牛传染性鼻气管炎PCR检测方法的建立

根据牛传染性鼻气管炎病毒gB基因序列设计一对引物,进行PCR检测,并对反应条件及反应体系进行优化。结果得到与预期大小(362bP)一致的特异性片段。最佳退火温度为58～64℃,Mg2 最佳浓度为1.6mM,dNTPS为0.36mM,引物为0.2pmol/uL,聚合酶0.8U/100uL。用这对引物扩增IBRV、HCV、PRRSV、PRV,只有IBRV扩增出特异性条带。该PCR方法的检测灵敏度为2.4ng/100uL,较其他方法敏感。     

牛传染性鼻气管炎病毒LAMP检测方法的建立

为建立一种利用颜色判定的快速、简单、灵敏度高的检测方法,即可视化环介导等温扩增(LAMP)方法,采用针对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)基因保守序列设计的特异引物,优化反应条件,建立了IBRV LAMP检测方法,并进行了特异性和灵敏性试验。结果显示,所建立的LAMP方法具有良好的特异性,其检出灵敏度为10~3 copies/μL,仅需1 h即可肉眼观察检测结果。结果表明,本试验建立的LAMP方法可用于IBRV的进出口检疫。     

牛传染性鼻气管炎病毒双重PCR检测方法的建立

为建立牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的双重PCR检测方法,根据GenBank中登录的IBRV gE和gB基因序列,设计2对特异性引物。结果表明,建立的方法特异性强,对牛支原体、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒、巴氏杆菌、牛和羊布鲁菌进行检测,结果均为阴性。研究表明,所建立的双重PCR检测方法具有快速、敏感、准确等优点,可以用于IBRV的检测。     

牛传染性鼻气管炎诊断方法研究进展

进行牛传染性鼻气管炎分子流行病学调查时,首先通过临床症状观察进行初诊,然后再进行实验室确诊。目前实验室诊断主要包括病原学诊断和血清学诊断。病原学诊断方法包括包涵体检查、病毒分离和病毒核酸检测;血清学诊断方法包括中和试验、琼脂扩散试验、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验和变态反应。有时还要进行鉴别诊断,鉴别诊断主要有单克隆抗体法、鉴别PCR等。牛传染性鼻气管炎在世界范围内流行,给全球的养牛业造成了很大的影响。论文综述了牛传染性鼻气管炎诊断方法研究进展,为预防和消除该病提供参考。     

牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)保守基因gB和gE序列,分别设计两对引物及其相应的TaqMan探针,建立、优化反应体系后,利用10倍稀释的病毒进行扩增以检测其灵敏度,同时对伪狂犬病病毒(PRV)、马立克病病毒(MDV)、鸭瘟病毒(DPV)进行特异性检测.结果显示,建立的扩增gB和gE基因的荧光PCR可用于检测IBRV,其灵敏度为0.02 TCID50,而与PRV等非IBRV无交叉反应.本研究所建立的荧光PCR具有快速、灵敏、准确、低污染等优点,可用于IBRV的检测.     

牛传染性鼻气管炎病毒LUXTM新型荧光PCR检测方法的建立

本研究针对牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）高度保守的gC基因设计单标记并具有自身荧光淬灭功能的LUX^TM引物，建立L刚新型实时荧光PCR方法用于快速检测IBRV。该方法对四株IBRV细胞培养物的检测均呈典型阳性反应，而对其它动物疱疹病毒以及健康牛组织DNA和细胞对照的检测结果为阴性，检测时间包括核酸提取仅需1h～2h。试验表明，LUX^TM荧光PCR法对IBRV细胞增殖病毒液的检测敏感性可达0．04TCID50，比病毒分离敏感性至少提高10倍；对10倍系列稀释的纯化IBRV核酸样品，L刚荧光PCR的检测敏感性比常规PCR可提高10^3倍。将病毒液添加到健康牛精液和血液样品中，该荧光PCR可检测到牛冻存精液中40TCID50牛抗凝全血、血清和临床精液中0．04TCID50的病毒，说明对临床样品的检测有效。本研究所建立的LUXTM荧光PCR方法快速敏感，适合应用于活牛及其遗传物质的进出口检疫、养牛业疾病防控等领域对IBRV的快速检测。     

牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒双重PCR检测方法的建立与应用

为建立一种针对牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinortracheitis virus,IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的双重PCR检测方法,根据GenBank中IBRV gB(UL27)和BVDV 5’-UTR基因序列分别合成特异性引物,优化反应条件,建立了能够同时检测IBRV和BVDV的双重PCR方法,并对其特异性、敏感性、重复性进行了测试。结果显示：该方法对IBRV、BVDV和IBRV/BVDV可分别扩增出500、198、500/198 bp的特异性目标条带,对牛呼吸道合胞体病毒、牛冠状病毒、牛细小病毒、牛纽布病毒和牛支原体检测结果均为阴性;对混合液中IBRV、BVDV的最低检测限分别为10⁴和10³ copies/μL;3次重复性试验结果一致。采用建立的方法对79份临床可疑牛血清样品进行IBRV、BVDV和IBRV+BVDV检测,阳性率分别为12.66%、17.72%和8.86%,与IBRV和BVDV单重PCR检测结果符合率分别为90.00%...     

