甘蓝型油菜FAD2基因调控序列的克隆及瞬时表达分析

油酸去饱和酶FAD2（fatty acid desaturase 2）是广泛存在于植物中的一种能催化油酸脱氢生成亚油酸的还原酶。根据GenBank上已知的甘蓝型油菜FAD2基因设计引物,以甘蓝型油菜（Brassica napus L.）叶片总DNA为模板,进行TAIL-PCR扩增,获得约1.4 kb片段并测序。序列比对结果说明该片段为已知的FAD2基因编码区上游序列。将该片段进行不同长度的5′端缺失,并用缺失后的序列替换pBI221-LUC质粒上的CaMV35S启动子,构建了甘蓝型油菜瞬时表达载体,进行油菜原生质体瞬时表达的初步研究,结果表明该序列5′端-669 bp至-1019 bp对报告基因表达水平有较大的影响。结合启动子预测分析结果,此片段中可能存在的赤霉素应答元件、光调控元件等顺式作用元件对FAD2基因的表达调控具有重要作用。     

基因枪法向甘蓝型油菜转移反义FAD2基因的研究

为了获得高油酸油菜品种,以湘油15号子叶柄为受体材料,用基因枪法,将反义油酸脱饱和酶FAD2基因连在种子特异表达载体上后导入油菜,使用可裂膜压力7700kPa,样品室真空度9.5×104Pa,质粒质量浓度为1.0μg/μL,靶距9cm,通过对子叶柄的预处理48h,高渗处理1h,获得8株再生植株.经PCR与PCR-Southern杂交检测,其中有2株为转化株,证明反义FAD2基因已整合到湘油15号基因组中.     

甘蓝型油菜FAD2基因cDNA片段的克隆和序列分析

为了提高油菜的油酸含量，继而培育高油酸油菜品种，从甘蓝型油菜成熟叶片中分离总RNA，经反转录合成cDAN第一条链，以此为模板进行多聚酶链式反应，产物为一长654bp的DNA片段，经克隆和序列测定表明，其核苷酸序列与GenBank中甘蓝型油菜FAD2基因在比较区的同源性达100％。     

红花油酸去饱和酶基因的克隆及序列分析

【目的】对红花油酸去饱和酶FAD2基因进行克隆和生物信息学分析,为深入研究该酶的功能提供理论依据。【方法】提取红花种子总RNA,通过RT-PCR方法进行反转录,PCR扩增得到FAD2基因全长cDNA序列。运用生物信息学方法,对红花FAD2氨基酸序列的理化性质、系统进化、蛋白定位和跨膜区域等进行预测和分析。【结果】成功克隆获得了红花FAD2基因,其开放阅读框cDNA长1 140bp,编码380个氨基酸,预测分子质量43.6ku,理论等电点8.37,带有正电残基(强酸性)30个、负电残基(强碱性)34个。FAD2蛋白含有3个极度保守的His-Box,不存在明显的信号肽,存在6个跨膜结构域,与疏水区域预测结果一致。红花FAD2核苷酸的分子进化树分析显示,其与日本栽培稻的亲缘关系较近。红花FAD2氨基酸序列比对结果表明,不同植物的FAD2具有较高的同源性,同源性平均达72.94%。【结论】成功克隆了红花FAD2基因,并对其编码的蛋白进行了生物信息学分析。     

棉花FAD2-1基因的克隆及其ihpRNA和amiRNA干扰载体的构建(英文)

采用RT-PCR方法克隆了棉花-12脂肪酸去饱和酶基因(GhFAD2-1)的cDNA全长序列,该基因含有1158bp的完整开放阅读框。棉花FAD2-1是种子中编码催化油酸形成不饱和脂肪酸的关键酶的基因,选取GhFAD2-1基因中的一段特异的515bp片段,构建了种子特异性启动子NAPIN调控的ihpRNA干扰表达载体,pFGC1008-NAPIN-FAD2-1,同时构建了针对GhFAD2-1基因的人工miRNA表达载体pCAMBIA1302-amiRNA-FAD2-1。     

