猪胰岛素样生长因子-Ⅰ基因部分序列的扩增

胰岛素样生长因子-Ⅰ(insulin-like growth factor Ⅰ, IGF-Ⅰ),因其结构与胰岛素类似而得名,是生长激素产生生理作用过程中必须的一种活性蛋白多肽物质.它是人体内肝细胞、肾细胞、脾细胞等十几种细胞自分泌和旁分泌的产物.本实验采用PCR技术时猪肝脏中的IGF-Ⅰ进行扩增,并测定了其部分序列,共424bp,并与其它物种IGF-Ⅰ基因进行同源序列比较得出:猪肝脏扩增出IGF-Ⅰ与其他物种IGF-Ⅰ基因具有很高的同源性.本研究为进一步研究IGF-Ⅰ在猪肝脏中的作用提供理论基础.     

猪下丘脑中肝细胞生长因子基因序列的测定及其研究

本实验采用PCR技术检测出猪下丘脑有HGF的表达,并测定了其部分序列,共281bp,并与其它物种HGF基因进行同源序列比较得出:猪下丘脑扩增出HGF与其他物种HGF基因具有很高的同源性。本研究为诠释下丘脑的内分泌功能提供新的基础,HGF在下丘脑分泌机制和作用途径还需进一步研究证实。     

版纳微型猪近交系VEGF基因克隆及其组织中转录水平的检测

为克隆版纳微型猪近交系血管内皮生长因子(VEGF)基因并检测该基因在各组织中的转录水平,本研究提取版纳微型猪近交系18种组织RNA,利用RT-PCR方法扩增VEGF基因编码区全长序列,进行克隆测序。利用VEGF基因序列的推导氨基酸序列与牛等8个物种的VEGF氨基酸序列构建物种系统进化树,同时采用半定量RT-PCR方法分析VEGF基因在版纳微型猪近交系18种组织中的转录水平。结果显示,版纳微型猪近交系VEGF基因编码区全长573 bp,编码190个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,与牛等8个物种具有90%以上的相似性,分子系统进化表明其序列与人的关系最近,其次为牛、羊和兔。多组织半定量RT-PCR研究表明VEGF mRNA在版纳微型猪近交系的18个组织中均有转录水平的表达,其中在卵巢、脾脏、心脏、肺脏及皮肤中表达量较高,其他组织中表达量略低。     

撒坝猪TNS3基因CDS序列生物信息分析及组织表达检测

为了研究撒坝猪张力蛋白3(tensin3,TNS3)基因的结构和功能,以及在不同组织中的表达情况,试验对撒坝猪TNS3基因外显子区域进行了PCR扩增,所得序列与NCBI中序列进行比较分析,利用生物信息学软件对撒坝猪TNS3基因的结构、理化性质及其编码蛋白信号肽、跨膜结构、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构和CpG岛等进行了分析,并讨论撒坝猪TNS3基因与其他物种氨基酸序列的进化关系;采用实时荧光定量PCR法检测TNS3基因在不同组织中的表达情况。结果表明:撒坝猪TNS3基因序列与NCBI上公布的野猪TNS3基因序列中的CDS区相比存在4个碱基突变;撒坝猪TNS3蛋白是疏水蛋白,也是不稳定蛋白;该蛋白不存在信号肽,无跨膜结构,主要在细胞外膜上发挥生物学作用,存在磷酸化位点和糖基化位点;该蛋白的三级结构由α-螺旋(17.87%)、β-转角(4.62%)、延伸链(14.22%)和无规则卷曲(63.29%)构成;TNS3基因在不同物种进化过程中分化明显;撒坝猪TNS3基因有6个CpG岛和3种高度保守的结构功能域;撒坝猪TNS3基因在肝脏中的表达量最高,其次为大脑、背脂、肾脏、脾脏、肺脏,而在大白猪背最长肌中的表达量比撒坝猪高(P0.05)。说明TNS3基因与猪生长性状相关。     

蒙古马IGF-I基因的克隆及序列分析

采用Trizol法从蒙古马肝脏中提取总RNA,用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)进行cDNA扩增并克隆测序,获得长度为510 bp的胰岛素样生长因子(IGF-I)cDNA序列,共编码70个氨基酸的成熟肽.分析显示,蒙古马与其他动物IGF-I的cDNA编码区序列存在个别碱基差异,与人同源性达95.89%.     

