箭筈豌豆AGAMOUS同源基因及其启动子的克隆和分析

AGAMOUS(AG)是参与植物雌蕊和雄蕊发育调控的最重要花器官同源基因之一。通过TAIL-PCR、RACE和RT-PCR技术相结合,获得了箭筈豌豆花器官同源基因VsAG(VsAGAMOUS)及其上游调控序列。该基因DNA序列总长3 158 bp,CDS区域735 bp,编码含有244个氨基酸残基的蛋白产物。序列在氨基酸水平上与近缘植物豌豆PsAG基因序列一致性达98%,与拟南芥AtAG基因一致性为68%。将该基因在GenBank上注册,登录号为JF313850。生物信息学分析表明,VsAG基因第2内含子区域含有丰富的转录调控元件,在种类和功能分化上与基因上游调控序列表现出相似特征。这一结果暗示了第2内含子对豆科植物AG基因表达调控的重要作用,并为通过基因工程方法创造箭筈豌豆优良育种材料奠定了基础。     

甘蓝自交不亲和信号转导元件ARC1与EXO70A1的相互作用

从甘蓝型油菜与羽衣甘蓝柱头中克隆出ARC1与EXO70A1基因的编码区, 序列分析显示推导的甘蓝型油菜ARC1比羽衣甘蓝ARC1少编码2个氨基酸, ARC1蛋白在羽衣甘蓝与甘蓝型油菜中存在45个氨基酸的差异, 其序列相似度与一致性分别达到95.9%和93.9%; 推导的EXO70A1在两种植物中仅有6个氨基酸的差异, 其序列相似度与一致性分别达到99.4%和98.9%; EXO70A1蛋白在种内和物种间都保持着高度的保守性, 其保守的程度高于ARC1。应用酵母双杂交系统检测两种蛋白质的相互作用, 发现: 在二倍体酵母细胞中, 全长的ARC1与EXO70A1之间存在较强的相互作用, 能激活4个报告基因(ADE2、HIS3、AUR1-C和MEL1)的表达; 去除C-端(包括臂重复区) 316个氨基酸残基后的ARC1_N与EXO70A1之间表现出较弱的相互作用, 只能激活3个报告基因(ADE2、AUR1-C和MEL1)的表达, 表明ARC1的臂重复区可能并不位于ARC1与EXO70A1的互作界面的核心区段, ARC1的N-端结构域对ARC1-EXO70A1互作起关键作用; 同时发现不同ARC1-EXO70A1组合的互作强度相当, 其可能原因是ARC1和EXO70A1在甘蓝与甘蓝型油菜中存在的这些序列差异并未影响ARC1- EXO70A1互作界面的构象。     

籽粒苋C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆和表达分析

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)是C₄途径的关键酶之一。本研究克隆了双子叶植物籽粒苋(A. hypochondriacus L) C₄型PEPC基因的cDNA和gDNA全长序列。该基因编码区cDNA全长2 895 bp (GenBank Accession: HQ186302),编码964个氨基酸残基。对应的gDNA全长为6 785 bp,含10个外显子和9个内含子,内含子总长3 890 bp,其中第一内含子最长,为1 662 bp,具GATA-motif、G-box等15个光应答元件,9个激素应答元件,29个CAAT box,72个TATA box。该特征在本研究范围内的植物中,为籽粒苋所独有。比较多种植物表明,不同植物之间的C₃/C₄型PEPC基因的外显子长度具有较高的一致性,而内含子的长度变化较大。不同植物PEPC基因对核苷酸具有一定的选择性,并且外显子和内含子的GC含量呈正相关。总的趋势是单子叶植物外显子和内含子的GC含量均高于双子叶植物。利用半定量RT-PCR分析表达模式,发现籽粒苋PEPC基因主要在叶片中表达,表达量随光照时间延长而增加。     

