宏基因组学揭示瘤胃微生物多样性及功能

反刍动物瘤胃内栖息着庞大和复杂的微生物群体,这些微生物与宿主的消化吸收、营养代谢和免疫功能息息相关,宿主及其微生物共同组成了一个"超级生物体"。由于绝大部分瘤胃微生物不可培养,因此以厌氧培养为基础的传统研究方法存在明显的弊端。宏基因组学通过高通量的测序方法,能够全面展示微生物多样性,准确发现新的功能基因。此外,宏基因组学揭示了宿主基因和微生物组之间的互作关系。随着组学技术的不断发展,宏基因组学在瘤胃微生物组研究方面具有广阔的应用前景。     

宏基因组学揭示二氟沙星对牦牛瘤胃微生态及CAZy谱影响

反刍动物瘤胃微生物结构和功能关系到生态系统正常的物质循环、能量流动。为了探讨抗生素对瘤胃微生态的影响,揭示抗生素对反刍动物瘤胃微生物影响的规律,以牦牛为研究对象,进行二氟沙星(DIF)处理,采集瘤胃液,提取DNA,采用宏基因组学方法分析DIF对瘤胃微生物组成及碳水化合物酶类(CAZy)的影响。结果显示,拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)等相对丰度下降,而厚壁菌门(Firmicutes)、广古菌门(Euryarchaeota)等增加。普雷沃菌属(Prevotella)、拟杆菌属(Bacteroides)等相对丰度下降,而金黄杆菌属(Chryseobacterium)、链球菌属(Streptococcus)等增加;CAZy酶类中,CBM17、CBM25等丰度上调(P0.01或P0.05);GH53、CE8、CE13、CBM21、CBM26及对接蛋白(dockerin)等下调(P0.01或P0.05)。结论:DIF影响瘤胃微生物结构,并不同程度改变各优势门、属的相对丰度,抑制部分有益菌的作用;改变CAZy酶中部分家族基因丰度,影响瘤胃微生物对淀粉及果胶的降解作用,降低瘤胃微生物降解植物纤维素的效率。     

宏基因组学用于瘤胃微生物代谢的研究进展

瘤胃微生物生态群落是一个非常复杂的生物体系,有着巨大的基因资源以及丰富的生态资源.宏基因组学通过免培养技术,研究生境中全部微小生物遗传物质的总和,在研究瘤胃微生物代谢和开发瘤胃微生物资源上展示出强劲的优势.该技术的应用有望解决反刍动物营养研究中诸多热点或难点问题.为此,本文介绍了宏基因组文库构建和筛选流程,详细讨论了流程中目的基因/基因组富集方法、载体选择原则和样品核酸提取等方法,并对瘤胃宏基因组学的应用现状进行了综述.     

