花生mtACP3基因的克隆与表达分析

旨在探究酰基载体蛋白在植物脂肪酸合成途径中的作用机制,本研究采用传统PCR方法从花生中克隆得到了一个线粒体型基因,命名为AhmtACP3。并采用荧光定量PCR技术分析了基因的表达特性。该基因全长为859 bp,开放阅读框ORF为390 bp,开放阅读框对应的基因组序列为543 bp,由2个外显子和1个内含子组成,该基因编码129个氨基酸,理论分子量为14.5345 k D,理论等电点为5.22,可能定位于线粒体上。系统发育分析表明,花生线粒体型ACP蛋白分成2个分支:AhmtACP1和AhmtACP2有较近的亲缘关系,与AhmtACP3亲缘关系较远。荧光定量PCR结果显示,AhmtACP3基因在花中的表达量明显高于其他组织,其次是子叶和根。AhmtACP3基因在种子发育过程中的表达量呈现下降趋势。     

小麦谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆及原核表达

为了进一步研究小麦谷胱甘肽-S-转移酶基因(TaGST)的功能,采用RT-PCR方法分离了小麦谷胱甘肽-S-转移酶基因(TaGST)的ORF全长c DNA,并进行了生物信息学分析。结果表明:小麦TaGST基因的ORF全长690 bp,编码229个氨基酸;TaGST蛋白分子质量为25.81 k Da,p I为5.29。系统进化分析表明,该基因编码蛋白与水稻OsGST蛋白的氨基酸同源性最高,与已知植物GST家族成员的氨基酸序列聚类分析将TaGST聚为Phi类GST。构建原核表达载体p ET32-TaGST,对TaGST基因进行原核表达,SDS-PAGE结果表明,其所表达蛋白与预期蛋白大小一致。为进一步研究该基因的特性和功能奠定了理论基础。     

亚麻糖基转移酶基因LuUGT72E1的克隆与表达分析

以亚麻茎部组织总RNA为模版,通过反转录PCR获得糖基转移酶Lu UGT72E1基因的全长开放读码框序列。序列分析结果表明:开放读码框全长1 476bp,共编码491个氨基酸。通过多氨基酸比对发现,该蛋白与亚麻UGT72N2蛋白亲缘关系最近,相似度达99%,与毛果杨、巨桉、木薯、雷蒙德氏棉及拟南芥UGT72E1蛋白的氨基酸序列相似性在58%~51%。分子进化分析表明,该蛋白与拟南芥UGT72E1~3聚为一类,推测该蛋白参与木质素单体的糖基化修饰过程。基因表达谱结果表明,该基因被BR、Brz诱导下调表达。本研究为亚麻的纤维品质改良提供了候选基因。     

天然棕色棉葡萄糖苷转移酶基因Gh3GT的克隆与表达分析

本研究以发育18d的天然棕色棉及相同发育时期的白色棉近等基因系纤维细胞为材料,采用抑制性差减杂交结合RACE技术分离得到了一个葡萄糖苷转移酶基因的全长cDNA,命名为Gh3GT(GenBank登录号eu921265)。序列分析发现:该基因编码一条有450个氨基酸残基组成的多肽,含有葡萄糖苷转移酶C-端所特有的保守的信号序列PSPG基序,属于植物中特有PSPG基序的UGT家族成员。推断的Gh3GT编码产物与其它糖苷转移酶同源性比对和系统发生分析表明:该糖苷转移酶与玫瑰Rh3GT(Rosa hybrida)、矮牵牛(Petunia hybrida)PhF3GT以及葡萄VvUFGT(Vitis vinifera)的相似性分别为51.30%、46.94%和45.85%,而与已知的陆地棉糖苷转移酶基因GhUGT1和GhUGT2一致性较低,仅为25.37%和12.14%。半定量RT-PCR分析表明:该基因在棕色棉纤维中的表达量明显高于其它组织及其近等基因系白色棉品种,且其在纤维中的表达规律与棕色棉的色素形成过程一致。     