牛传染性鼻气管炎病毒gE基因LAMP检测方法的建立

根据Gen Bank收录的BHV-I NM06株的gE基因序列,利用软件Primer Explorer V4设计2对LAMP引物,建立IBRV gE基因的LAMP检测方法;利用重组质粒进行了敏感性检测,利用IBRV、牛病毒性腹泻-黏膜病病毒、牛轮状病毒等进行特异性试验,并对临床采集的50份奶牛鼻腔拭子DNA进行了检测。结果显示,建立的LAMP方法能对重组质粒DNA产生阳性反应,在58℃~65℃8个温度进行反应,结果无肉眼可见差异,反应最短时间达90 min时可见到阳性结果;该方法的检测下限是1.68×10~4拷贝/μL,对6种其他微生物呈阴性反应;50份临床样品中检出2份阳性。表明本研究初步建立了IBRV gE基因的LAMP快速检测方法,可用于IBRV分离株的鉴定以及临床样品的快速检测。     

牛传染性鼻气管炎病毒免疫学检测方法研究进展

牛传染性鼻气管炎（传染性脓疱外阴阴道炎）是由牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）感染引起的传染病,流行范围较广。该病在临床上主要有呼吸道和生殖道两种表现型,引发多种症状,给牛养殖业造成了巨大的经济损失。病毒侵入牛体后造成持续性感染,病牛长期或终生带毒,给防控带来极大困难,IBR的综合防控依赖于精准的检测方法。基于抗原-抗体特异性识别反应的免疫学检测方法在特异性、敏感性、样品前处理简便性、现场适用性、检测效率等方面优势突出。IBRV的gB蛋白、gC蛋白、gE蛋白、gG蛋白等常被作为靶抗原进行检测试剂盒的研发,从IBRV的基因组结构、结构蛋白特点、选用的IBRV毒株、靶抗原的表达方式、酶联免疫吸附法和胶体金免疫层析法的建立、不同方法的符合率等方面综合论述了IBRV免疫学检测方法的研究进展,以期为该病原快速、精准、便捷的检测诊断试剂的研发提供参考。     

牛传染性鼻气管炎病毒内标荧光定量PCR检测方法的建立与应用

根据牛疱疹病毒1型(BHV1)gB基因序列,设计高度保守的引物和荧光探针,并扩增包含有荧光PCR扩增区域的核酸片段,通过凝胶纯化回收,将该片段克隆至pMD18-T载体,经鉴定后获得目标模板。通过碱基重排和引物设计,用搭桥法PCR扩增,获得BHV1荧光定量PCR内标模板。对内标模板的添加量和反应条件进行优化,建立了含有内标物的荧光定量PCR检测体系。该体系可以检测到10个拷贝/PCR反应的重组质粒,对BHV1可检测到0.01TCID50的病毒粒子,灵敏度比常规PCR和病毒分离高10～100倍,与不加内标的荧光PCR检测灵敏度相当。更重要的是,内标模板可以对反应体系进行监测,指示并校正假阴性结果,从而达到提高PCR检测准确率的目的。对临床收集的40份牛精液(其中8份已经鉴定为阳性)和10份牛鼻腔拭子(其中2份已经鉴定为阳性)用该体系进行检测,均得到预期结果。该方法的建立可用来对临床样品中BHV1的快速检测和实验室的质量控制。     

奶牛传染性鼻气管炎病毒gG基因PCR检测方法的建立

本试验旨在建立一种PCR技术,既能快速检测牛传染性鼻气管炎病毒,又能区分同属病毒牛疱疹病毒5型和伪狂犬病病毒。根据基因库中牛传染性鼻气管炎病毒gG基因的特异性引物,建立PCR方法,对牛传染性鼻气管炎病毒参考毒株和阳性样本进行扩增,结果均能扩增出一条463 bp的特异性条带;对同属的牛疱疹病毒5型进行扩增,获得651 bp和431 bp两条带;对同属伪狂犬病病毒进行扩增,获得493 bp的条带;而非相关病毒(如猪呼吸与繁殖综合征病毒等),不能扩增出条带。对牛传染性鼻气管炎病毒的检测灵敏度为2×10^-3 PFU/mL。鉴于该方法具有良好的灵敏度和特异性,将在牛疱疹病毒感染诊断和标记疫苗免疫后的鉴别诊断方面具有良好的应用前景。     