牦牛瘤胃微生物抗生素抗性基因对3种外源性刺激因子的响应

通过给牦牛投喂硫酸头孢喹肟(CEF)、盐酸二氟沙星(DIF)和黄曲霉毒素B1(AFB1),并进行瘤胃微生物宏基因组测序,旨在揭示这3种外源性刺激因子对抗生素抗性基因(ARGs)种类、抗性类型、抗性机制等的影响,对于深入研究微生物抗性组特征和抗性机制具有重要价值。选取15头牦牛,随机分5组。Cef组和Dif组分别根据说明书推荐剂量按体重计算、灌服CEF 1 mg·kg^-1和DIF 1 mL·kg^-1;E1组和E2组分别按采食量投喂AFB120、60μg·kg^-1;C组为对照组。处理7 d后,采集瘤胃液,提取DNA,Illumina HiSeq测序,对reads counts进行标准化得到TPM值,并进行方差分析。结果显示,对照组共获得132种ARGs,分属30种抗性类型,其中,四环素类tetQ和tetW基因丰度较高;Cef组tetW基因丰度增加(P<0.05),Dif组tetQ丰度增加(P<0.05);Cef组四环素类和头孢菌素类抗性基因丰度增加(P<0.05),Dif组四环素类和氨基香豆素类抗性基因丰度增加(P<0.05),E1组氨基香豆素和青霉烯类抗性基因丰度增加(P<0.05),E2组青霉烯类、头孢菌素类等9类抗性基因丰度均增多(P<0.05);Dif组Erm基因23S核糖体RNA甲基转移酶丰度增加(P<0.05),E2组中ATP结合盒超家族等3种抗性机制相关基因的丰度增加(P<0.05);3种因子均显著增加四环素类ARGs宿主的种类。结论:瘤胃是蕴含丰富ARGs的储藏库,其中,四环素类抗生素抗性基因tetQ和tetW是主要的ARGs。不仅CEF和DIF使部分ARGs的种类、抗性类型以及耐药机制相关酶等的丰度升高,增加瘤胃微生物的耐药性,而且AFB1也具有类似作用,且高剂量AFB1对抗性类型的影响范围较抗生素大。这3种因子还导致携带四环素类ARGs宿主微生物的种类数量增加,从而强化横向转移机制,加快ARGs传播,增强微生物对四环素类的耐药性。     

宏基因组学及其在瘤胃微生物中的应用研究进展

宏基因组学是研究生态群体基因功能的一门崭新的学科。它通过免培方法获得微生物的纯培养,主要技术包括DNA的提取、文库的构建和目标基因克隆的筛选,可用于发现新基因、开发新的生物活性物质、研究群落中微生物多样性等方面。文章介绍了宏基因组学的基本方法,并对瘤胃微生物宏基因组学的应用现状进行了综述。     

野血牦牛和家养牦牛瘤胃发酵参数及微生物多样性的比较分析

为了比较野血牦牛和家养牦牛瘤胃发酵参数及微生物组成的差异,试验选取年龄、体重相近且健康的野血牦牛和家养牦牛各10头(公母各半),分别为野血牦牛组和家养牦牛组,两组屠宰后采集瘤胃液,测定瘤胃发酵参数(氨态氮、尿素氮、总氮、微生物蛋白和挥发性脂肪酸),并基于细菌16S rDNA基因序列比较分析两组瘤胃微生物组成的差异。结果表明：野血牦牛组瘤胃液中总氮含量、微生物蛋白质量浓度极显著高于家养牦牛组(P<0.01),氨态氮质量浓度、尿素氮浓度与家养牦牛组差异不显著(P>0.05);总挥发性脂肪酸浓度和正丁酸摩尔百分比极显著低于家养牦牛组(P<0.01),正戊酸摩尔百分比显著低于家养牦牛组(P<0.05),乙酸摩尔百分比极显著高于家养牦牛组(P<0.01),丙酸摩尔百分比显著高于家养牦牛组(P<0.05);异丁酸、异戊酸摩尔百分比及乙酸/丙酸与家养牦牛组差异不显著(P>0.05)。两组瘤胃共有1 963个核心操作性分类单元(operational taxonomic units, OTUs),野血牦牛组和家养牦牛组特有的OTUs分别为18 542个和16 ...     

海子水牛瘤胃微生物的宏基因组学分析

为系统探讨海子水牛瘤胃内的微生物组成及木质纤维素降解酶系,本试验利用基于高通量测序的宏基因组学技术对海子水牛(2.5岁左右,平均体重为493 kg)瘤胃液样本进行组学分析。结果表明,共获得了77 283 638条reads,并拼接出744 712个scaffold。经prodigal分析后,共预测出827 044个基因。通过基因注释发现海子水牛瘤胃中含有多种木质纤维素降解微生物,如生黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)、产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)及栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella ruminicola)。此外,还发现有38 011个基因编码蛋白质具有木质纤维素降解酶活性,其中糖苷水解酶(GH)基因数量最多(17 877个),糖基转移酶(GT)(8 637个)、碳水化合物结合模块(CBM)(4 693个)和碳水化合物酯酶(CE)基因(4 214个)数量次之,多糖裂合酶(PL)(1 296个)和辅助氧化还原酶(AA)基因(934个)数量较少。在GH基因中,归属于GH2、GH43、GH97、GH3家族的基因较多,且编码蛋白质具有寡糖降解酶活性的基因数量最多。此外还发现了少量的纤维小体组分蛋白基因。结合其他物种肠胃宏基因组中GH基因比对分析,发现海子水牛瘤胃中的纤维素酶、半纤维素酶和分支降解酶比例与奶牛瘤胃较为接近。由此可见,海子水牛瘤胃内含有丰富的木质纤维素降解微生物及酶系,这将为筛选具有工业应用潜力的酶基因奠定理论基础。     