玉米ZmCKX1基因的克隆及功能分析

利用RT-PCR技术,从玉米自交系郑58中克隆了编码细胞分裂素氧化酶1的基因(Zm-CKX1),该基因阅读框全长为1 608bp,编码535个氨基酸,蛋白质分子量为57kD,理论等电点pI=5.22。该基因与TaCKX1、AtCKX在核苷酸水平上同源性分别为69%、49%。通过实时荧光定量PCR的方法对该基因的表达模式进行了分析,结果表明,在玉米雌穗中随着授粉时间的延长,ZmCKX1基因表达量逐渐升高,并且ZmCKX1基因在郑单958及其亲本、安玉5号及其亲本雌穗中的表达量明显不同,表现为超低显性表达模式。因此推断,ZmCKX1基因可能是一个与杂种优势相关的基因。     

油用向日葵脂肪酸脱氢酶基因FAD2-1的克隆与表达分析

为了解FAD2-1基因在油用向日葵品质形成过程中的作用,以油用向日葵为材料,利用RT-PCR方法对高含油率保持系材料改HA89(含油率为46%)和低含油率保持系材料86-1(含油率为38%)的脂肪酸脱氢酶基因FAD2-1进行克隆与表达分析。结果表明:获得了脂肪酸脱氢酶基因FAD2-1全长cDNA编码序列,全长为1 137bp,编码378个氨基酸。核苷酸序列和蛋白序列比对结果表明,该基因在这2份材料中第44位和第102位核苷酸存在差异,并且都导致了氨基酸的改变。种子发育不同阶段油酸和亚油酸积累动态分析和qRT-PCR研究结果表明,FAD2-1基因表达量变化趋势与亚油酸含量变化趋势基本一致,而与油酸含量变化趋势基本相反。     

杉木蔗糖转运蛋白SUT基因的克隆和功能分析

蔗糖转运蛋白又称蔗糖-质子共转运蛋白,简称SUT(sucrose transporter)或者SUC(sucrose carriers),主要担负植物光合产物——蔗糖的跨膜运输与分配调控,在植物体内完成使蔗糖从“源”到“库”的运输。采用CTAB法提取杉木总RNA,通过RT-PCR得到cDNA,设计基因特异性引物,从1年生无性系杉木幼苗嫩叶中克隆SUT基因,并利用生物信息学方法分析SUT的基本结构、进化关系、理化性质。结果表明,在电泳图上总RNA的结构完整,28 S的亮度约为18 S的2倍;A260/A280为2.20,A260/A230为2.31;杉木SUT基因编码区全长为1 782 bp,共编码593个氨基酸,是具有SUT基因家族的典型12个跨膜区;通过系统进化树的分析发现,杉木SUT与无油樟SUT的亲缘性较高,SUT蛋白属于疏水性蛋白。     

黄鳝脂肪酸去饱和酶及延长酶基因cDNA的克隆与表达

为了解黄鳝合成长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)的能力,利用Trizol提取黄鳝肝脏总RNA,经RT获得cDNA,基于脂肪酸去饱和酶(FAD)及延长酶(FAE)基因同源系列设计简并引物进行黄鳝cDNA的PCR扩增、测序,获得黄鳝FAD及FAE基因部分片段序列。然后分析黄鳝FAD及FAE的同源性和系统进化情况及黄鳝胚胎和胚后发育期仔鱼该两个基因的表达水平。结果表明:黄鳝FAD与军曹鱼的△6去饱和酶同源性高达85%,其次是大菱鲆(83%),FAE与军曹鱼、线鳢、澳大利亚金枪鱼等的同源性高达89%;但FAD和FAE在系统发育树中均自呈一支。FAD和FAE基因在黄鳝胚胎和胚后发育阶段均有表达,以出膜后2～4 d表达量最高。提示黄鳝具有合成LC-PUFA的能力,但不同发育阶段合成能力不同。     