四种主要肉源动物肌肉组织16S rRNA基因的扩增及序列分析

为了研究牛、羊、鸡、猪四种主要肉类物种16S rRNA基因序列之间的差异及进化关系,进而为餐饮市场肉类的鉴定建立方法基础,试验合成了1对16S rRNA基因通用引物,通过PCR方法扩增了牛、羊、鸡、猪四种动物肌肉组织的16S rRNA基因并进行了序列和进化树分析。结果表明:所采用的PCR扩增体系和条件均能很好地扩增出四种动物的16S rRNA基因;与Gen Bank中各自对应物种的标准序列均具有99%以上的同源性,同源性较高;序列间富含174个位点的差异或插入缺失,同源性较低。在物种进化关系上牛、羊最近,其次是猪,最后是鸡。表明16S rRNA基因种属特异性显著,可以作为基因条形码的候选基因,可利用该基因建立相应的分子诊断方法,用于对肌肉组织进行物种的鉴定。     

从江香猪IFN-β基因的序列分析及原核表达

试验旨在探明从江香猪β-干扰素（interferon-beta，IFN-β）基因编码区分子序列及原核表达产物特征。以从江香猪为研究对象，提取肝脏总RNA并反转录为cDNA，设计特异性引物扩增IFN-β基因编码区，将目的基因片段克隆至原核表达质粒pET-28a上，获得重组质粒pET28a-CJpoIFN-β，并利用生物学软件对江香猪IFN-β基因编码区进行序列分析；将鉴定正确的重组质粒pET28a-CJpoIFN-β转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，经IPTG诱导表达、SDS-PAGE与Western blotting分析原核表达蛋白。结果表明，从江香猪IFN-β基因编码区长为561 bp，编码186个氨基酸；该蛋白为分泌性蛋白，前21个氨基酸为信号肽序列；二级结构主要以α-螺旋（77.42%）和无规则卷曲（17.74%）为主。从江香猪与其他猪源IFN-β基因核苷酸序列同源性为99.5%~100.0%，与禽的同源性最低（35.2%）；从江香猪与巴马猪、梅山猪IFN-β氨基酸同源性均为100.0%，但与贵州白香猪IFN-β同源性为99.5%，存在E43Q、K73R和C161R 3处氨基酸的差异。Western blotting结果显示，带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别，条带大小约为24 ku。本试验结果为进一步研究IFN-β基因生物学活性及加快从江香猪这一品种资源的有效利用提供参考依据。     

长白猪CIDEB基因真核表达载体构建及生物信息学分析

本研究旨在从长白猪肝脏组织中克隆与脂质存储相关的CIDEB基因编码区全长序列,并进行生物信息学分析,为研究其结构和功能奠定基础。根据NCBI中的猪CIDEB基因mRNA序列(登录号:NM001112688.1)设计特异性引物,采集长白猪新鲜的肝脏组织,提取RNA并反转录合成cDNA,以cDNA为模板进行PCR扩增,将PCR产物与pcDNA3.1+载体连接,转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆后进行生物信息学分析。结果显示:长白猪CIDEB基因编码区序列全长为660 bp,编码了219个氨基酸,与人同源性最高,为92.2%。对长白猪CIDEB蛋白进行生物信息学分析表明,CIDEB蛋白属于亲水性蛋白,不存在跨膜结构,属于CIDE-N家族成员之一,不同物种的CIDEB蛋白具有很高的保守性,其二级结构α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占44.29%、18.26%、8.22%、29.22%。本实验成功构建了CIDEB基因的全长真核表达载体,并对其核苷酸、氨基酸进行序列分析,为进一步研究和揭示长白猪CIDEB蛋白的结构与功能提供了基础材料。     