小麦糖基转移酶基因TaUGT73D1的克隆及表达分析

为探讨TaUGT73D1基因在小麦花发育过程中雄蕊和雌蕊形成的作用,本研究利用小麦三雌蕊突变体TP和雄蕊同源转化型不育突变体HTS-1两个品种,从中克隆得到了TaUGT73D1(UDP-glycosyltransferase73D1)的3个同源基因TaUGT73D1-2A、TaUGT73D1-2B、TaUGT73D1-2D,通过基因碱基序列分析表明TaUGT73D1-2A、TaUGT73D1-2B、TaUGT73D1-2D基因序列全长分别为1 907 bp、1 912 bp、1 905 bp,开放阅读框分别为1 365 bp、1 467 bp、1 461 bp,分别编码454、488、486个氨基酸残基,通过与小麦基因组比对,发现这3个同源基因分别位于染色体2AL、2BL、2DL上。TaUGT73D1-2A、TaUGT73D1-2B、TaUGT73D1-2D与乌拉尔图小麦Tu UGT73D1的编码区相似度分别为97.68%、96.52%、99.05%,蛋白序列相似度分别为73.57%、95.08%、95.70%。系统进化分析表明,该类基因与单子叶植物的UGT基因聚在一起,表明其亲缘关系较近,而与双子叶植物相隔较远,表明其亲缘关系较远。利用Real-time PCR分析TTaUGT73D1-2A、TaUGT73D1-2B、TaUGT73D1-2D基因在不同花器官雌蕊(P)、雄蕊(S)及雌蕊化雄蕊(PS)中表达模式。结果表明,该类基因在雄蕊中表达量最高,在雌蕊及雌蕊化中几乎不表达。因此推测TaUGT73D1基因可能与小麦雄蕊同源转化为雌蕊性状有关。本研究为进一步探讨小麦TaUGT73D1基因的功能提供了理论依据。     

甘蓝型油菜BnFAD2-C1基因全长序列的克隆、表达及转录调控元件分析

脂肪酸去饱和酶基因(FAD2)是控制植物体中油酸含量的关键基因,在甘蓝型油菜中有4个FAD2基因的拷贝,分别定位在A1、C1、A5、C5染色体上。本文克隆了1个FAD2拷贝基因,依据油菜基因组数据库信息,将其定位到C1染色体上,命名为Bn FAD2-C1,其开放阅读框为1155 bp。采用RACE(rapid-amplification of c DNA ends)技术获得了175 bp的5?UTR序列和212 bp的3?UTR序列。采用荧光定量PCR技术研究发现,Bn FAD2-C1在根、花和角果皮中仅保持本底水平的表达,在种子发育中期呈现高效表达,具有种子特异性诱导表达的特征。根据甘蓝和油菜基因组数据库信息,同源克隆到Bn FAD2-C1基因的启动子(promoter)和内含子(intron)序列,并通过PLACE和Plant CARE网站分析,初步预测到调控该基因转录的潜在顺式作用元件。通过茉莉酸诱导处理,Bn FAD2-C1基因表达量发生变化,推断茉莉酸在Bn FAD2-C1基因的表达过程中可能发挥一定的调控作用。     

甘蓝MLPK基因的克隆与序列分析

采用PCR、RT-PCR以及其他分子生物学方法，以甘蓝基因组DNA和柱头cDNA为模板对MLPK基因进行扩增克隆，首次得到长度分别为1 615 bp和1 294 bp的基因片段。序列分析表明，甘蓝MLPK与芜菁MLPK的cDNA序列相似性达98%，前者的内含子数为4个，比后者少了3个；同时，在前者内含子中发现了不同于典型的GU-AG规则的新的序列，即第3、4个内含子5′端碱基是TA、CG，3′端碱基为CAGG、GT，推测甘蓝MLPK的mRNA具有独特的剪切机制。这为甘蓝自交不亲和分子机理研究提供了新内容。     