牛传染性鼻气管炎病毒内蒙古分离株gG基因的PCR扩增

参考牛传染性鼻气管炎病毒全基因序列(GenBank)设计1对特异性引物,以牛传染性鼻气管炎病毒内蒙古分离株提取的总DNA为模板,运用PCR方法成功地扩增出牛传染性鼻气管炎病毒内蒙古分离株gG基因,并用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。     

Establishment and Application of Quantitative Real-time PCR Detection Method for Feline Infectious Rhinotracheitis Virus

Feline herpesvirus type 1 (FHV-1) is the pathogeny of feline infectious rhinotracheitis.Based on the sequence of gD gene of FHV-1, one pair of primers(FHV-1F and FHV-1R) and FHV-1Probe were designed for the quantitative Real-time PCR detection method.The results showed that the method could detect FHV-1 DNA specifically and the sensitivity was 75 fg/μL.The reaction efficiency reached 107%, and the R² value was 0.9965.The coefficient of variance(CV) was below 2%.And the method was more sensitive than common PCR.It was specific, stable, and suitable for clinical diagnosis, detection and epidemiological investigation.Using this method, the Shanghai area pet clinic censorship suspected FHV-1 infected samples were detected, and the positive rate reached 27.78%, which indicated that the incidence of FHV-1 in Shanghai area was at a high level.     

猫传染性鼻气管炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

猫传染性鼻气管炎(FIR)病毒是引起猫传染性鼻气管炎的病原,属于猫疱疹病毒1型(FHV-1)。选择FHV-1gD基因设计1对引物FHV-1F、FHV-1R和探针FHV-1Probe,建立FHV-1实时荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法可以特异地检测出FHV-1的DNA,敏感性达到75fg/μL,反应效率达到107%,R²值为0.9965,Ct值的变异系数低于2%。FHV-1实时荧光定量PCR检测方法敏感性高于普通PCR,特异性好、稳定性好,适用于FHV-1的临床诊断、检测和流行病学调查。利用该方法对上海地区宠物门诊送检的疑似FHV-1感染的样品进行检测,其阳性率达到27.78％,表明上海地区宠物猫FHV-1的发病率处于较高水平。     

牛传染性支气管炎病毒PCR诊断方法的研究

根据已发表的牛传染性鼻气管炎病毒（ＩＢＲＶ）ｇＢ基因序列,应用ｏｌｉｇｏ４．１程序设计一对引物ＰＢ１／ＰＢ２,分别对ＩＢＲＶＬＡ株、洛精、美精、ＢａｒｔｈａＮｕ／６７株、Ｂ７株、云南－１和云南－２分离株进行ＰＣＲ扩增。结果显示７株ＩＢＲ病毒ＤＮＡ均有３９９ｂｐ的特异性片段。用此引物对其同属的伪狂犬病毒（ＰＲＶ）、马立克氏病毒（ＭＤＶ）、鸡传染必喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）进行扩增。均未见特异性条带,证     

牛传染性鼻气管炎病毒攻毒方式的对比研究

本试验旨在建立牛传染性鼻气管炎病毒的攻毒模型,明确病毒在牛体内的分布及确定最佳攻毒方式,建立牛传染性鼻气管炎的发病标准,用来评价IBRV LNM弱毒疫苗的保护效力。试验共使用健康断乳牛9头,设鼻内喷雾组、滴鼻组和对照共3组,每组3头牛。将实验室分离保存的IBRV LN01/08强毒株采用鼻内喷雾和滴鼻两种方式接种试验组动物后,连续14 d,每日观察临床症状,监测体温及采集鼻拭子,对收集的试验数据进行对比分析。选取临床发病不同时期剖杀动物,采取主要脏器进行病毒分离。结果显示,所有动物攻毒后有不同程度的临床表现,以鼻内喷雾组临床表现最为严重,剖检可见肺部病变明显。病毒主要分布在呼吸道和眼结膜组织中。研究结果显示,采用IBRV自然感染方式攻击动物,喷雾方法攻毒临床效果明显强于滴鼻方式,保证了临床发病模型的建立,可以用来IBRV疫苗免疫效果评价,为研制IBR疫苗提供前提基础。     

多重PCR技术同时检测牛传染性鼻气管炎和赤羽病方法的建立和应用

为满足同时对IBRV和AKAV进行快速诊断的需要,根据牛疱疹病毒1型(BHV 1)gB基因序列和赤羽病病毒(AKAV)的S基因序列,设计了2对针对这2种病毒的特异引物,并建立了多重PCR方法,分别对其最佳反应条件、特异性及敏感性进行了测定,结果表明:该方法能同时扩增得到2条与试验设计相符的311 bp(I BRV)和392 bp(AKAV)特异性条带;IBRV的灵敏度为0.13 pg/25μL,AKAV的灵敏度为1.04 pg/25μL。本试验方法的建立对于加强进出口牛IBRV和AKAV的检验检疫具有十分重要的意义。