陆川猪PTTG1基因克隆及序列分析

试验旨在克隆陆川猪PTTG1基因全长CDS序列并对其进行生物信息学分析。利用GenBank公布的猪PTTG1预测序列设计引物,用RT-PCR扩增得到目的基因片段,并用生物信息学软件分析和预测了陆川猪PTTG1基因的理化性质与二级结构。结果表明,陆川猪PTTG1基因全长CDS序列为609 bp,编码202个氨基酸;其核苷酸序列与牛、黑猩猩、人、猕猴、大鼠、小鼠、原鸡和斑马鱼相对应序列同源性分别为90.15%、87.85%、87.52%、87.03%、76.03%、74.38%、55.74%和44.48%;PTTG1基因编码的蛋白无信号肽,属于亲水性蛋白,主要存在于细胞质中,存在16个磷酸化位点。氨基酸系统进化树分析表明,不同物种PTTG1基因在进化过程中具有高度保守性。本研究成功克隆了陆川猪PTTG1基因,为今后研究PTTG1基因在猪早期胚胎发育过程中的作用奠定理论基础。     

系统分析肝脏转录组解析猪脂肪沉积的分子调控机制

肝脏是调控猪能量平衡和代谢的重要器官。本研究选择松辽黑猪和长白猪背膘厚度显著差异的个体（每个品种内高、低各3头）为研究对象，利用高通量转录组测序技术鉴定其肝脏组织中基因的表达水平并进行差异表达分析，进一步对差异表达基因进行生物学功能分析。结果表明，在不同背膘厚度的比较中，共发现差异表达基因395个，其中部分参与了花生四烯酸代谢、谷胱甘肽代谢、P450细胞色素代谢过程、脂肪酸代谢、胰岛素抵抗、皮质醇的合成和分泌等通路。ACACA、ELOVL6、OGDHL、GSTO2、GGT5、CREB3L1等基因是肝脏中调控脂肪合成和代谢的关键基因。在不同品种猪中，鉴定出458个差异表达基因，显著富集在PPAR信号通路、细胞色素P450代谢通路、甘油三酯代谢通路、胆汁酸合成、MAPK信号通路、免疫相关通路等通路。PPAR信号通路和CD28、CD59、ICOS、CXCR4、FOS、INF等基因是影响不同品种猪生长性能和免疫性状差异的关键通路和基因。品种内与品种间脂肪沉积差异的分子机制并不相同。本研究对猪脂肪性状的遗传改良、肝脏功能解析有一定意义。     

猪CD4分子的全长cDNA克隆与序列分析

CD4分子为动物辅助性T细胞（TH）和部分胸腺细胞的共受体与信号传导分子，参与TCR介导的TH细胞活化和胸腺细胞分化过程。本研究应用RT-PCR和RACE技术从猪胸腺细胞总RNA中扩增克隆了猪CD4全长cDNA序列，并进行了序列特性分析。序列分析结果表明，在猪胸腺细胞和外周血淋巴细胞中存在2种方式剪接的CD4 mRNA转录本，其中一种mRNA转录本缺失编码40个氨基酸残基的120nt序列，提示该转录本可能编码猪分泌型CD4分子；猪CD4全长cDNA序列为2715nt。其中5′非编码区159nt，3′非编码区1183nt，1374nt的开放阅读框编码457个氨基酸的猪CD4前体蛋白（含4个糖基化住点）；猪CD4分子的7个Cys残基（Cys^43、Cys^122、Cys^327、Cys^418、Cys^421、Cys^444和Cys^446）和2个Ser残基（Ser^432和Ser^439）在动物种间保守；在猪CD4分子胞浆区．存在高度保守的Src家族蛋白酪氨酸激酶p56^kk。识别位点KKTCQC和内化相关双亮氨酸基序。推导氨基酸序列分析结果显示，猪与人、免、猫、狗和鼠CD4蛋白的氨基酸同源性分别为56．0％，54．5％。56．9％，56．5％和44．9％。     