三个陆地棉水孔蛋白基因的克隆与表达分析

从陆地棉SSH-cDNA文库的测序结果中得到一条具有完整ORF的陆地棉水孔蛋白基因序列,将其命名为GhAQP2。以该基因编码的氨基酸序列为探针,在棉花EST数据库经同源搜索得到2个相似性较高的EST,利用RACE技术获得其全长cDNA序列,将其基因命名为GhAQP3和GhAQP4。基因结构分析发现GhAQP2和GhAQP3各有4个外显子,3个内含子;GhAQP4有3个外显子,2个内含子。生物信息分析表明3个基因编码蛋白均含有6个跨膜区,2个NPA结构域,其氨基酸序列具备MIP超家族典型的蛋白保守区序列特征。多序列比对发现3个基因的氨基酸序列与其他物种PIP2类水孔蛋白氨基酸序列具有很高的同源性。qRT-PCR分析表明,GhAQP2在纤维伸长后期优势表达,GhAQP3在下胚轴和子叶中高表达,GhAQP4在纤维伸长前期优势表达,推测3个基因在不同的组织中发挥作用。GhAQP2在20DPA优势表达,为研究该基因在纤维伸长向次生壁加厚期转化过程中的表达调控提供了重要信息。     

牡丹花发育相关基因PsPI的克隆与表达分析

PI基因能够调控植物花器官形成。本研究以牡丹品种‘洛阳红’为研究材料,通过克隆从牡丹花瓣中得到PI同源基因,并利用q RT-PCR对其表达特性进行分析。结果表明,牡丹PI基因cDNA全长636 bp,包含MADS MEF domain,K-box domain,氨基酸序列C末端具有典型PI-motif I,命名为Ps PI,GenBank登录号为MH169595。序列比对与系统进化分析表明,牡丹Ps PI与芍药亲缘关系最近,相似性达90%以上。Ps PI在牡丹营养器官中痕量表达,生殖器官组织中的表达量较高,花瓣中表达量最高,为萼片32倍;牡丹花发育6个时期中,雄蕊、雌蕊原基分化期Ps PI表达量与其他4个时期存在显著差异,雌蕊原基分化期最高;4种不同花型牡丹的花器官中,Ps PI在花瓣中表达量高于萼片、雌蕊与雄蕊,单瓣型、荷花型牡丹表达量显著高于皇冠型与蔷薇型。Ps PI基因参与雌蕊、雄蕊原基分化,不同花型牡丹中该基因均在花瓣表现出较高的表达量,在雌蕊、雄蕊瓣化过程中可能具有关键作用,进而调控牡丹花器官的形态建成,该结果为牡丹花型分子育种提供了理论依据。     

小麦表皮模式建成因子基因(TaEPFL1)的克隆、定位及表达分析

表皮模式建成因子(EPFL)基因家族的成员参与调节植物一系列生长发育过程,包括花序的结构和气孔密度等。本研究从小麦雄蕊同源转化型不育突变体HTS-1中克隆出一个EPFL基因(TaEPFL1)。测序结果表明,该基因由3个同源基因组成(TaEPFL1.1,TaEPFL1.2,TaEPFL1.3)。通过小麦缺体-四体分析(NT)表明这3个同源基因分别位于染色体6D、6B和6A上。3个同源基因的开放阅读框(ORF)长度为363 bp,编码120个氨基酸,其中TaEPFL1.2和TaEPFL1.3的ORF完全相同。聚类分析表明TaEPFL1属于植物EPFL基因家族成员,与ZmEPFL1,ObEPFL1和AtEPFL1关系较近。Real-time PCR结果表明,TaEPFL1在HTS-1雌蕊化雄蕊(PS)中的表达异常显著。由此,我们推断TaEPFL1基因过量表达可能会导致雄蕊向雌蕊或雌蕊化结构的同源转化。本研究为进一步研究TaEPFL1基因的功能和阐明了小麦雄蕊同源转化为雌蕊的分子机制提供科学依据。     

