正交设计优化草地早熟禾SRAP-PCR反应体系及引物筛选

采用L9(34)正交试验设计方法,对草地早熟禾(Poa pratensis)基因组DNA SRAP PCR反应体系中的Taq DNA聚合酶、Mg2+、引物及dNTP四因素的用量进行优化,并比较不同模板DNA用量对扩增的影响,建立草地早熟禾SRAP PCR最佳反应体系,同时,利用该体系对SRAP引物进行筛选。结果表明,草地早熟禾SRAP PCR最佳反应体系为Taq DNA聚合酶1.0 U、Mg2+ 1.75 mmol·L-1、引物0.25 μmol·L-1、dNTP 220 μmol·L-1、40 ng模板DNA、2 μL 10×PCR buffer,总体积20 μL。运用该体系从100对SRAP引物中筛选出43对引物能够产生清晰稳定的扩增条带且多态性丰富。优化体系的建立及引物的筛选可为今后利用SRAP标记技术对草地早熟禾进行遗传多样性分析、图谱构建、种质资源鉴定奠定技术基础。     

狗牙根SRAP-PCR反应体系优化及引物筛选

利用正交设计,从Mg2 、dNTP、引物浓度和DNA聚合酶4种因素3个水平以及不同的模板DNA浓度来优化狗牙根SRAP-PCR反应体系,并对引物进行了全面筛选。狗牙根SRAP-PCR优化反应体系结果为:2μL 10×buffer4、0 ng模板DNA、Mg2 1.25 mmol/Ld、NTP 260μmol/L、引物0.2μmol/L、Taq DNA聚合酶1.0 U,总体积20μL。运用该结果从90对引物中共筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SRAP引物34对。优化体系的建立及其引物的筛选为今后利用SRAP标记技术进行狗牙根遗传分析、图谱构建、基因定位与种质资源鉴定奠定了技术基础。     

海雀稗SRAP-PCR分子标记体系优化及引物筛选

以4个代表性海雀稗（Paspalum vaginatum）种质的叶片DNA为模板,采用L₉（3⁴）正交试验设计,对影响海雀稗SRAP-PCR反应的Mg²⁺、dNTP、引物和TaqDNA聚合酶的用量进行了优化,并比较了不同浓度模板DNA对扩增的影响,以确定适合海雀稗的SRAP-PCR最佳反应体系。结果表明：海雀稗SRAP-PCR最佳反应体系为10×PCR buffer 1 μL、模板DNA50 ng、Mg²⁺2.5 mmol·L^-1、dNTP150 μmol·L^-1、引物0.4 μmol·L^-1、TaqDNA聚合酶1.0 U,总体积10 μL。利用该反应体系从100对引物中筛选出可扩增清晰条带的引物83对,在83对引物中选出多态性丰富的引物44对。SRAP-PCR反应体系的优化及引物筛选,为今后利用SRAP标记技术进行海雀稗遗传多样性研究、基因定位、遗传图谱的构建以及分子标记辅助育种提供技术支持。     

假俭草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以假俭草为材料,对影响ISSR—PCR扩增结果的因素进行了探讨,建立了适合假俭草ISSR—PCR分析的最佳反应体系。表明在20弘L总体积中,包含40ng模板DNA、ISSR引物0．4umol／L、dNTPs0．1mmol／L、Mg^2＋1．0mmol／L、0．1U TaqDNA聚合酶和10×buffer 2．0uL。扩增条件为．94℃预变性5min;94℃变性45s,55℃退火45s,72℃延伸1．5min,35个循环;72℃延伸7min。     

假俭草研究进展

综述了假俭草品种选育、形态学、坪用价值、抗寒性和分子标记的研究进展,提出假俭草抗寒性是其坪用价值的限制因素。     

虉草ISSR-PCR反应体系优化与引物筛选

22个虉草基因组DNA为ISSR-PCR扩增模板,采用单因素试验方法,对影响PCR扩增体系中dNTP、引物浓度、Taq酶和模板DNA用量4个因素及引物退火温度进行梯度试验,优化得到最佳的ISSR-PCR反应体系,即20μL反应体系中分别加入0.3μL Taq DNA聚合酶(5U/μL),2μL 10×PCR Buffer(mg2+plus),1.5μL dNTP(2.5mmol/L),1.5μL引物(10pmol/μL),50ng模板DNA,ddH2O补足体积。以此体系对24条引物进行筛选,最终获得了多态性高,重复性好的引物12条。引物UBC808、809、811、815、818、820、826的适宜退火温度为55℃,引物835,841和842的适宜退火温度为56℃,而引物810和834的适且退火温度分别为52℃和54℃。12条引物共扩增总条带数192条,其中,多态性条带数173条,多态位点百分率89.81%。     