广西巴马小型猪MyoD1基因克隆及其真核表达载体的构建

本研究旨在对广西巴马小型猪成肌细胞决定基因1(myoblast-determining 1,MyoD1)进行克隆分析,并构建MyoD1基因真核表达载体pEGFP-N1-MyoD1,为进一步研究该基因在广西巴马小型猪骨骼肌发育中的调控作用奠定基础。以广西巴马小型猪的肝脏组织为材料,应用RT-PCR技术克隆得到广西巴马小型猪MyoD1基因编码序列,对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,并构建该基因的真核表达载体,经过PCR和双酶切验证,通过脂质体转染,将重组质粒转染C2C12细胞,在细胞水平验证了该载体的正确性。结果显示,广西巴马小型猪MyoD1基因编码区序列长960 bp,编码319个氨基酸,核苷酸序列与猪、牛、水牛、绵羊、马、人、小家鼠、褐家鼠、家犬的同源性依次为99.7%、92.8%、92.9%、92.6%、91.5%、82.9%、82.9%、82.0%和90.9%;系统进化树分析表明,广西巴马小型猪MyoD1基因在不同物种及进化过程中具有高度保守性;蛋白质结构分析表明,MyoD1蛋白为膜外蛋白,在第4-116位氨基酸处存在1个MyoD家族标志性的MyoD结构域,对广西巴马小型猪、猪和人的MyoD1蛋白高级结构比较发现其具有极高的相似性。本研究构建的广西巴马小型猪MyoD1基因表达载体pEGFP-N1-MyoD1,转染C2C12细胞后产生绿色荧光信号,表明MyoD1基因在C2C12细胞中成功表达。     

广西巴马小型猪MyoD1基因克隆及其真核表达载体的构建

本研究旨在对广西巴马小型猪成肌细胞决定基因1(myoblast-determining 1,MyoD1)进行克隆分析,并构建MyoD1基因真核表达载体pEGFP-N1-MyoD1,为进一步研究该基因在广西巴马小型猪骨骼肌发育中的调控作用奠定基础。以广西巴马小型猪的肝脏组织为材料,应用RT-PCR技术克隆得到广西巴马小型猪MyoD1基因编码序列,对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,并构建该基因的真核表达载体,经过PCR和双酶切验证,通过脂质体转染,将重组质粒转染C2C12细胞,在细胞水平验证了该载体的正确性。结果显示,广西巴马小型猪MyoD1基因编码区序列长960 bp,编码319个氨基酸,核苷酸序列与猪、牛、水牛、绵羊、马、人、小家鼠、褐家鼠、家犬的同源性依次为99.7%、92.8%、92.9%、92.6%、91.5%、82.9%、82.9%、82.0%和90.9%;系统进化树分析表明,广西巴马小型猪MyoD1基因在不同物种及进化过程中具有高度保守性;蛋白质结构分析表明,MyoD1蛋白为膜外蛋白,在第4-116位氨基酸处存在1个MyoD家族标志性的MyoD结构域,对广西巴马小型猪、猪和人的MyoD1蛋白高级结构比较发现其具有极高的相似性。本研究构建的广西巴马小型猪MyoD1基因表达载体pEGFP-N1-MyoD1,转染C2C12细胞后产生绿色荧光信号,表明MyoD1基因在C2C12细胞中成功表达。     

