海南油茶AFLP体系的建立及优化

该文以海南油茶DNA为材料,对AFLP反应体系中的油茶基因组DNA用量、酶切连接反应时间、酶切连接液稀释倍数、预扩增反应产物稀释倍数、Mg2+浓度等5个因素进行优化。结果表明:Eco RI和Mse I酶切连接反应14h需基因组DNA用量为400ng,预扩增反应过程酶切连接液稀释倍数10倍,选择扩增中预扩增产物稀释倍数40倍,两次扩增选用Mg2+浓度均为2.0mmol/L。采用该技术体系得到的AFLP指纹式样清晰,适宜用作海南油茶品种鉴别和遗传多样性分析。     

毛红椿AFLP体系优化及引物筛选

以江西九连山国家级自然保护区毛红椿天然林为研究材料,对毛红椿AFLP反应体系中的DNA提取方法、酶切与连接步骤、连接产物稀释倍数、预扩增产物稀释倍数等影响因子进行优化,并筛选AFLP多态性高的引物。结果表明：不同提取方法对DNA质量有很大影响,试剂盒法提取的DNA杂质少,质量高;酶切与连接采用一步法完成;连接产物最适稀释倍数为3倍,预扩增产物最适稀释为10倍;利用4个天然居群的毛红椿基因组DNA从64对引物组合中筛选出4对具有多态性扩增条带的引物,总扩增出147个位点,其中多态性位点122个,平均多态位点百分率84.36%,多态性较高,适用于毛红椿AFLP分析的4对引物组合分别是：E1/M6、E4/M7、E5/M3、E5/M8,为毛红椿遗传多样性和种质资源研究奠定了基础。     

木麻黄AFLP分析体系的建立及引物筛选

采用CTAB法改良技术提取木麻黄基因组DNA,在提取液中加入2%β-巯基乙醇防氧化和2%的PVP去除酚类等物质,获得高质量的基因组DNA,以满足AFLP对模板DNA高质量的要求;采用分步酶切和连接后,进行预扩和选扩,摸索建立和优化了木麻黄AFLP分析体系,探讨了木麻黄AFLP分析的影响因素;从64对AFLP核心引物组中筛选出了8对适合木麻黄分析的引物组合.同时探讨了AFLP技术在木麻黄研究领域的应用前景.     

枣叶片DNA的提取以及AFLP反应体系的建立

扩增片断长度多态性(AFLP)实验过程中,DNA提取质量和适合的PCR扩增反应体系是2个关键因素.利用CTAB法对枣树叶片DNA的提取方法进行探讨.结果表明:改良CTAB法抽提到了较高质量的枣基因组DNA,可用于AFLP实验分析;通过对酶切-连接体系和PCR扩增体系中的关键因素实验分析,建立了适合枣AFLP荧光反应体系,并得到清晰的DNA指纹图谱.     

山苍子AFLP反应体系的建立及其引物筛选

通过对山苍子幼嫩叶片、顶芽、花蕾3种组织的DNA提取效果分析和对影响酶切及选择性扩增效果的4个主要因素(酶切时间、Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、引物浓度)的比较研究,建立了适合于山苍子AFLP分析的技术体系。结果表明,山苍子的顶芽是较好的DNA提取材料;山苍子基因组DNA经5 U EcoR I和5 U Mse I酶切1 h即可完全酶切;最佳的选择性扩增体系为20 μL反应体系中含有1.0 U rTaq聚合酶、2.0 μL 10×PCR缓冲液、1.8 μL 25 mmol·L^-1MgCl₂、1.4 μL 2.5 mmol·L^-1dNTP、100 ng·μL^-1引物各1.0 μL。使用该反应体系获得了清晰、稳定的DNA指纹图谱,并筛选出10对多态性较好的AFLP引物组合,为利用AFLP标记技术进一步开展山苍子种群遗传结构、遗传分化等研究奠定了基础。     

刺槐AFLP分析体系的建立与优化

以10份刺槐种质资源为试材,通过对影响AFLP反应体系关键因素的优化,建立了刺槐AFLP分析的反应体系,即15ng/μL模板DNA在37℃下双酶切(MseI、EcoRI各0.15U/μL)2h,0.075U/μL T4DNA连接酶连接12h,连接产物、预扩增产物稀释10倍后扩增效果最佳。并利用该体系筛选出引物E+3/M+3,构建了刺槐种质资源的AFLP指纹图谱。     

桉树AFLP标记反应体系的建立

为获得桉树种质鉴定、辅助育种所需稳定的分子标记,本研究以生产中常用的24个桉树无性系基因组DNA为材料,对AFLP的反应体系和参数进行优化,发现高纯度的模板最低用量为100 ng;EcoRⅠ、MseⅠ用量不低于0.5 U;酶切连接时间需要大于4 h,但不多于14 h。预扩增获得50～700 bp产物;该产物稀释5倍后用于选择性扩增。聚丙烯酰胺胶电泳检测温度以20℃为佳。     

部分箬竹属植物的荧光AFLP分析

利用AFLP技术,选择EcoR I/Mse I这一酶切组合,应用9对(EcoR I+3)/(Mse I+3)引物组合进行选择性扩增,检测16种箬竹和5个形态相似的外源竹种的基因组DNA多态性.在21个样品基因组中共获得1 367条清晰的谱带,其中共有条带115条,特异性带273条,特异性缺失条带72条.在16个箬竹样品基因组中共获得1 193条清晰的谱带,其中共有条带190条,特异性带177条,特异性缺失条带98条.这些特异性带或特异性缺失条带可作为识别不同竹种的分子标记.聚类结果表明:所有的箬竹属植物聚成一类,其他5种外源植物聚成一类.此外,AFLP分析提供的分子证据,支持耿氏分类系统(1996),将天目箬竹归入阔叶箬竹中.     