大豆水杨酸结合蛋白基因GmSABP2的克隆及功能分析

【目的】对大豆（Glycine max）水杨酸结合蛋白基因GmSABP2进行克隆与表达分析,并转化拟南芥进行耐盐、耐干旱分析,进一步了解该基因耐盐、耐干旱的分子机制。【方法】以拟南芥SABP2为探针,搜索大豆基因组数据库,从中挑选出同源性最高的序列,将其命名为GmSABP2。利用电子克隆技术,从大豆叶子中克隆得到大豆水杨酸结合蛋白基因GmSABP2。通过DNAMAN程序进行氨基酸的多序列比对,利用NCBI的CD-search进行氨基酸的保守结构域分析,应用MEGA程序进行系统进化树分析。对大豆幼苗进行盐和干旱胁迫处理来分析其在胁迫下的表型变化。通过Real time-PCR分析大豆幼苗在盐和干旱处理条件下GmSABP2的表达特性。利用Gateway技术构建植物表达载体pEarleyGate103-GmSABP2,转入根癌农杆菌EHA105,利用蘸花法侵染拟南芥,经抗性筛选得到转基因株系。对野生型植株和转基因植株进行盐和干旱胁迫处理,并统计在胁迫条件下两者的种子萌发率、主根长和成熟植株的存活率。【结果】克隆得到GmSABP2的cDNA序列,序列全长1 235 bp,其开放阅读框为786 bp,编码261个氨基酸,分子量为29.15 kD,等电点为5.58。氨基酸序列比对发现大豆和毛白杨、可可以及烟草相似度较高。利用NCBI的CD-search发现大豆SABP2序列中存在一个Abhydrolase_6（pfam：12697）水解酶保守结构域。大豆SABP2蛋白属于α/β水解酶超家族。应用MEGA程序构建多物种的系统发生树,发现大豆和毛白杨及可可亲缘关系较近,而与拟南芥亲缘关系较远。对大豆幼苗胁迫后的表型分析发现,在盐和干旱条件下大豆幼苗均受到明显的胁迫效应。Real time-PCR分析表明大豆幼苗叶子中的GmSABP2在盐和干旱处理条件下均上调表达。拟南芥耐逆性分析发现,在正常培养条件下,野生型植株和转基因株系均能正常萌发、生长。在高盐（150 mmol·L^-1 NaCl）处理条件下,野生型植株的种子萌发率为38%,12 d大小幼苗主根长为0.4 cm,成熟植株的存活率为49%;转基因株系的种子萌发率为67%,12 d大小幼苗主根长为1.1 cm,成熟植株的存活率为78%。在模拟干旱（20% PEG6000）处理条件下,野生型植株的种子萌发率为31%,12 d大小幼苗主根长为0.5 cm,成熟植株的存活率为36%;转基因株系的种子萌发率为57%,12 d大小幼苗主根长为1.0 cm,成熟植株的存活率为66%。【结论】GmSABP2在拟南芥植株对盐和干旱的抗性中有一定的作用。     

甘蓝型油菜PEP转运子BnPPT1基因的克隆、序列分析和表达模式

磷酸烯醇式丙酮酸/磷酸转运子基因(Phosphoenolpyruvate/phosphate translocator 1, PPT1) 是细胞质体碳水化合物转运的一个关键基因,在植物莽草酸代谢和脂肪酸生物合成途径中起着重要作用。根据十字花科拟南芥PEP转运子AtPPT1基因序列与油菜数据库BBSRC Brassica DB中相应ESTs设计全长引物,以甘蓝型油菜(Brassica napus) 幼嫩叶片基因组DNA和种子cDNA为模板,克隆到了甘蓝型油菜PEP转运子基因全长序列,命名为BnPPT1。该基因基因组gDNA全长为2 075 bp,含有8个内含子,编码区长度为1 224 bp,编码407个氨基酸。序列比对结果表明,BnPPT1与同属于十字花科拟南芥AtPPT1转运子同源性很高,仅有个别氨基酸的差异。进一步采用半定量RT-PCR分析表明,BnPPT1基因在油菜各器官中表达差异很大,在幼嫩的子叶和茎中有较高丰度的表达,在中早期发育的种子中表达丰度逐步升高,种子成熟后期没有表达,暗示该基因在油菜籽粒中油份等物质积累中有重要功能。     