冷季与暖季对牦牛放牧行为及瘤胃微生物多样性的影响

本试验在不同季节牧草生物量和营养品质变化较大的条件下,研究不同季节牦牛牧食行为及机体瘤胃微生物区系响应策略,旨在为提高牦牛的生产潜力及畜产品转化效率提供科学依据。试验分别在2019年1月和2019年9月进行,选取体重相近、健康无病的牦牛9头,采集瘤胃液,用于分析瘤胃内环境参数和瘤胃微生物多样性,并利用MOOnitor系统对其牧食行为的变化进行研究。结果表明,牦牛牧食活动及采食空间分布随牧草产量和营养品质的季节性变化而变化;相较于暖季,牦牛冷季休息加反刍时间（13.378 h/d）、采食时间（5.174 h/d）和反刍时间（8.160 h/d）显著减少（P<0.05）,行走时间（4.775 h/d）显著增加（P<0.05）,并且采食空间分布更为分散。瘤胃液中氨态氮、乙酸、丙酸、异丁酸、戊酸和总挥发性脂肪酸含量及乙酸与丙酸的比例在冷季显著降低（P<0.05）,而微生物蛋白、异戊酸含量在冷季显著增加（P<0.05）。冷季下瘤胃微生物在门水平表现出拟杆菌门（Bacteroidetes）显著升高（P<0.05）,厚壁菌门（Firmicutes）显著降低（P<0.05）;在属水平表现出冷季瘤胃微生物以分解纤维素的菌属为主。综合试验结果,冷季牧草生物量及常规营养成分的降低导致牦牛采食、反刍、休息行为减少,游走行为增多,同时采食空间分布格局扩大。牦牛瘤胃消化代谢及微生物变化方面对冷季的响应模式有别于暖季,这有利于提高其能量摄入及机体利用效率,进而有效应对冷季营养匮乏。     

瘤胃微生物宏组学分析及研究进展

瘤胃微生物在反刍动物饲粮消化和吸收中起着重要的作用,深入探索瘤胃微生物群落结构、代谢活动和功能作用,对反刍动物健康和促进饲草利用效率具有重要意义。相对传统瘤胃微生物纯培养方法,组学技术能够更加全面对瘤胃微生物种类、代谢途径、功能进行解释,宏组学联用为系统理解瘤胃微生物降解纤维物质分子机理提供新方式,并受到研究人员越来越多的关注。本文总结了宏基因组学、宏转录组学、宏蛋白质组学与代谢组学在瘤胃微生物研究中的应用,并围绕宏组学技术联合应用进行综述,为反刍动物瘤胃微生物的研究提供理论支持。     