芥菜型油菜TT1基因的克隆和SNP分析

拟南芥的TT1基因(编码含有WIP结构域的锌指蛋白)对种皮的发育和颜色的形成具有重要的调控作用。本研究利用同源克隆和RACE技术分离了芥菜型油菜TT1基因,在芥菜型油菜黄黑籽材料的种皮中进行转录水平的分析,比较了黑籽油菜与黄籽油菜基因序列的差异,并采用等位基因特异(allele-specific)PCR技术对可能存在的单核苷酸多态位点进行验证。结果表明,芥菜型油菜TT1基因的DNA序列全长为2197bp,包含1个内含子,与甘蓝型油菜TT1-1基因的DNA序列的相似性为99%,与拟南芥的TT1基因DNA序列的相似性为85%;推导的TT1蛋白序列为300氨基酸残基,理论分子量为33.97kD,等电点为6.99;TT1在所有材料的种皮中均检测到表达;比较紫叶芥、四川黄籽、NILA和NILB的TT1基因序列,共发现8个核苷酸变异位点,均在基因的外显子区域,其中紫叶芥和NILA的序列相同,四川黄籽和黒籽近等基因系NILB的序列相同。与紫叶芥相比,黒籽近等基因系NILB有8个核苷酸差异,但种皮颜色与紫叶芥一样,均为黑色,TT1基因这些位点的突变并不影响芥菜型油菜种皮的颜色。通过等位特异PCR可以区分来自四川黄籽与紫叶芥的TT1基因。     

甘蓝KAPP编码基因的克隆与序列分析

采用PCR、RT-PCR及其他分子生物学方法,以甘蓝基因组DNA、花蕾RNA和叶片RNA为模板,分别对甘蓝KAPP gDNA和KAPP cDNA进行扩增,分别获得3247bp的KAPP gDNA片段、1699bp的KAPP cDNA片段、1578bp的花蕾KAPP2 cDNA片段和1581bp的叶片KAPP2cDNA片段。对克隆的甘蓝KAPP gDNA和cDNA(结合报道的KAPPcDNA)进行比对表明,甘蓝KAPP基因包含11个内含子,均符合"GU-AG"剪接规则,并且克隆得到的KAPP cDNA序列与报道的KAPP cDNA序列有6处单个碱基的差异,但两者的氨基酸序列完全一致。然而花蕾KAPP2 cDNA、叶片KAPP2 cDNA片段与报道的KAPP cDNA序列相似性分别为85.2%和85.0%。这两个序列分别在590bp和593bp处较早出现一个无义突变引起的终止密码子。Blast分析表明,两基因编码的氨基酸序列与拟南芥KAPP氨基酸序列相似性最高,其次为甘蓝KAPP氨基酸序列。以已报道的8种植物KAPP的CDS及本实验所克隆的两个KAPP2序列构建分子进化树,获得序列与甘蓝KAPP序列聚为一支。结合比较作图及分子进化树,推测KAPP基因在甘蓝基因组上有两个拷贝,而笔者克隆到的KAPP2 cDNA序列是其中一个拷贝,是KAPP进化过程中突变失活的拟基因。     

甘蓝型油菜BnaABI4基因CRISPR/Cas9编辑载体的构建及甘蓝型油菜转化

ABI4(Abscisicacid-insensitive4)是ABA响应途径中重要的转录因子。本研究以甘蓝型油菜全基因组数据库为基础,借助拟南芥ABI4蛋白的氨基酸序列,通过序列比对,获得了甘蓝型油菜的2个BnaABI4,分别命名为BnaABI4-A (GenBank登录号为BnaA03g18970D)和BnaABI4-C (GenBank登录号为BnaC03g725-10D)。在这两个基因的CDS序列上寻找一段长度为20 bp、序列相同的片段作为基因编辑的目标位点,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体pCAMBIA1300-sg RNA/Cas9-BnaABI4;借助根癌农杆菌介导的油菜下胚轴遗传转化法,成功将BnaABI4的基因编辑表达框转入甘蓝型油菜‘湘油15’中,共获得转基因植株13株,这将为深入研究甘蓝型油菜BnaABI4的生物学功能提供科学依据。     