甘蓝型油菜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因BnNHX2的电子克隆与序列分析

盐胁迫是造成油菜产量下降的重要环境因子之一。Na^＋／H^＋逆向转运蛋白（Na^＋／H^＋ antiporter,NHX）基因是目前世界植物耐盐性研究领域中最热门的基因,油菜NHX基因的克隆对提高油菜耐盐性的转基因育种意义重大。本研究利用电子克隆的方法,获得1个新的甘蓝型油菜NHX基因BnNHX2的全长cDNA,含有一个长为1629bp的开放阅读框架,编码542个氨基酸,分子质量约59．9ku。生物信息学分析表明,BnNHX2蛋白属于跨膜蛋白,有12个跨膜区,是植物NHX超家族中的一员。通过同源比对和进化分析发现,BnNHX2基因与盐生植物盐芥ThNHXI基因高度同源,表明BnNHX2可能是油菜抵御盐胁迫的关键基因。     

文冠果FAD2的序列与功能分析

脂肪酸脱饱和酶2(fatty acid desaturase 2, FAD2)基因是油脂合成代谢的关键酶基因,其编码的蛋白催化油酸(18∶1)进一步脱饱和形成亚油酸(18∶2)。本研究以富含油酸和亚油酸2种优质不饱和脂肪酸的文冠果种胚为试材,采用简并引物策略结合RACE技术,克隆了文冠果FAD2的cDNA序列。序列分析表明,文冠果FAD2除具有植物FAD2特有的3个组氨酸区和N端的芳香族氨基酸区外,还具有3个N—糖基化位点和多个磷酸化位点。通过农杆菌介导,将文冠果FAD2转入拟南芥fad2突变体中进行表达分析。气相结果表明,拟南芥fad2突变体缺失亚油酸,而转入文冠果FAD2的拟南芥fad2突变体的种子油中产生了亚油酸,这表明所克隆的文冠果FAD2基因编码的酶具有催化油酸(18∶1)脱饱和成为亚油酸(18∶2)的活性。      

甘蓝型油菜WRI1基因cDNA的克隆与序列分析

通过RT–PCR方法克隆了甘蓝型油菜湘油15号5个WRI1基因cDNA。测序结果显示,BnWRI1–1大小为1 248 bp,BnWRI1–2和BnWRI1–3大小为1 254 bp,BnWRI1–4、BnWRI1–5大小为1 242 bp;聚类分析结果显示,所克隆WRI1基因cDNA在进化关系上属于AP2/ERF转录因子家族,同拟南芥AtWRI1(At3G54320)同处1个分支,并且所克隆基因cDNA来自甘蓝型油菜不同的基因组;通过核苷酸序列比对分析,得到所克隆WRI1基因cDNA单核苷酸变异位点40个;特异性酶切位点分析显示,来源于A基因组的BnWRI1–1、BnWRI1–2、BnWRI1–3第892位与来源于C基因组的BnWRI1–4和 BnWRI1–5第880位的核苷酸发生变异,导致Bcl I识别位点的变化;酶切试验结果表明,采用BclI酶可区分甘蓝型油菜的AtWRI1–like WRI1 基因的A或C 基因组来源。     