七叶一枝花糖基转移酶基因的克隆及表达分析

糖基转移酶处于重楼皂苷生物合成途径的最后一步,催化薯蓣皂苷元或偏诺皂苷元的糖基化形成各种重楼皂苷,具有重要的研究价值。本研究通过对七叶一枝花进行转录组高通量测序、表达谱结合含量关联分析,筛选得到1条可能参与重楼皂苷生物合成的糖基转移酶(glycosyltransferase, GT)候选基因。通过克隆,获得Pp-GT全长基因(GenBank登录号:MW208819),长度为1 443 bp,就Pp-GT的蛋白质序列及进化等进行了生物信息学分析,并对其基因表达模式进行了研究。该研究为下一步重楼皂苷合成途径的阐明和Pp-GT基因的功能验证提供了科学依据。     

胡椒碱合成相关BAHD酰基转移酶基因的克隆与分析

胡椒碱是胡椒中重要的功能物质和品质指标之一。本研究以中国胡椒的主栽品种‘热引1号’为材料,基于胡椒基因组数据和转录组数据,筛选参与胡椒碱合成相关BAHD酰基转移酶,对候选的酰基转移酶基因进行克隆、分析和诱导表达。结果表明从胡椒基因组中鉴定出BAHD酰基转移酶基因78个。基于多序列比对及motif分析,胡椒BAHD酰基转移酶成员分为7类,特征结构域主要为HXXXD、DFGWG、YFGN。表达模式分析筛选出在胡椒果实中特异表达的BAHD基因7个,并成功克隆到全长序列。其中,Pn1.3303、Pn1.3375编码的氨基酸包含完整且未发生突变的特征结构域,在胡椒种子中特异表达,表达模式与胡椒碱合成紧密相关。将2个目的基因分别构建到原核表达载体pGEX-4T-1上,最终成功诱导表达出N末端与GST标签融合的目的蛋白。本研究为胡椒碱生物合成相关BAHD酰基转移酶的鉴定提供了基因资源。     

马尾松PmCOMT基因的克隆及实时定量表达分析

在木质素生物合成里,咖啡酸-O-甲基转移酶(caffeic acid-O-methyltransferase, COMT)起重要作用。本论文以马尾松幼苗作为材料,并通过PCR技术以及RACE技术从马尾松材料中克隆出Pm COMT基因的cDNA全长。该cDNA全长为1660bp,其中预测完整ORF全长为1125bp,可编码374个氨基酸的蛋白。蛋白相对分子质量为41.81 kD;等电点(pI)为5.03,总平均亲水性为-0.311。通过生物信息学的方法对其进行分析表明,Pm COMT基因具有典型的甲基转移酶的保守结构域。通过实时荧光定量表达分析表明,COMT基因在马尾松的不同组织均有表达,其中在新梢中的表达量最高,树皮中表达量最低。     

花生油脂合成相关基因的表达谱分析

为研究不同发育时期花生籽仁油脂合成过程中基因表达调控模式,本研究以高油酸、中油花生品系F18和低油酸、低油花生品种‘鲁花6号’为材料,对下针后10、30、40、60 DAP(days after pegging)的花生种子进行表达谱芯片测序。结果表明,130、3556、2783个基因分别在30、40、60 DAP时期差异表达。GO注释和KEGG富集结果显示,差异表达的基因主要富集在脂肪酸合成和光合等代谢进程中,其中FAB2、FAD2、WRI1等主要参与油酸的积累,参与光合作用的基因均为捕光叶绿素a/b结合蛋白,全部上调表达。代谢通路图结果表明,籽仁发育的40 DAP和60 DAP时期,脂肪酸合成途径的基因均上调表达。研究结果为花生油脂代谢的分子机制提供理论基础,同时也为花生品质改良贡献了基因资源。     

甘蓝型油菜乙酰转移酶基因的克隆及功能验证

为探究乙酰转移酶基因对甘蓝型油菜脂肪酸代谢的影响,以低亚麻酸油菜20～35 d自交种cDNA为模板,克隆了乙酰转移酶基因(Acetyltransferase gene,AT)的2个拷贝(114和148),并进行生物信息学分析以及构建了过表达载体和干扰载体,并转化拟南芥,经潮霉素筛选T0种子,PCR鉴定抗性苗后,收获T1...     