猪ROCK1基因克隆、序列分析及时空表达研究

为进一步获得猪肉质性状候选基因Rho相关激酶1（Rho-associated，coiled-coil containing protein kinase 1，ROCK1）的序列特征、生物学功能及时空表达规律等信息，本研究通过PCR、SMARTer RACE PCR的方法克隆了猪ROCK1基因，应用生物信息学方法分析该基因的蛋白质序列在不同物种中的进化关系，并采用RT-PCR和实时荧光定量PCR的方法检测其在不同组织和不同猪种背最长肌不同发育阶段的表达。结果显示，ROCK1基因有2个转录本，包含4 065 bp的开放阅读框（ORF），编码1 354个氨基酸；猪ROCK1基因ORF序列与人、小鼠和大鼠的ORF序列的同源性分别为95%、91%和91%，相应的氨基酸序列同源性分别为98%、96%和94%，该蛋白在不同物种间高度保守；ROCK1基因的组织分布较广泛，不同发育阶段在同一组织中的表达会发生变化；胚胎期ROCK1基因在梅山猪背最长肌中的表达极显著高于大白猪（P < 0.01），出生后ROCK1基因在2个猪种背最长肌中的表达无显著差异（P > 0.05）。本试验结果为研究ROCK1基因在猪骨骼肌发育中的生物学功能及其分子机制奠定基础。     

成华猪γ-干扰素基因分子克隆与序列分析

为研究猪γ—干扰素在抗御传染性疾病和肿瘤生物治疗中的免疫增强作用，本实验以ConA刺激成华猪外周血淋巴细胞提取激活淋细胞的mRNA，设计合成特异的引物序列，应用反转录—聚合酶链式反应(RT—PCR)扩增和克隆成华猪IFN—γ基因并进行序列5ll定。成华猪IFN—γcDNA约长500bp，从第68位核苷酸开始编码其信号肽，到569位核苷酸为终止子。IFN—γ基因的开放框架(ORF)由498bp构成，编码166个氨基酸。成华猪IFN—γ与猪IFN—γ基因核苷酸间同源性为98％，在261—269存在点突变，在氨基酸水平完全一致。IFN—γ氨基酸与鼠同源性为30％，与人同源性为40％。     

陆川猪PLIN5基因的克隆和序列分析

为了研究陆川猪背最长肌围脂滴蛋白5(PLIN5,Perilipin5)基因的结构和功能,试验对陆川猪PLIN5基因进行RT-PCR扩增,所得产物经转化获得含目的基因的重组质粒pMD19-T-PLIN5,经菌落PCR扩增和测序鉴定正确后利用生物信息学方法对陆川猪PLIN5基因的结构、理化性质及其编码蛋白信号肽、跨膜结构、亚细胞定位等进行分析,并探讨了陆川猪与其他物种PLIN5氨基酸序列的进化关系。结果表明:PLIN5基因编码区(CDS)序列长度为1 377 bp,编码458个氨基酸,与NCBI上公布的野猪PLIN5基因序列中的编码区存在4个碱基差异,均为错义突变;陆川猪PLIN5蛋白不存在信号肽,没有跨膜结构域,不存在N糖基化位点;二级结构中α-螺旋占47.16%,无规则卷曲占43.67%,延伸链占9.17%;陆川猪PLIN5基因在不同物种及进化过程中具有较高的保守性,该基因编码的蛋白符合一般Perilipin超家族的结构特征。     

家禽IGF-I基因与经济性状相关研究进展

胰岛素样生长因子-I（IGFs—I）是胰岛素样生长因子（IGFs）家族成员之一，是生长激素发挥促生长作用的主要介导因子。本文综述了近年来在家禽IGF—I基因的结构、IGF-I在组织中的表达水平、IGF-I与体重体型、屠宰性能、产蛋性能相关的研究进展，旨在为进一步研究家禽IGF—I基因与经济性状相关研究提供参考。     

