小麦Pm21基因调控的白粉菌早期侵染抑制和寄主细胞反应

携带抗白粉病基因Pm21的小麦材料对白粉病免疫,叶片可见坏死斑。苗期人工接种小麦白粉菌(Blumeria graminis f. sp. tritici)和病原侵染初期的细胞学观察表明,在互作位点,携带Pm21基因的抗病材料上表皮细胞乳突形成时间与感病对照差异不明显,但乳突的大小、致密度、持续时间及乳突中H₂O₂染色较对照有明显差异,并由此显著降低白粉菌的侵入频率。抗病材料上发生多次侵染未成功导致白粉菌附着胞畸形。对于少数成功侵入并形成吸器的白粉菌,抗病材料表皮细胞发生过敏性反应,限制白粉菌吸器和二级菌丝的发展。因此,Pm21调控的白粉病抗病反应在细胞水平上表现为细胞壁加固和过敏性反应的发生。     

利用大麦基因芯片筛选簇毛麦抗白粉病相关基因及其抗病机制的初步研究

利用大麦基因芯片筛选差异表达基因并结合RT-PCR分析技术，对簇毛麦的抗白粉病机制进行了初步研究。基因芯片杂交试验获得了抗病簇毛麦非诱导叶片、抗病簇毛麦和感病突变体经白粉菌（Blumeria graminis f. sp. tritici）诱导叶片的基因表达谱。抗病簇毛麦经白粉菌诱导前后的表达谱及RT-PCR分析结果表明，抗病簇毛麦中乙烯和水杨酸信号途径的部分基因被白粉菌诱导增强表达，参与了白粉病的抗性过程。另外，通过比较诱导的抗病簇毛麦与诱导的簇毛麦感病突变体的表达谱并结合RT-PCR分析，发现感病突变体中乙烯和茉莉酸途径的部分基因被白粉菌诱导表达参与防卫反应，未观察到水杨酸信号途径参与防卫反应的证据。同时对抗、感簇毛麦经白粉菌诱导不同时间的叶片进行了内源水杨酸含量的测定，结果表明抗病簇毛麦经白粉菌诱导后水杨酸含量明显上升，而感病突变体中水杨酸含量始终处于较低水平。由于乙烯信号途径是抗、感簇毛麦中共同的信号途径，而水杨酸途径只在抗病簇毛麦中参与抗病反应，所以在簇毛麦的抗病过程中，水杨酸途径是一种最有效的信号传导途径。还筛选出一批与簇毛麦抗白粉病相关的基因，包括病程相关蛋白基因、防卫反应基因、转录因子、信号传导因子和抗病基因类似物等。     

3个受白粉菌诱导的小麦抗病相关基因的表达分析

小麦白粉病是小麦生产上的重要病害。研究小麦抗白粉病的分子机理,利用抗病基因是控制小麦白粉病的有效途径。此研究根据前期白粉菌诱导后获得的可能与农家小麦品种红蚰麦抗病相关序列的分析结果,合成了几丁质酶,交替氧化酶（Alternative oxidase,AOX）以及MAP激酶（促分裂素原活化蛋白激酶mitogen-activated protein kinases）类似物3个基因的定量PCR引物,实时分析了在白粉菌诱导条件下‘红蚰麦×豫麦13’的F3代纯合抗病植株与感病植株两种互作组合中3个基因的时空表达模式,该研究为揭示‘红蚰麦’抗白粉菌的分子机理提供了依据。     

栽培小麦Brock中抗白粉病相关基因TaRPP13-1B的克隆及功能分析

白粉病是小麦生产中的主要病害之一,发掘抗病基因并实现抗病基因转育是提高作物抗病性的最经济有效的方法。本研究克隆了一个位于小麦染色体1B上、具有典型CC、NBS和LRR结构域的基因TaRPP13-1B。接种白粉菌后, TaRPP13-1B基因在抗病小麦Brock和BJ-1中表达量虽然出现上下调波动,但平均表达水平一直高于感病小麦品种京411。采用病毒诱导的基因沉默和转基因过表达技术进行功能分析,发现抑制目标基因表达,抗病小麦品种Brock对白粉菌的抗性显著降低;过表达TaRPP13-1B的转基因小麦津强5号对白粉菌抗性明显提高。说明TaRPP13-1B基因参与小麦抗白粉病的防御反应过程。该研究为小麦抗病品种的选育提供了有价值的备选基因。     