人心果AFLP反应体系的建立与优化

为给人心果分子生物学研究奠定基础,以人心果嫩叶为材料,采用改良CTAB法提取到高质量的总DNA,可用于AFLP实验分析。通过优化酶切—连接反应、预扩增和扩增反应过程中的关键因素,建立了适合人心果的AFLP实验体系和反应条件,得到了带型清晰、多态性丰富的AFLP指纹图谱。研究结果对人心果遗传多样性分析及其分子标记辅助育种具有重要意义。     

适于AFLP分析的澳洲坚果DNA提取方法

利用SDS法和改良CTAB法对澳洲坚果两个品种的基因组DNA进行提取试验,结果表明:SDS法与改良CTAB法提取的基因组DNA完整性都比较好,但SDS法获得的DNA含有较多杂质,不能被限制性内切酶消化,改良CTAB法提取的基因组DNA可以完全酶切,DNA质量符合AFLP分析的要求。     

杨属部分种及杂种的AFLP分析

利用13对AFLP引物对杨属4个派19个种及杂种的47个无性系进行分析,共检测到858个标记,其中多态性标记为771个,多态性位点的百分率为89.9%,每对引物产生的多态性位点的百分率在80.7%～98.1%之间,表明杨属种间及无性系间在DNA水平上存在广泛变异.根据AFLP标记结果计算杨属派间、派内种间、种内无性系间分子遗传距离,对它们的亲缘关系进行定量描述.聚类分析结果表明,派间聚类与经典形态分类完全一致,派内种间及种内无性系间聚类与形态分类基本相同.最后,探讨根据分子标记结果进行杂交亲本选配及杂种子代早期选择的可行性.     

十一种槭属植物遗传多样性AFLP分析

采用了AFLP技术分析了槭属十一种植物的遗传多样性,从12对AFLP引物中筛选出5对多态性高、分辨率清晰的引物,其中选择最优的3个引物组合分别扩增出101、163、178条多态性带。三对引物(E ACG/M CAG、E ACA/M CAT、E AAC/M CAC)共扩增出484条带。分析结果按UPGMA类平均法进行聚类,聚类结果显示将11种械属植物聚为I、Ⅱ、Ⅲ三大类,其中羊角槭和栓皮槭,长尾秀丽槭和毛脉槭,复叶槭与剑叶槭之间的亲缘关系最近。     

油料植物光皮树SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

建立稳定可靠的SSR-PCR反应体系、筛选具有多态性SSR引物,是木本油料植物光皮树分子标记辅助育种与良种选育的重要基础研究。为给SSR标记技术在光皮树遗传图谱构建、亲缘关系鉴定及分子育种等方面的应用研究奠定基础,利用"Cf-05"正反向引物,采用L16(45)正交试验设计和单因素试验相结合的研究方法,对影响光皮树SSR-PCR反应体系的主要因素(模板DNA、引物、d NTPs、Mg~(2+)、Taq聚合酶浓度及退火温度)进行了试验分析。试验结果表明,光皮树SSR-PCR总体积为15μL的最佳反应体系为:模板DNA用量37.5 ng,正反向引物浓度均为0.6μmol·L~(-1),d NTPs浓度为0.3 mmol·L~(-1),Mg~(2+)的浓度为1.5 mmol·L~(-1),Taq聚合酶用量为1.5 U,最佳退火温度为50℃。运用优化了的光皮树SSR-PCR反应体系,可从71对引物中筛选获得11对能适用于光皮树的SSR引物。研究结果表明,试验所建立的反应体系可进一步用于光皮树SSR遗传多样性分析、遗传图谱构建和分子标记辅助育种等方面的研究中。     

杨树部分种的AFLP遗传多样性分析

利用10对AFLP引物对杨属5个派20个种及杂种的44份杨树材料进行分析.结果表明:在这些材料中,不同引物组合的多态性均为100%,表明杨属种间及无性系间在DNA 水平上存在广泛变异.利用 UPGMA 法对 AFLP 数据进行聚类分析,相似系数在 0.765～0.971 之间,派间聚类与经典形态分类完全一致,派内种间及种内无性系间聚类与形态分类基本相同.构建了 44 份材料的指纹图谱,在该图谱中,每个材料都具有自身独特的条带.最后,探讨根据分子标记结果进行杂交亲本选配及杂种子代早期选择的可行性.     

柳树杂交子代AFLP的分子鉴别与多态性分析

利用筛选出的5对引物,对来自菏泽的2号、8号、172号、sH4、SH7、SH9、SH10、SH15、SH17、SH18、SH22、SH25、SH26、SH28、SH31、SH32、SH37、SH39、SH48、SH49共20个柳树种质进行了AFLP分子鉴别和多态性分析研究。结果表明：5对引物共产生645条谱带,多态带542条,多态带的比例为84．03％;每对引物鉴别效率为100％。AFLP是进行鉴别亲缘关系比较近的柳树种质的有效方法。