六个甘蓝型油菜油酸脱氢酶（FAD2）假基因的克隆和分析

以甘蓝型油菜湘油15为材料,采用PCR方法克隆并分析了56个FAD2基因克隆和47个FAD2基因cDNA克隆,从中发现6个新的FAD2基因拷贝。它们与公布的甘蓝型油菜FAD2基因(AY577313)具有87%以上的同源性,没有内含子,在开放阅读框中存在1~12个终止密码子,其中有2个拷贝具有转录功能。将这6个FAD2基因拷贝在酿酒酵母中进行体内表达实验,通过气相色谱检测脂肪酸组成证明其不具备油酸脱氢酶功能,与对照相比,也没有改变酵母体内脂肪酸组成。由此推测这6个FAD2基因拷贝为假基因。     

玉米Gln1-4的gDNA序列、基因结构、保守功能域与等位变异

本研究旨在分离玉米谷氨酰胺合成酶(GS)家族重要成员Gln1-4 gDNA序列全长,分析基因结构、保守功能域与自然等位变异,为氮利用效率功能位点关联性分析奠定基础。利用PCR步移(walking)方法分离Gln1-4基因区域基因组DNA序列,用生物信息学方法分析基因结构与保守功能域,测序与序列比对法分析重要区域自然等位变异。结果表明,分离得到自交系Mo17 Gln1-4区域gDNA 3 724 bp,起始密码子至终止密码子序列长2 858 bp,登录到GenBank (登录号为EU369651), 并注释。Gln1-4基因含10个外显子与9个内含子,18个剪接位点均为保守的5'供位GU与3'受位AG模式。编码的GS蛋白由356个氨基酸组成,分子量39.2 kD,等电点(pI)为5.202。氨基末端外显子2到外显子6为氨离子结合结构保守功能域;羧基末端外显子8与外显子9构成ATP酶活性保守功能域。Gln1-4与Gln1-3基因相比,在DNA序列、氨基酸序列、基因结构、保守功能域均很保守,氨基酸序列一致性达98.31%。52个玉米自交系的Gln1-4等位变异分析中,共鉴定出318个等位变异位点,其中242个SNP,45个Indels,占90%。该基因氮利用效率功能关联性分析区间应位于氨离子结合功能域与ATPase活性保守功能域中重要的变异位点,18个剪接位点。     

樱桃ACC氧化酶基因的克隆和序列分析

以樱桃基因组DNA为模板定向克隆其ACC氧化酶基因。对PCR扩增的目的片段用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，进行回收、连续转化，通过蓝白筛选挑取白色菌落提取质粒DNA进行酶切鉴定，确定重组子后采用双脱氧终止法测定DNA全序列。DNA测序结果显示，樱桃的ACC氧化酶基因序列全长为1310bp，由2个外显子和3个内含子构成，外显子总长为1000bp。同源性分析可知，樱桃与桃的ACC氧化酶基因DNA序列同源性达97．8％。     

甘蓝多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白BoPGIP基因的克隆及序列分析

PGIP是一种特异性结合和抑制真菌内切PG活性的细胞壁结合蛋白,在植物分子抗病育种中占有十分重要的地位。甘蓝PGIP基因的克隆和序列分析,将为进一步通过转基因技术培育抗病甘蓝新品种奠定基础。本研究通过同源序列克隆法,根据GenBank已登录的青花菜BoPGIP1(Accession: JF325875)基因全长序列设计基因特异性引物,利用PCR扩增技术从甘蓝中克隆基因,利用生物信息学的方法对其编码蛋白的结构和功能进行了预测。将获得的PGIP基因命名为BoPGIP。该基因DNA全长为1065 bp,包含1个内含子和2个外显子。外显子全长975 bp,编码342个氨基酸,分子量为36.2 kD,等电点是6.26。该基因属于PGIP基因家族,具有典型的LRR结构域;功能位点分析显示编码蛋白序列中包括4个N-糖基化位点(65~68,106~109,130~133,254~257),1个蛋白激酶C磷酸化位点(189~191),5个酪蛋白激酶II磷酸化位点(73~76,78~81,151~154,182~185,304~307)和4个N-豆蔻酰化位点(157~162,188~193,236~241,273~278);N末端具有一明显跨膜区域和一个典型信号肽序列;二级结构中包含31.79%helix,13.89sheet和54.32%loop,二级结构以无规则卷曲为主。通过对所克隆的甘蓝BoPGIP基因分析可知,该基因属于PGIP基因家族的新成员,基因的克隆及序列分析为进一步验证甘蓝BoPGIP的功能奠定了基础。     