饲粮粗蛋白质水平对育肥牦牛生产性能和瘤胃微生物多样性的影响

为研究饲粮粗蛋白质水平对育肥牦牛生产性能和瘤胃微生物多样性的影响,选取2.5岁左右、健康且体重相近[（190.88±5.97）kg]的公牦牛12头,随机平均分成2组,分别饲喂饲粮粗蛋白质水平为13.53%(D组)和16.20%(G组)的饲粮。预饲期15 d,正饲期120 d。结果表明：（1）与G组相比,D组牦牛的总增重和平均日增重分别增加了7.03%和6.94%(P <0.05);牦牛宰前活重、胴体重和屠宰率在两组之间差异不显著（P> 0.05）。（2）两组之间微生物的α多样性无显著差异（P> 0.05）。（3）在门水平上,相对丰度大于1%的菌门有拟杆菌门（Bacteroidota）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和螺旋体门（Spirochaetota）,在两组之间无显著差异（P> 0.05）。（4）在属水平上,微生物相对丰度>1%的优势菌属有16个,其中Prevotella、norank＿f＿＿F082和Rikenellaceae＿RC9＿gut＿group的相对丰度大于10%;Rikenellaceae＿RC...     

饲粮中添加酵母培养物对舍饲牦牛瘤胃发酵参数及微生物区系的影响

本试验旨在研究饲粮中添加酵母培养物(YC)对舍饲牦牛瘤胃发酵参数及微生物区系的影响。试验选取4岁、初始体重为(180.31±29.73)kg的健康麦洼公牦牛36头,随机分为4组,每组9个重复,每个重复1头牦牛,分别饲喂YC添加水平为0(Ⅰ组)、0.5%(Ⅱ组)、1.0%(Ⅲ组)和1.5%(Ⅳ组)的全混合日粮。预试期10 d,正试期80 d。结果表明:1)随着饲粮YC添加水平的升高,瘤胃微生物蛋白(MCP)含量显著升高(P<0.05),pH有呈线性降低的趋势(P=0.058),氨态氮(NH3-N)含量有呈二次曲线变化的趋势(P=0.055),乙酸比例及乙酸/丙酸呈显著线性降低(P<0.05),丙酸和丁酸比例呈显著线性增加(P<0.05),总挥发性脂肪酸(TVFA)含量无显著变化(P>0.05)。2)舍饲牦牛瘤胃微生物多样性指数除Chao指数外,其余各指数组间无显著差异(P>0.05)。3)门水平上,4组的优势菌门均为拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门。随着饲粮YC添加水平的升高,疣微菌门的相对丰度呈显著线性升高(P<0.05),Saccharibacteria的相对丰度呈显著线性降低(P<0.05),互养菌门的相对丰度呈显著二次曲线变化(P<0.05),变形菌门和纤维杆菌门的相对丰度有呈二次曲线变化的趋势(P=0.065,P=0.064)。属水平上,普雷沃菌属、拟杆菌目BS11和理研菌科RC9为优势菌属,随着饲粮YC添加水平的升高,克里斯滕森菌科R7的相对丰度呈显著线性降低(P<0.05),与pH和NH3-N含量呈显著正相关(r>0.500,P<0.05),奎因氏菌属的相对丰度呈显著线性降低(P<0.05),与TVFA含量呈显著正相关(r=0.460,P<0.05),瘤胃球菌科UCG-001和瘤胃球菌科UCG-014的相对丰度呈显著线性降低(P<0.05),与pH呈显著正相关(r>0.500,P<0.05),瘤胃球菌科UCG-011和瘤胃球菌属2的相对丰度呈显著二次曲线变化(P<0.05)。综上所述,在舍饲牦牛饲粮中添加YC显著影响了瘤胃中微生物的丰富度,影响门和属水平微生物的组成,进而对瘤胃发酵参数产生影响。     

