萌发率可作为品种选育和高温热害发生的几率、热害程度预测的可靠指标。