小麦近等基因系与白粉病菌互作的生理指标研究

小麦品种百农3217感白粉病,它的一个近等基因系(Xbd/百农3217(BC7F6))含抗病基因xbd,具有抗白粉病功能。以这两个品系为试验材料,接种白粉菌,分析了0~6 d两个品系叶片中过氧化氢(H2O2)的含量和7种代谢酶的活性,这些代谢酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽转硫酶(GST)等。目的是探讨在白粉菌和小麦植物的互作过程中,感病、抗病植物生理指标之间的差异。试验结果表明:接种白粉病菌后,H2O2含量在感病品系中显著下降,在抗病品系中显著上升;在白粉菌侵染进程中,CAT酶活性,感病与抗病品系无明显差异;感病品系叶片内SOD、GR、GPX、APX和GST活性在接种后期显著上升,高于抗病品系;DHAR活性变化则无明显规律。在白粉病侵染小麦植株过程中,H2O2具有重要作用,多种代谢机制共同参与,各种酶的总体表现影响了H2O2含量的变化。     

小麦自噬相关基因ATG10的克隆及白粉菌侵染诱导的ATG10的表达

细胞自噬是一种保守的真核生物细胞内物质分解和循环利用机制, 在植物生长、发育和逆境响应等过程中均扮演了重要角色。自噬相关蛋白ATG10是参与自噬小体形成的关键因子之一。利用同源克隆方法, 从经白粉病菌诱导48 h的小麦材料92R137/扬麦158⁷中克隆了ATG10基因家族3个成员(TaATG10a、TaATG10b和TaATG10c)。序列特征分析、物种间的比较和进化分析, 以及酵母功能互补实验结果证实, 这3个基因均为酵母ATG10的功能性同源基因。TaATG10a和TaATG10b的基因组序列具有相似的6外显子-5内含子基因结构。RT-PCR分析还发现这2个基因都具有2种可变剪接产物。TaATG10a和TaATG10b的GFP融合蛋白被定位于洋葱表皮细胞的细胞质中。白粉菌侵染能够诱导TaATG10a和TaATG10b表达, 因此推测, 小麦针对白粉菌侵染的免疫反应涉及对TaATG10及其参与的自噬过程的调控, 其调控模式因小麦抗、感白粉病反应、不同类型抗病基因介导的免疫反应和不同遗传背景下的感病反应而差异明显, 说明TaATG10及其参与的自噬过程与小麦-白粉菌互作反应关系的复杂性。从外源激素处理诱导的表达情况还发现, 抗、感白粉病的表型差异可能涉及抗、感材料TaATG10基因对同种激素(SA、乙烯或ABA)信号的不同响应模式。     

12个小麦品种(系)白粉病抗性的遗传分析

利用17个不同来源和毒力的白粉菌菌株对12个小麦品种(系)进行苗期抗性鉴定和抗病性遗传分析,同时利用Pm2和Pm8基因的特异分子标记检测了相应基因。供试的12个品种至少能够抗11个白粉菌菌株。用E09、E20和Bg2菌株接种F₂群体,抗感植株分离比例和适合性测验证明这12个品种对不同白粉菌菌株的抗性均受1对显性基因控制。抗谱分析和基因紧密连锁分子标记(Xcfd81)分析表明良星66很可能含有Pm2或其等位基因。ω-黑麦碱基因(1RS染色体)和Glu-B1基因(1BS染色体)特异分子标记分析结果证明,山农20和郑麦9962含有T1BL·1RS易位染色体,即可能携带Pm8基因。由于Pm8基因对大多数菌株表现感病,所以这2个品种除Pm8外,还具有其他抗病基因。偃展4110与天民668对参试菌株的反应型表现一致,其他材料对不同菌株的反应型表现不同。     