甘蓝型油菜2个GPAT6同源基因的克隆与表达分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶(sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase,GPAT)是三酰甘油生物合成的关键酶,催化三酰甘油合成的起始步骤,在植物中参与调节生长发育、脂质的合成和逆境应答等过程。本试验通过RT-PCR从甘蓝型油菜品种湘油15中克隆得到GPAT6基因的2个拷贝,分别命名为BnGPAT6-1(GenBank登录号为KJ000117)和BnGPAT6-2(KC106728)。它们的编码区序列(coding DNA sequence,CDS)均为1506 bp,编码501个氨基酸。预测其蛋白结构N端含有一个类卤酸脱卤酶(haloacid dehalogenase-like hydrolase,HAD-like)活性结构域,C端含有一个溶血磷脂酰基转移酶(lysophospholipid acyltransferase,LPLAT)功能域。蛋白序列比对和进化树分析表明,甘蓝型油菜与白菜(B.rapa)、甘蓝(B.oleracea)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)和琴叶拟南芥(A.lyrata)中的GPAT6序列相似性最高。组织表达结果表明BnGPAT6基因在花中的表达量最高,在未成熟的胚中表达量呈先升高后降低的趋势。BnGPAT6的表达受ABA的抑制;在干旱和6-BA胁迫下几乎同时升高;在盐胁迫下,短时间内升高,达到峰值后降低;在水渍条件下没有明显变化。     

花生水孔蛋白基因(AhAQ1)的克隆及盐胁迫下的表达分析(英文)

水孔蛋白的主要作用是控制植物体内的水分运输,在植物盐胁迫调节中也起作用。本研究采用RT-PCR的技术,从盐胁迫的花生叶片中克隆了水孔蛋白基因AhAQ1。AhAQ1编码一个由287个氨基酸残基组成的蛋白质,推测的蛋白质相对分子质量为30.57kD,等电点为9.04。序列分析表明AhAQ1具有6个跨膜区和2个NPA框。系统发生分析显示AhAQ1与PIP1家族聚为一类。高盐处理花生组织后,用半定量RT-PCR进行分析,结果表明,AhAQ1转录水平的表达受盐胁迫诱导,推测花生AhAQ1在应答盐胁迫反应中可能发挥作用。     

棉花溶血磷酸酯酰转移酶(LPAT)家族基因的发掘和表达分析

棉花油脂合成相关代谢在控制油分形成、纤维发育等进程中起着重要作用。溶血磷脂酰基转移酶(LPAT)是植物油脂代谢过程中的一个关键酶。本研究利用雷蒙德氏棉全基因组数据库,通过生物信息学技术,鉴定并获得8个棉花LPAT家族基因的全序列和染色体定位等信息。通过序列比对进行系统进化和分类分析,明确这8个家族基因分布在6条染色体上,分为4亚类,其中第I类和第III类中各含2个基因、第II类1个、第IV类3个。组织表达分析表明这8个基因在棉花营养和生殖阶段均表现表达多样性。LPAT6和LPAT8在17 d胚珠中表达水平很高,推测在油脂合成代谢调控中起重要作用。8个LPAT基因均在纤维中优势表达,其中LPAT2、LPAT3和LPAT4表达水平更高,推测LPAT家族基因的表达参与棉纤维发育进程。     

红果醋栗RrFAD2基因的克隆与表达分析

本研究克隆到红果醋栗(Ribes rubrum L.)脂肪酸脱氢酶2(co-3 fatty acid desaturase,FAD2)基因cDNA全长序列,命名为RrFAD2,GenBank登录号为MT795718。RrFAD2全长1470 bp,开放阅读框序列全长1152bp,编码383个氨基酸。生物信息学分析表明,RrFAD2蛋白具有6个跨膜结构域,分子量为43.92 kD,等电点为8.93。利用荧光定量PCR分析RrFAD2基因在红果醋栗不同组织和种子发育中的表达。结果表明该基因在根、茎、叶、花、果实、种子中都表达,在种子中表达量最高,花和根中最低,具有组织特异性。在种子发育过程中,RrFAD2基因的表达先上升后下降,而种子成熟的晚期(花后80 d左右)表达量达到最高。该研究为解析红果醋栗RrFAD2基因功能和研究醋栗不饱和脂肪酸合成提供理论参考。     