滩羊羔羊瘤胃和小肠菌群多样性的比较研究

目的 研究滩羊羔羊瘤胃和小肠菌群多样性的差异。方法 选取健康的断奶滩羊公羔,屠宰后采集瘤胃、十二指肠、空肠和回肠内容物,利用16S rDNA高通量测序技术分析瘤胃和小肠菌群结构及多样性。结果 十二指肠样品Chao1指数高于瘤胃、空肠和回肠,瘤胃样品Shannon指数和Simpson指数均高于其他部位,但差异不显著（P>0.05）。瘤胃液中拟杆菌门（Bacteroidetes）、螺旋菌门（Spirochaetae）、丝状杆菌门（Fibrobacteres）的相对丰度显著（P<0.05）高于十二指肠、空肠和回肠,十二指肠中广古菌门（Euryarchaeota）的相对丰度与瘤胃相比有升高的趋势（0.05<P<0.10）,空肠和回肠中厚壁菌门（Firmicutes）的相对丰度显著（P<0.05）高于十二指肠。瘤胃中的未鉴定菌属（Unidentified）、理研菌属_RC9（Rikenellaceae_RC9_gut_group）、密螺旋体属_2（Treponema_2）、瘤胃球菌属_NK4A214（Ruminococcaceae_NK4A214_group）、普雷沃菌属_UCG-001（Prevotellaceae_UCG-001）相对丰度显著（P<0.05）高于十二指肠、空肠和回肠,空肠中Family_ⅩⅢ_AD3011_group相对丰度显著（P<0.05）高于其他部位。结论 滩羊羔羊瘤胃中细菌的多样性更丰富,瘤胃微生物与十二指肠、空肠和回肠的细菌区系显著不同。     

瘤胃能氮同步释放对瘤胃微生物蛋白质合成的影响

瘤胃微生物蛋白质（microbial protein,MCP）是反刍动物小肠可吸收蛋白质（Pro）的主要来源,而优化瘤胃发酵调控,促进瘤胃微生物蛋白质的合成一直是反刍动物营养研究的热点问题。近年来,关于瘤胃能氮同步释放优化瘤胃微生物蛋白质合成方面的研究引起了关注,因此,作者主要从瘤胃能氮同步释放的概念、瘤胃能氮同步释放的评价方法和瘤胃能氮同步释放对瘤胃微生物蛋白质合成影响方面的研究作一简要评述。     

应用高通量测序技术分析青海牦牛引进山东后瘤胃菌群的变化

试验旨在探讨不同的饲养环境及日粮结构对牦牛瘤胃菌群结构的影响,应用高通量测序技术分析了青海牦牛引进山东后的瘤胃菌群变化情况。结果表明,青海牦牛瘤胃液可见物种（Observed species）及Chao1指数（Chao1 index）与引进牦牛瘤胃液相比差异极显著（P<0.01）,ACE指数差异显著（P<0.05）;青海牦牛菌群丰度显著高于引进牦牛,说明青海牦牛引进山东后瘤胃菌群丰度发生了显著变化,而引进前后牦牛瘤胃液香浓指数（Shannon index）以及辛普森指数（Simpson index）差异不显著（P>0.05）,说明青海牦牛引进山东后瘤胃菌群多样性未显著改变。测序数据表明,牦牛瘤胃液中丰度较高的菌群依次是拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、疣微菌门、互养菌门、软壁菌门、纤维杆菌门;青海牦牛引进山东后菌群结构比例变化显著的门是浮霉菌门和装甲菌门（P<0.05）,变化显著的属是颤杆菌克属和帕匹杆菌属（P<0.05）。数据分析得出,拟杆菌和理研菌科在青海牦牛瘤胃液中起重要作用,而普雷沃氏菌科、琥珀酸弧菌科和产气单胞菌在引进山东牦牛瘤胃液中起主要的作用,推测饲养环境及日粮结构的改变导致了瘤胃菌群及其相关功能的改变。本研究为地域和日粮结构的变化对牦牛瘤胃菌群结构的影响提供了理论依据。     