红毛丹ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

红毛丹ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选     

SRAP分子标记在假俭草杂交后代真实性鉴定中的应用

以假俭草(Eremochloa ophiuroides(Munro)Hack)两个杂交组合的4个亲本(E022、E142、E102、E092(1))及其杂交后代为材料,从400对SRAP引物组合中筛选出具有父本特征带的引物,选取其中带型稳定、清晰的引物组合进行杂种真实性鉴定。结果表明:(1)A(E102×E092(1))组合的两个亲本间具有父本特征带的引物组合共有51对,B(E142×E022)组合的两个亲本间具有父本特征带的引物组合共有87对。(2)应用6对SRAP引物(303、297、283、180、332和358)对A(E102×E092(1))组合进行杂种真实性鉴定,其中真杂种数目为89个;应用4对SRAP引物(18、199、221和288)对B(E142×E022)组合的杂交后代进行真实性鉴定,其中真杂种的数目是83个。上述鉴定的假俭草真杂种可以用于构建假俭草遗传连锁图谱及重要性状的QTL定位等研究。     

航天搭载紫花苜蓿SSR-PCR反应体系的优化以及引物的筛选

航天育种的变异频率高、变异幅度大、有益变异多、稳定性强,优势明显。依据正交试验设计原理,设计了用正交试验和细调正交试验来确定航天搭载紫花苜蓿SSR-PCR反应体系中各成分的浓度,从dNTP、Taq酶、Pri mers、Mg2+4种因素对航天搭载紫花苜蓿SSR-PCR反应体系进行了优化,得到适合航天搭载紫花苜蓿SSR-PCR最佳反应体系,即25μL的反应体系中含有dNTP 0.2 mmol/L、TaqDNA聚合酶2U、引物0.7μmol/L、Mg2+2.5 mmol/L、以及10×buffer和60 ng模板DNA。在试验确定最佳反应体系基础上,对17对SSR引物进行筛选,选出6对扩增条带信号强、背景清晰的引物。     

正交设计优化山野豌豆ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应体系与引物筛选

 采用正交试验设计,以山野豌豆叶片ＤＮＡ 为模板,从Ｍｇ^２＋ 、ｄＮＴＰ、引物和ＴａｑＤＮＡ 聚合酶４种因素３个水平,对山野豌豆ＳＲＡＰ－ＰＣＲ 反应体系进行优化,并比较了不同浓度模板ＤＮＡ 对扩增效果的影响,建立了山野豌豆的ＳＲＡＰ－ＰＣＲ 最佳反应体系。结果表明,山野豌豆ＳＲＡＰ－ＰＣＲ 最佳反应体系为：２μＬ１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ（不含Ｍｇ^２＋ ）、３０ｎｇ的模板ＤＮＡ、引物２．０μｍｏｌ／Ｌ、Ｍｇ^２＋ ２．０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＴａｑＤＮＡ 聚合酶１．５Ｕ、ｄＮＴＰ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ,总体积为２５μＬ。各因素对扩增反应结果均有不同影响,其中以引物浓度影响最大,ｄＮＴＰ 浓度的影响最小。运用该体系对３份山野豌豆种源进行验证,证明该体系稳定可靠,并从９８对ＳＲＡＰ 引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的２０对引物组合。这一体系的建立及多态性引物组合的筛选为ＳＲＡＰ分子标记技术进行山野豌豆分子遗传学研究奠定了基础。     

本氏针茅SRAP PCR反应体系的建立及引物筛选

以本氏针茅（Stipa bungeana）幼嫩叶片为材料,建立适合本氏针茅基因组DNA提取的改良CTAB法,在此基础上采用正交试验设计和单因素分析相结合的方法,对本氏针茅SRAP PCR反应体系中的5个主要因素（DNA、Taq酶、dNTPs、Mg2+和引物）进行优化,旨在建立适合本氏针茅SRAP分析的反应体系。结果表明,在20 μL总的反应体系中各组分的加入量分别为：DNA（20 ng·μL-1）3 μL、Taq DNA酶(5 U·μL-1)0.2 μL、dNTPs（2.5 mmol·L-1)1.4 μL、引物（10 μmol·L-1）1.0 μL、Mg2+ (25 mmol·L-1)2.0 μL、10×Buffer 2.5 μL、ddH2O 8.9 μL。体系验证和引物筛选试验表明,该体系适于本氏针茅遗传多样性分析,该体系的建立可为本氏针茅种质资源遗传多样性研究和黄土高原植被恢复及生态建设提供理论基础。     