小麦抗白粉病SSH-cDNA文库中差异基因的表达模式

为了解白粉菌诱导下抗白粉病小麦的抗病机制,构建了白粉菌接种初期的抑制性消减杂交cDNA(SSH-cDNA)文库。从中随机挑取140个阳性克隆进行测序,去除冗余序列和重复序列后,得到94条EST,利用NCBI的BLAST在线序列比对工具对GenBank的蛋白质数据库进行同源性比对及功能分类。结果表明,49个EST与已知功能蛋白同源性较高,主要涉及初级代谢(2%)、能量代谢(24%)、细胞结构(2%)、转录(2%)、蛋白质合成加工与储藏(16%)、转运(4%)、信号转导(4%)和抗病与防御(30%)。经文库比较,筛选出与病程相关蛋白基因同源的EST(Z25-1)和与谷胱甘肽硫转移酶同源的EST(Z440-1),GenBank登录号为EX567369和EX567360。以其EST序列为依据设计引物,通过RT-PCR分析它们在白粉菌诱导下的表达模式,结果该2基因表达存在明显差异。其中,Z25-1在未接种白粉菌时具有一定的表达量,白粉菌侵染后表达量开始上升,侵染72 h时表达量最高,然后下降;Z440-1在未接种时也具有一定的表达量,但在接种初期表达微弱,甚至不表达,24 h后表达开始上升,到72 h时达最高,然后下降。本研究表明,病程相关蛋白和谷胱甘肽硫转移酶属于诱导型表达基因,且参与白粉病抗病反应,在白粉菌诱导72 h时表达量最高。     

应用基因芯片分析红蚰麦白粉菌胁迫条件下的基因表达谱

小麦农家品种红蚰麦携带1对显性抗白粉病新基因,暂命名为Pmhym。为了深入了解该品种抗病的分子机制,用豫麦13/红蚰麦的F₃代纯合抗病株系构建抗池,并对白粉菌接种后24 h的基因表达谱,采用Affymetrix小麦基因芯片进行分析,以白粉菌接种0 h为对照。在61 127基因微矩阵点中,有效差异表达Ratio值≥2或≤0.5的基因共5 282个,其中上调基因2 553个,下调2 729个。对上调序列的分类表明,功能明确的序列中39.81%与抗病/防御相关;下调表达基因中以能量代谢和抗病/防御相关基因比例最高,分别占26.71%和19.65%。上调表达在8倍以上的序列中81个的功能已知,其中包括病程相关基因、防卫反应基因、生成或清除活性氧的基因,以及抗病信号转导基因等。选取上调和下调表达8倍以上的共13个探针序列进行实时定量PCR验证,表明基因芯片数据具有良好的重复性。     

小麦抗病基因类似序列BRG1的分离与功能分析

利用cDNA-AFLP技术筛选到1个在抗黄矮病的小麦-中间偃麦草易位系YW642中特异表达的小麦抗病基因类似序列(BYDV resistance-related gene1, BRG1)的基因片段。利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)和RT-PCR技术,从YW642中分离出BRG1基因全长cDNA序列,获得了一个通读的抗病同源基因cDNA序列,编码由645个氨基酸组成的蛋白质,包含1个NB-ARC保守结构域和3个LRR结构域,该蛋白属于nucleotide-site binding, leucine-rich repeats (NBS-LRR)家族。荧光定量或半定量RT-PCR表达分析表明,BRG1在抗病小麦易位系YW642叶片中优势表达,受BYDV的诱导,BYDV接种后48 h表达量最高,BRG1在感病小麦亲本中8601中表达量始终较低,随BYDV接种时间延长呈轻微的下调趋势;而且外源激素水杨酸(SA)与茉莉酸(JA)处理可上调该基因在YW642中的表达。利用病毒介导的基因沉默技术分析了BRG1基因的功能,结果表明该基因沉默的抗病小麦易位系YW642中BYDV相对含量增加,但未造成抗病性表型显著改变,说明该基因参与抗黄矮病反应,但不是小麦抗黄矮病重要基因。     