黄曲霉毒素B_1与M_1对小鼠肠道细菌多样性的影响

试验旨在研究黄曲霉毒素B_1与M_1(AFB_1与AFM_1)对小鼠肠道细菌多样性的影响。选取体况良好的4周龄ICR(CD-1)雄性小鼠40只,随机分成4组,每组10个重复,每个重复1只小鼠,其中AFB_1组小鼠每只每天灌胃0.3mg/kg体重AFB_1,AFM_1组小鼠每只每天灌胃3.0mg/kg体重AFM_1,AFB_1+AFM_1组每只每天灌胃AFB_1与AFM_1的混合溶液,其中AFB_1终浓度0.3mg/kg体重,AFM_1终浓度3.0mg/kg体重,以上3组毒素溶剂均为1.0%二甲基亚砜水溶液。对照组小鼠每只每天灌胃1.0%二甲基亚砜水溶液。每只灌胃剂量均为200μL,每天09∶00灌胃一次,连续灌胃28d。灌胃结束后,处死并解剖小鼠,收集结肠内容物,采用16SrRNA测序的方法对肠内容物细菌多样性进行测序分析。结果显示:在细菌群落的门水平、科水平及属水平,与对照组相比,3个毒素处理组小鼠肠道内容物细菌优势菌群均未发生明显排序变化(P>0.05),但不同的毒素处理仍造成了不同分类水平下细菌菌群丰度的显著变化:与对照组相比,AFB_1组及联合灌胃组小鼠肠内致病菌或条件致病菌,如Facklamia、Staphylococcus、Corynebacterium属细菌丰度显著升高(P<0.05);而AFM_1组与对照组相比未见显著差异(P>0.05)。综合试验结果,AFB_1单独作用或与AFM_1联合作用可诱导小鼠肠道内致病菌或条件致病菌细菌增殖,改变肠道健康微生物区系,损伤肠道微生物屏障功能。     

不同年龄段牦牛瘤胃组织形态学与转录组研究

旨在比较不同年龄牦牛瘤胃组织形态、转录组表达谱的变化,挖掘影响牦牛瘤胃发育的关键基因和信号通路,为进一步探讨牦牛瘤胃发育机制提供理论基础。本研究选取非反刍阶段（1日龄与20日龄）、过渡阶段（60日龄）和反刍阶段（15月龄与3岁龄）的健康牦牛作为研究对象,共5个年龄组,每组3个样本。测量样本的体重与瘤胃重量;采集瘤胃组织样品,切片观察组织形态,并统计肌层厚度、乳头高度与宽度;提取瘤胃组织总RNA进行测序,并以1日龄为对照进行转录组分析。选取差异表达基因进行荧光定量试验,关联其与转录组数据的表达趋势。组织形态学分析结果显示,1日龄至3岁的牦牛瘤胃肌层与乳头形态有极大程度的发育与分化,15月龄和3岁牦牛瘤胃重量与指数显著增加（P<0.05）;从20日龄开始,瘤胃的肌层厚度随着日龄的增加显著增加（P<0.05）;20日龄后,瘤胃乳头高度和宽度随着日龄增加而显著增加（P<0.05）。转录组分析结果显示,20日龄组DEGs富集到胆固醇合成、丁酸代谢和PPAR信号通路等与VFA代谢相关的通路,富集到与免疫相关的免疫反应生物过程和Th17细胞分化通路,富集到与瘤胃上皮细胞异源物代谢相关的细胞色素P450外源性物质的代谢途径;60日龄组DEGs富集到脂肪酸代谢、丙酸代谢通路和丙酮酸代谢通路等与VFA代谢相关的通路,富集到与VFA吸收相关的矿物质吸收通路;15月龄与3岁组DEGs富集到维持瘤胃上皮的完整性和屏障功能的ECM受体相互作用途径。从富集通路中发现,HMGCS2、SLC26A3、PPARG、PPARD和CCL5等基因是与瘤胃营养吸收、代谢和免疫相关的候选基因。荧光定量结果显示,挑选的差异表达基因的表达与转录组测序结果一致。上述结果表明,牦牛瘤胃形态结构发育较早,20日龄是其发育的重要临界点;牦牛瘤胃肌层发育比瘤胃乳头更早,肌层厚度从20日龄时快速增加,瘤胃乳头从20日龄后快速发育;20日龄瘤胃开始VFA代谢,促进瘤胃快速健康的发育。