农杆菌介导的假俭草遗传转化体系的建立

以假俭草优良种质‘E126’为受体材料,以HPT基因为报告基因,通过农杆菌介导法转入ZjDREB1基因。研究了转化体系中筛选剂和抑菌素对胚性愈伤组织生长和绿苗分化的影响,以及菌液浓度、侵染时间和共培养时间对转化效率的影响。结果表明,愈伤筛选和再生苗筛选的最佳潮霉素浓度均为30 mg/L,头孢霉素作为抑菌素的最佳浓度为400 mg/L;菌液OD₆₀₀值为0.3,侵染30 min,共培养3 d为最优转化条件。经PCR检测,初步获得10株转基因植株。     

假俭草的形态特征及其草坪质量评价

结合植物生态学与生物统计学的方法,从叶和茎两个方面研究了假俭草的外部形态特征,并对其草坪质量进行了综合评价。结果表明,叶片的形态特征指标基本符合草坪草的要求;假俭草的匍匐茎和直立茎在形态上存在较大差异;假俭草草坪具有优良的景观质量,适合建植各种类型的草坪,尤其适合建植保土草坪。     

假俭草杂交试验初报(简报)

假俭草(Eremochloa ophiuroides (Munro.)Hack.)起源于中国中部和南部,以养护水平低、容易建植、耐贫瘠且病虫害少而著称,是国外公认的中国最好的暖季型草坪草,所以又称为“中国草坪草”(Chinese lawn grass)^[1]。虽然假俭草主要分布在中国,而且我国的东部和南部很可能是假俭草的起源中心^[2],但它真正得到深入研究和广泛应用的国家却是美国。江苏省中国科学院植物研究所自1993年起就开始了假俭草种源的收集工作,并对其进行了初步评价。结果表明,不同种源的假俭草在茎色、柱头色泽、花药色泽、匍匐茎长、草层高度、叶长、以及单位小花数和种子产量上都存在丰富的变异^[3、4]。     

中国假俭草种质资源物候期的变异分析

对供试的37份假俭草种源的物候期进行了连续3年的观测分析,结果表明:①假俭草种质资源的物候期变异范围大小依次为:孕穗初期(5月28日至8月24日)＞盛花期(7月27日至9月27日)＞结实期(9月18日至10月25日)＞枯萎期(11月15日至12月3日)＞返青期(4月13日至4月30日).生育期变异范围为145～187d,而青绿期为203～228d.②假俭草种质资源的孕穗初期与盛花期、结实期、枯黄期、生育期呈极显著的正相关,盛花期与结实期和生育期呈极显著的正相关;返青期与生育期和青绿期呈极显著的负相关,而枯黄期与生育期和青绿期呈极显著的正相关,同时返青期与枯黄期之间没有显著的相关关系,说明通过系统选育,可以选育出一些青绿期相对较长的优良选系.③假俭草种源的孕穗初期、盛花期、结实期和生育期随纬度的增加而日趋提前.④在欧氏距离15.4处可将种源分为两大类,即早熟型和晚熟型,早熟型较晚熟型生育期平均短18.4d.     

结缕草属植物SRAP－PCR体系的建立和优化

以ＳＤＳ法提取的结缕草属植物叶片ＤＮＡ 为模板,分别采用单因子试验和正交设计试验２种方法,对影响结缕草属植物ＳＲＡＰ－ＰＣＲ 的MG²⁺ 、ｄＮＴＰ、引物、ＴａｑＤＮＡ 聚合酶和模板ＤＮＡ 五个因素进行优化试验。单因子试验分别研究各因素在多水平条件下对ＳＲＡＰ－ＰＣＲ 反应体系的影响,得到最佳反应条件。正交设计采用Ｌ１６（４５）方案,综合考虑各因素间的相互作用,通过直观分析法获得各影响因素的最佳反应水平。根据４对引物对６ 份结缕草属植物材料扩增结果的验证比较,２种方法所获得的最佳反应体系存在一定的差异。通过综合比较和分析２种方法的优化体系扩增出的条带数、多态性条带数及多态性比率,最终建立了结缕草属植物ＳＲＡＰ－ＰＣＲ 的最佳反应体系：MG²⁺２．００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｄＮＴＰ２２０μｍｏｌ／Ｌ、引物０．２０μｍｏｌ／Ｌ、ＴａｑＤＮＡ 聚合酶０．５０Ｕ、模板ＤＮＡ６０ｎｇ、２μＬ１０×ｂｕｆｆｅｒ,总体积为２０μＬ。这一优化体系的建立为今后利用ＳＲＡＰ标记技术进行结缕草属植物遗传多样性、种质鉴定、遗传连锁图谱及亲缘关系分析等方面的研究提供了科学的依据。