普通小麦DH155抗白粉病基因的分子作图及应用分子标记辅助选择将其转移

普通小麦品系DH155对白粉病菌表现高抗。为明确DH155所携带抗白粉病基因的遗传方式及与抗病基因连锁SSR标记,利用DH155与高感小麦品系SN2890杂交获得的F2和F2:3群体进行接种鉴定和遗传分析,发现DH155对白粉菌菌株E09的抗性受1对显性基因控制,暂命名为Ml DH155。BSA和分子标记分析结果显示,Ml DH155与SSR标记Xcfd81和Xcfd18连锁。利用已发表的中国春和粗山羊草D基因组序列开发新标记,进一步将Ml DH155定位于标记Xsdau K525和Xsdau K527之间,其遗传距离分别为0.2 c M和0.8 c M。将DH155与感白粉病优良品系HB133-4和旱10杂交,在F2~F4代,结合优良农艺性状选择、分子标记辅助选择和抗白粉病鉴定,获得3个高抗白粉病且农艺性状优异的株系(SDAU2100、SDAU2101和SDAU2102)。利用14个白粉菌菌株对DH155进行苗期接种鉴定表明,DH155对13个菌株表现抗病反应型。这些菌株对DH155的毒力谱与已知抗白粉病基因Pm2相似,但DH155对Bg78-3和Bg44-5菌株的反应型与携带Pm2的Ulka/8*Cc不同。结合本试验结果和Pm2基因的相关报道,推测Ml DH155可能是Pm2或其等位基因。     

Pm52——小麦品种良星99抗白粉病基因的有效性

良星99是黄淮冬麦区和北部冬麦区推广的抗白粉病冬小麦品种,其抗白粉病基因位于2BL染色体,已被命名为Pm52。利用来自不同小麦生产区的123个小麦白粉菌菌株进行抗性鉴定,良星99可抗80%的菌株。2012-2016年连续5个生长季抗性鉴定中,良星99在成株期对接种的白粉菌混合菌株都表现免疫或高抗。采用Pm52基因紧密连锁分子标记Xgwm120和27个菌株对10个利用良星99培育的品系进行分子检测和抗性分析发现,衡4568、邯农2312、中信麦99和DH51302可能携带Pm52基因,而郑麦369和冀麦729的白粉病抗性基因可能与Pm52不同。石U09-4366、XR4429、衡10-5039和农大3486苗期和成株期都表现感病,不含Pm52基因。这些品种的成株期抗性反应与苗期的抗性反应一致。本研究的结果有利于良星99的抗白粉病基因Pm52在育种和生产上的有效利用。     

小麦抗病种质贵农775中抗白粉病基因的RAPD标记

运用RAPD技术,采用分离群体分组分析法（BSA）进行了小麦种质贵农775抗白粉病基因连锁的分子标记研究,其中有一个引物S2018在抗病亲本贵农775和抗病材料中扩增出了特异的DNA片段,而在感病材料和感病亲本丰产3号中没有扩增出同样的DNA片段。此片段长度约为880 bp。用F2分离群体（106株植株）进行遗传连锁性分析,引物S20188     

小麦种质N9134抗白粉病基因的SSR标记和染色体初步定位

普通小麦种质N9134含有野生二粒小麦AS846的抗白粉病基因,该种质对陕西省关中地区白粉病流行小种关中四号表现高抗。用高感小麦白粉病的普通小麦品种陕160和陕优225与N9134杂交,F1代对白粉病表现高抗,F2代抗病和感病植株的比例符合3∶1, 表明N9134苗期白粉病抗性由1对完全显性基因控制,暂定名为PmAS846。采用66个小麦SSR     

普通小麦品种Brock抗白粉病基因分子标记定位

为明确利用Brock转育成的小麦抗白粉病品系3B529(京411*7//农大015/Brock, F₆)抗性的遗传基础,将高感白粉病小麦品系薛早和3B529杂交,获得F₁代、F₂分离群体和F_2:3家系。抗病性鉴定和遗传分析结果表明,3B529对E09小种的抗性受1对显性基因控制,暂被定名为MlBrock。利用BSA和分子标记分析,获得了与MlBrock连锁的3个SSR标记Xcfd81、Xcfd78、Xgwm159和2个SCAR标记SCAR203和SCAR112,根据SSR和SCAR标记在中国春缺体四体、双端体和缺失系的定位结果,将MlBrock定位在小麦染色体臂5DS Bin 0~0.63区间上。MlBrock与Xcfd81和SCAR203共分离,与SCAR112的遗传距离为0.5 cM。这些分子标记的建立有利于今后Brock抗白粉病基因分子标记辅助选择和基因聚合。综合抗白粉病基因MlBrock的染色体定位和抗谱分析结果,推测MlBrock很可能是Pm2基因。     