甜菜素合成相关基因BvDDC1的克隆与表达分析

甜菜素是一种重要的天然色素,具有广阔的应用前景。为探究调控甜菜素合成关键基因BvDDC1功能,本研究测定了不同生长阶段甜菜‘Yellow chard’的甜菜素含量和BvDDC1的相对表达量,同时采用同源克隆技术获得BvDDC1基因序列,并对其进行生物信息学分析及功能预测。结果表明:甜菜叶片中甜菜素含量随甜菜生长时间的延长呈现上升趋势,且BvDDC1在不同时期甜菜叶片中均有表达,呈现先上升后下降的趋势。甜菜素含量越高,BvDDC1表达量越高。BvDDC1序列全长为1509 bp,编码502个氨基酸,编码蛋白不具有跨膜结构,预测其在膜外发挥作用。系统进化树显示与菠菜亲缘关系较近,同源性最高。本研究结果可为解析甜菜素生物合成提供科学依据。     

花生蔗糖合酶基因AhSuSy的克隆和干旱胁迫表达分析

蔗糖合酶(sucrose synthase, SuSy)是蔗糖代谢途径中的关键酶, 在植物生长、发育和渗透调节过程中起着重要的作用。本研究利用同源克隆、RACE和TAIL-PCR相结合的方法从花生叶片中分离了蔗糖合酶基因, 命名为AhSuSy (GenBank登录号JF346233)。该基因cDNA序列全长2 790 bp, 包含一个2 421 bp的开放阅读框(ORF), 5′端非编码区57bp, 3¢端非编码区为312 bp。根据编码区预测AhSuSy编码806个氨基酸, 与大豆、拟南芥、玉米等植物中相关蛋白的氨基酸序列同源性达75%以上; 成功构建了该基因的原核表达载体pET32a-AhSuSy, 在IPTG诱导下得到92 kD左右的蛋白, 与理论值一致。半定量RT-PCR分析表明AhSuSy在花生根、茎、叶中均有表达。利用10%PEG模拟干旱处理花生幼苗, 分析胁迫后AhSuSy的转录水平, 同时测定蔗糖合酶活性和蔗糖含量, 发现三者均表现为处理后4~12 h逐渐升高, 相关性分析显示花生中蔗糖含量与蔗糖合酶活性的相关系数达0.993(P=0.007<0.01), 处理后12~24 h逐渐降低。推测该基因响应干旱调控, 在花生抗旱胁迫中可能起着一定的作用。     

陆地棉GhDAHP基因的克隆与表达分析

棉花黄萎病是制约棉花产业健康发展的一种重要病害,在生产上未发现有效的根治办法,使用现代基因工程技术,从基因库中挖掘抗黄萎病相关基因,为棉花抗黄萎病育种工作的提供理论基础。本研究根据在GenBank中检索到抗黄萎病基因SDAHP(GU479467,1,3-脱氧-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶),从陆地棉基因组数据库中检索到3个同源基因(NM_016893351.1,XM_016849738.1和XM_0168151150.1),根据3个同源基因核苷酸序列设计引物,以陆地棉cDNA为模板进行克隆,获得3个目的基因,依次命名为GhDAHP-1、GhDAHP-2和GhDAHP-3。利用ProtParam和Prot Scale等在线软件对目的基因进行生物信息学分析;RT-PCR分析黄萎病菌诱导后目的基因在陆地棉叶片中的表达量。结果表明:GhDAHP-1序列全长1983 bp,氨基酸总数为539,分子质量约59.45378 kD,理论等电点pI为8.7;GhDAHP-2序列全长1832 bp,氨基酸总数516,分子质量约57.02998 kD,理论等电点pI为7.68;GhDAHP-3序列全长1652 bp,氨基酸总数517,分子质量约56.95491 kD,理论等电点pI为8.52。系统进化树分析,GhDAHP与雷蒙德氏棉(Gossypium raimindii)、木本棉(Gossypium arboreum)的亲缘关系最近。棉花叶片在黄萎病菌的处理下,GhDAHP基因表达量呈现先升高后降低的趋势,推测受到黄萎病诱导后,GhDAHP基因可能参与了黄萎病菌侵染的防卫过程。     