结球甘蓝类钙调素蛋白基因BoCML39的克隆与表达分析

类钙调素蛋白作为钙调素蛋白的家族之一,调控植物生长发育、激素调控、病原菌防御及各种胁迫。本研究以结球甘蓝为试验材料,通过克隆获得BoCML39基因,其开放阅读框(ORF)为510 bp,编码169个氨基酸,不含内含子。预测BoCML39蛋白分子量为19.25 k D,等电点为4.35,为亲水蛋白,含有4个EF-hand结构域;系统发育树表明结球甘蓝BoCML39蛋白与白菜CML39蛋白处于同一进化枝,与油菜CML39蛋白、甘蓝CML39蛋白的亲缘关系近;三级结构预测发现该蛋白包含9个α-螺旋结构、5个β-转角、2个β-折叠、7个无规则卷曲和4个似小球状的钙离子结构。qPCR表明干旱(PEG6000,150 g/L)、盐(NaCl,200 mmol/L)、低温(4℃)、高温(37℃)、过氧化氢(H2O2,30 mmol/L)、脱落酸(ABA,100μmol/L)、水杨酸(SA,2 mmol/L)、茉莉酸甲酯(MeJA,100μmol/L)不同处理条件均能上调结球甘蓝叶和根中BoCML39的表达。研究结果初步证实BoCML39基因响应逆境胁迫(PEG6000,Na Cl,4℃,37℃)、活性氧(H2O2)和激素(ABA,SA,MeJA)调控,为Bo CML39参与植物逆境、活性氧和激素调控信号途径及其功能研究提供科学依据。     

花生溶血磷脂酸酰基转移酶基因的克隆与表达分析

溶血磷脂酰基转移酶(LPAT)是植物油脂合成途径的一个关键酶,在植物油脂品质改良和提高种子含油量方面具有重要的应用价值。本研究通过构建花生种子全长cDNA文库,结合大规模EST测序和功能注释,从花生中克隆了溶血磷脂酸酰基转移酶基因,命名为AhLPAT。该基因cDNA全长1 629 bp,对应的基因组序列5 531 bp,由11个外显子和10个内含子组成,内含子剪接方式符合GT-AG剪接规则。根据编码区预测AhLPAT编码一条387个氨基酸组成的多肽,预测分子量为43.2 kD,等电点为9.42。AhLPAT蛋白含有一个典型的酰基转移酶保守功能结构域以及溶血磷脂酰基转移酶相似的保守区域。该蛋白的氨基酸序列与已报道的其他物种LPAT蛋白序列有较高的一致性。AhLPAT与旱金莲、油菜、海甘蓝、蓖麻和拟南芥的LPAT蛋白氨基酸相似性依次为90%、89%、89%、88%和87%。系统进化分析表明,AhLPAT与拟南芥AtLPAT2亲缘关系较近,且同属于内质网型LPAT蛋白。RT-PCR分析表明,AhLPAT基因在花生根、茎、叶、花、果针和种子中均有表达,在花生开花后50~60 d,果针和种子中的表达量最高,且AhLPAT的表达量与花生种子含油量积累速率变化一致,二者显著相关(r=0.63,P<0.05)。推测AhLPAT基因在花生种子油脂合成中起重要作用。     

海南疣粒野生稻乙烯受体的保守序列分析

本研究用自行设计的乙烯受体(ERS)保守引物从海南疣粒野生稻基因组DNA中克隆获得长度为1454bp的乙烯受体基因片段，推测该片段由2个内含子和3个外显子组成，外显子总长为974bp，编码324个氨基酸。与栽培稻(O.sativa)乙烯受体基因基因组DNA(os DNA)可比对序列的相似性达81．84％，推导出其mRNA与栽培稻的乙烯受体基因cDNA(OsERS)相应片段的同源性高达95．59％，而与栽培稻(Oryza sativa subsp Indica)ERS2相应片段的同源性为71．05％。