利用SNP芯片和BSA分析规模化定位小麦抗白粉病基因

规模化定位小麦品种携带的抗白粉病基因对于抗病性种质创新和新品种选育具有重要的意义。本研究采用Illumina Infinium iSelect 90k SNP芯片结合集群分离分析法(bulked segregate analysis,BSA)对36个河南省小麦新品系携带的抗白粉病基因进行了定位。SNP芯片检测表明,在24个小麦品系构建的抗、感池DNA间可检测到一个明显富集的SNP峰,表明其可能携带单一主效抗白粉病基因;在其他12个小麦品系构建的抗、感池DNA间可检测到多个SNP峰,推测其可能含多个抗白粉病基因。有26个小麦品系在2AL染色体上检测到的SNP数目最多,推测其携带位于2AL染色体上的Pm4b抗白粉病基因。开发出与2AL染色体上抗白粉病基因紧密连锁的分子标记Xwggc116,可用于这些小麦品系中抗白粉病基因的分子检测。研究结果表明高通量SNP分析技术平台可以用来规模化定位小麦品种中的抗白粉病基因,明确了河南省抗白粉病小麦品系中携带Pm2、Pm4b、Pm21和新1BL/1RS易位等有限的抗白粉病基因,抗病基因资源非常狭窄,亟需引进新的多样化抗病基因资源,拓宽遗传基础,培育抗病小麦新品种。     

小麦新种质N95175抗白粉病基因的染色体定位

白粉病是影响小麦生产的病害之一。小麦种质N95175对小麦白粉病免疫,为了定位它所携带的抗白粉病基因的染色体位置,对其苗期白粉病抗性进行了遗传分析。4个感白粉病普通小麦品种与N95175杂交,F1对白粉病均表现高抗,F2抗感分离比例均符合期望比例3 1;21个感白粉病普通小麦缺(单)体系与N95175杂交,F1对白粉病均表现高抗,F2白粉病抗感比例除阿勃6AN×N95175组合偏离期望比例3 1外,其余组合均符合期望比例3 1。结果表明,N95175苗期白粉病抗性由位于小麦6A染色体上的1对完全显性基因控制。     

小麦品种汶农14抗白粉病基因的染色体定位

汶农14是近年山东省和国家审定一个半冬性小麦品种。采用来自不同地区的52个小麦白粉菌菌株对汶农14进行抗性鉴定,并利用分子标记分析定位了其抗白粉病基因。汶农14对43个菌株(82.7%)表现抗性反应型,对9个菌株表现感病反应型。这些菌株对汶农14的毒力谱与已知抗白粉病基因Pm2相似,但汶农14对11个菌株的反应与携带Pm2的Ulka/8*Cc不同。此外,利用26个菌株的鉴定结果表明,汶农14与携带Pm46的Tabasco相比,与3个菌株的反应型表现不同。汶农14在成株期对白粉病混合菌株表现高抗。利用汶农14×邯4564的F₂和F_2:3群体进行遗传分析,发现汶农14对E09菌株的抗性受1对显性基因控制,暂命名为PmW14。分子标记分析显示,PmW14与Xcfd8、Xcfd81和SCAR203连锁,遗传距离分别为7.5、1.8和7.7 cM。由于这些分子标记被定位于小麦5DS染色体的5DS-1-0-0.63区间,且与Pm2基因紧密连锁,因此推测,PmW14可能与Pm2位于相同的基因座。     

病原侵染早期小麦抗白粉病性状的构成因素剖析和QTL定位分析

以国际小麦作图组织提供的W7984×Opata85重组近交群体为材料,将白粉病抗性分解为互作早期不同时间点的乳突指数、乳突级别、吸器指数和二级菌丝指数等成分性状,在成分性状鉴定和统计的基础上,进行遗传分析和相关QTL定位。白粉菌侵染早期乳突指数和吸器指数随时间的变化趋势均受主效单基因的调控。数量性状分析共找到34个与抗白粉病相关的QTL (21个主效QTL),分布于小麦1B、1D、2B、3A、3B、3D、4A、4B、4D、5B、6A、6B、6D、7B和7D染色体上。位于7B染色体上的QTL(QPmPI16.tn-7B)对乳突形成的影响极为显著,贡献率达48.7%,促进乳突形成的等位变异来自Opata85。不同成分性状存在共定位的QTL。成分性状的特异QTL提供了更多的有关抗白粉病遗传机制信息。