陆地棉干旱胁迫基因GhRBCO的克隆与表达分析

Rubisco蛋白(ritmlose-1,5-bisphosphosphate carboxylase/oxygenase,Rubisco)的上调表达是植物应对非生物胁迫的特征之一。本研究在前期蛋白质组学分析的结果上,利用同源克隆获得陆地棉‘KK1543’在干旱胁迫下差异表达的基因GhRBCO。GhRBCO基因编码区长747 bp,编码249个氨基酸;比对氨基酸序列及同源性分析发现,GhRBCO与其它植物中的RBCO蛋白的一致性较高,表明该基因在进化过程中是相当保守的。系统进化树结果显示,GhRBCO与雷蒙德氏棉、亚洲棉和黄花嵩的同源性最高。利用荧光定量PCR技术在15%PEG胁迫下研究该基因表达变化,表达量在棉花的根、茎和叶中都表现为先缓慢升高后降低的变化趋势,在根中表达量在24 h达到第一次最高;在茎中于12 h表达量最低。该基因的表达量在棉花的根、茎、叶中都呈上调表达水平。结果表明,GhRBCO基因可能参与棉花调节非生物胁迫机制。本研究结果为进一步研究GhRBCO基因的功能奠定了一定的基础。     

割手密SsWRKY1基因的克隆与表达分析

为了克隆割手密SsWRKY1基因,并对其生物信息学和表达模式进行分析。本研究通过转录组测序和RT-PCR方法相结合首次从割手密中克隆到一个WRKY基因,利用生物信息学工具对其进行分析,并利用荧光定量PCR分析其在干旱胁迫下的表达模式。从割手密中克隆到一个全长1083 bp编码360个氨基酸的WRKY转录因子的基因,含有一个WRKY基因保守结构域和一个Cx4-5Cx22-23HxH的锌指结构域,属于WRKY基因家族的第Ⅱ类成员,命名为SsWRKY1,GenBank登录号为MH687932。荧光定量分析表明,随着干旱胁迫时间的延长,其表达量呈持续上调的表达模式,说明该基因是干旱胁迫诱导型基因。SsWRKY1基因在割手密应答干旱胁迫等非生物胁迫中可能起重要的调控作用,为进一步研究割手密的抗旱机制和甘蔗抗旱新品种的选育提供了科学依据。     

银缕梅MADS-box家族基因PsuAP1的克隆、生物信息学表达分析

本研究以珍稀濒危植物银缕梅为材料,利用同源克隆与RACE技术克隆得到一个AP1-like基因的c DNA全长序列,命名为Psu AP1。利用生物信息学方法对它所编码的氨基酸序列进行分析,结果表明,该基因序列全长916 bp,开放阅读框长度为747 bp,编码248个氨基酸,分子质量约28.62 k D,理论等电点为9.84,是一种不稳定亲水蛋白。保守结构域分析表明该基因属于MADS-box家族基因;序列比对分析显示其氨基酸序列与连香树相似性最高,达78.57%,进化树聚类分析也表明Psu AP1与连香树的氨基酸亲缘关系最近。亚细胞定位分析显示该蛋白定位于细胞核。二级结构中同时含有琢-螺旋、延伸链和无规则卷曲结构,分别占比47.18%、11.29%、41.53%。荧光实时定量PCR分析表明,Psu AP1基因在花及果实中均有大量表达,推测其与花的发育以及果实的成熟相关。Psu AP1基因的克隆以及表达分析使银缕梅开花调控机理的研究取得了新的突破,为该基因功能的进一步深入研究提供了实验材料以及理论基础。