猪STARD3NL基因克隆和表达谱分析

本研究旨在克隆猪STARD3 NL(STARD3N-terminal like protein)基因,对其基因结构进行分析,并研究该基因在猪不同组织中的表达特性。采用5′和3′-RACE以及RT-PCR方法克隆猪STARD3 NL基因,利用生物信息学方法预测蛋白结构,应用qRT-PCR技术检测组织表达特性。结果表明,猪STARD3 NL基因的cDNA序列长度为1 319bp(GenBank登录号:HQ634946),编码235个氨基酸,该氨基酸序列与其他物种相比一致性较高;进化树分析表明,猪STARD3NL氨基酸序列与牛和绵羊的关系较近,与斑马鱼的进化关系最远。STARD3NL氨基酸序列包含保守的MENTAL结构域,为疏水蛋白,包含4个跨膜螺旋区;二级结构主要是α-螺旋,占60%;该蛋白不存在信号肽,不是分泌蛋白;亚细胞定位显示,该蛋白存在于内质网的概率为39.1%。qRT-PCR分析表明,STARD3 NL基因在所检测猪的14种组织均有表达,在肝中表达水平最高,在眼肌中的表达水平最低;莱芜猪和大长猪被圆环病毒感染后,STARD3 NL基因在2种猪肺组织中的表达水平差异不显著(P0.05)。研究结果将为进一步研究STARD3 NL基因的结构和功能以及猪抗病育种提供资料。     

从江香猪IFN-β基因的序列分析及原核表达

试验旨在探明从江香猪β-干扰素(interferon-beta,IFN-β)基因编码区分子序列及原核表达产物特征。以从江香猪为研究对象,提取肝脏总RNA并反转录为cDNA,设计特异性引物扩增IFN-β基因编码区,将目的基因片段克隆至原核表达质粒pET-28a上,获得重组质粒pET28a-CJpoIFN-β,并利用生物学软件对江香猪IFN-β基因编码区进行序列分析;将鉴定正确的重组质粒pET28a-CJpoIFN-β转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE与Western blotting分析原核表达蛋白。结果表明,从江香猪IFN-β基因编码区长为561bp,编码186个氨基酸;该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸为信号肽序列;二级结构主要以α-螺旋(77.42%)和无规则卷曲(17.74%)为主。从江香猪与其他猪源IFN-β基因核苷酸序列同源性为99.5%～100.0%,与禽的同源性最低(35.2%);从江香猪与巴马猪、梅山猪IFN-β氨基酸同源性均为100.0%,但与贵州白香猪IFN-β同源性为99.5%,存在E43Q、K73R和C161R3处氨基酸的差异。Western blotting结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别,条带大小约为24ku。本试验结果为进一步研究IFN-β基因生物学活性及加快从江香猪这一品种资源的有效利用提供参考依据。     

猪DNM2基因克隆、序列分析与组织表达谱研究

本研究旨在对猪发动蛋白2（dynamin-2,DNM2）基因进行克隆和生物信息学分析,并探讨DNM2基因在猪不同组织中的表达情况。利用RT-PCR结合RACE方法克隆猪DNM2基因cDNA部分序列,与猪表达序列标签进行拼接,获得猪DNM2基因cDNA全长,并对其进行生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR检测DNM2基因在猪不同组织中的表达情况。结果表明,猪DNM2基因的开放阅读框（open reading fram,ORF）为2 616 bp,共编码871个氨基酸。DNM2相对分子质量为98 071.30,等电点（pI）为7.04;无信号肽和跨膜结构域,即该蛋白不属于分泌蛋白;DNM2蛋白的二级结构预测发现,构成α-螺旋、β转角、无规则卷曲、延展链的氨基酸数量分别为361、53、335和122个。多重分析结果显示,猪DNM2基因与牛、人、小鼠、大鼠的序列同源性分别为92.6%、91.8%、88.6%和89.3%;进化树分析表明,DNM2基因在物种间具有较高的保守性,不同物种间DNM2基因序列的差异符合物种间的进化性。实时荧光定量PCR结果显示,DNM2基因在脾脏中表达量较高,在乳腺、腿肌、输卵管、卵巢和子宫中表达量均较低。本研究结果为今后深入研究DNM2基因的生物学功能奠定了基础。