芜菁花粉发育相关基因BcMF2r的分子克隆及其生物信息学分析

根据白菜花粉特异的多聚半乳糖醛酸酶基因BcMF2的全长序列设计引物,通过PCR直接扩增的方法从'温州盘菜'芜菁(Brassica campestris L. spp. rapifera cv. Wenzhoupancai)中克隆到了BcMF2的同源基因,命名为BcMF2r.经与白菜BcMF2基因序列比较,DNA全长序列相似性高达90%.Blast搜索结果表明,BcMF2r与拟南芥外切多聚半乳糖醛酸酶在氨基酸水平的的相似性为87%,推测BcMF2r属于多聚半乳糖醛酸酶基因.BcMF2r基因最大开放阅读框为1263 bp,编码420个氨基酸序列,编码的蛋白质分子量为43.8 kDa,等电点为8.108;碱性氨基酸(K, R) 36个;酸性氨基酸(D, E) 32个;疏水氨基酸(A, I, L, F, W, V)152个;极性氨基酸(N, C, Q, S, T, Y)113个.推导的氨基酸序列通过Prosite数据库查询,发现该序列包括3个N-糖基化位点,4个蛋白激酶C磷酸化位点,6个酪蛋白激酶II磷酸化位点,12个N-豆蔻酰化位点, 1个多聚半乳糖醛酸酶活性位点(257RVTCGPGHGLSVGS)等.通过PROFsec预测BcMF2r蛋白质的二级结构,表明该蛋白含7.86% helix,46.90% sheet和45.24% loop.将BcMF2r基因氨基酸序列与数据库中的其他植物PG序列进行同源序列比对,构建系统进化树,发现该基因具有所有PG基因特有的4个保守结构域,并且与花粉中特异表达的PG基因聚为一类,进一步证明了该基因可能是与花粉发育相关的多聚半乳糖醛酸酶基因,在花粉萌发和花粉管伸长中起作用.     

Molecular cloning and functional identification of an apple flagellin receptor MdFLS2 gene

The leucine-rich repeat receptor kinase flagellin-sensing 2 gene(MdFLS2; Gene ID: MDP0000254112) was cloned from Royal Gala apple(Malus×domestica Borkh.). This gene contained a complete open reading frame of 3 474 bp that encoded 1 158 amino acids. The phylogenetic tree indicated that Prunus persica FLS2 exhibited the highest sequence similarity to MdFLS2. The PlantCare database suggests that the promoter sequence of MdFLS2 contains several typical cis-acting elements, including ethylene-, gibberellin-, salicylic acid-, and drought-responsive elements. Quantitative real-time PCR analysis showed that MdFLS2 was widely expressed in the different tissues of the apple and most highly expressed in the leaves. Furthermore, MdFLS2 was significantly induced by the flagellin elicitor peptide flg22. Treatment of the apple seedling leaves with flg22 resulted in an increase in leaf callose levels with increased treatment duration. An increase in the production of O~(2–) along with the expression of disease-related genes was also observed. An oxidative burst was detected in the treated seedlings, but not in the control seedlings, indicating that flg22 had stimulated the expression of the MdFLS2 gene and its downstream target genes. Furthermore, the ectopic expression of MdFLS2 complemented the function of the Arabidopsis fls2 mutant and conferred enhanced flg22 tolerance to the transgenic Arabidopsis, suggesting that MdFLS2 acts as a positive regulator in the response to pathogens in apple.     

耐盐杜梨蛋白磷酸酶基因PbPP2C的克隆及表达分析

2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2C)是植物体内脱落酸ABA信号传导关键负调控酶,在植物耐非生物胁迫中发挥着重要的作用。本研究利用RT-PCR技术,克隆出编码杜梨PP2C蛋白的基因Pb PP2C,其核苷酸序列全长1 353 bp,开放阅读框长1 263 bp,编码422个氨基酸残基,这些残基中包括了与二价金属离子结合的MED、DGH、DG和D结构域。系统发生分析结果表明,该氨基酸与拟南芥AHG3亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析结果表明:盐胁迫条件下,Pb PP2C基因在根、茎、叶中的表达12 h达到峰值,同时在根中72 h达到第二个峰值;干旱胁迫条件下,Pb PP2C基因在根、茎、叶中表达72 h达到峰值。说明Pb PP2C与杜梨耐盐和耐干旱胁迫存在紧密关联。