二倍体和四倍体泥鳅全基因组DNA甲基化的比较

以二倍体和四倍体泥鳅为研究对象,采用甲基化修饰依赖性内切酶测序技术(MethylRAD-Seq)在全基因组水平上分析泥鳅的DNA甲基化特点及倍性间的DNA甲基化变异。测序结果共得到302 111 684条Methyl-RAD序列标签。与参考基因组比对结果显示,泥鳅的甲基化位点主要分布在基因体区(gene body),其次为内含子区(intron)和基因间区(intergenic),而在其他功能元件上的分布较少。四倍体泥鳅的整体甲基化水平比二倍体高,尤其是在第一外显子区(1st Exon)和转录起始位点上游1 500bp至200bp区(TSS1500),且倍性间差异极显著(P0.01)。但在启动子区,四倍体泥鳅的甲基化水平略低于二倍体。在二倍体和四倍体泥鳅间共筛选到1 268个差异甲基化CmCGG位点和14个差异甲基化CmCWGG位点,这些位点主要分布于内含子、基因体和基因间区。比较各基因的甲基化水平,共得到684个倍性间差异甲基化基因。KEGG分析结果显示,倍性间差异甲基化基因主要富集到与生长发育、免疫及错配修复等相关通路上。     

二倍体和四倍体泥鳅qRT-PCR分析中内参基因优选

为筛选在泥鳅中稳定表达的内参基因,以确保泥鳅基因表达分析结果的可靠性,选取ACTB、TUBA、EF1A、GAPDH、TUBB和18SrRNA 6个常用的内参基因作为候选内参基因,分别用BestKeeper、geNorm、NormFinder、ΔCt和RefFinfer软件分析这6个基因在二倍体和四倍体泥鳅胚胎发育阶段、成鱼组织间以及倍性间表达的稳定性。结果显示,在胚胎发育各阶段,TUBB和TUBA的表达最稳定,可作为胚胎发育阶段qRT-PCR分析的内参基因;其中,TUBB在泥鳅倍性间的表达差异不显著,因此,可作为泥鳅胚胎发育中跨倍性qRT-PCR研究的内参基因。在成鱼各组织中,ACTB和18SrRNA的表达最稳定,可用作组织间qRTPCR分析的内参基因;其中,18SrRNA在倍性间的组织表达差异不显著,因此,可作为泥鳅组织间跨倍性qRTPCR的内参基因。     

泥鳅二倍体和四倍体及其正反交F_1的胚胎发育特征观察

为泥鳅多倍体育种及新品种的培育提供参考,在水温为(26±0.5)℃条件下,对泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)二倍体、四倍体及其正反交F1的胚胎发育过程及发育特征进行观察比较。结果表明:二倍体、四倍体、正交F1和反交F1受精卵分别经过26.18h、25.78h、26.52h和26.72h孵化出膜,其发育过程和发育时序基本相同,受精发育经过卵裂前期、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、器官形成期、孵化出膜期等阶段,各发育分期除发育时间不同外,其发育特征和发育分期没有明显差异。二倍体、四倍体初孵仔鱼体长分别为(2.56±0.121)mm和(3.145±0.277)mm,仔鱼形态差别不大;正交F1仔鱼和二倍体仔鱼的形态特征基本相同,反交F1和四倍体仔鱼基本相同。     

二倍体泥鳅×四倍体泥鳅F_1不同发育阶段染色体核型分析

以中国长江流域天然四倍体泥鳅为父本,大连农贸市场二倍体泥鳅为母本,通过倍间杂交获得杂交三倍体泥鳅,对早期胚胎、6月龄及12月龄染色体核型进行初步分析。结果表明,早期胚胎整3倍体染色体数目为3n=75,核型为16M+7SM+52T,NF=98,亚三倍体染色体数目为3n=73,核型为15M+6SM+52T,NF=94,超三倍体染色体数目为3n=76,核型为16M+6SM+54T,NF=98;6月龄整三倍体染色体数目为3n=75,核型为15M+6SM+54T,NF=96,亚三倍体染色体数目为3n=72,核型为15M+6SM+51T,NF=93,超三倍体染色体数目为3n=77,核型为15M+6SM+56T,NF=98;12月龄整三倍体染色体数目为3n=75,核型为12M+8SM+55T,NF=95;亚三倍体染色体数目为3n=71,核型为16M+6SM+49T,NF=93,超三倍体染色体数目为3n=76,核型为18M+8SM+50T,NF=102。结果表明,二倍体泥鳅×四倍体泥鳅杂交后代是含有三套染色体组的三倍体,不同发育阶段整三倍体染色体数目相同,均为3n=75,但染色体核型表现多态性。非整倍体(超三倍和亚三倍)中增加和缺少的染色体数目及类型无规律可循。     

NaCl胁迫下二倍体和同源四倍体西瓜幼苗DNA甲基化差异分析

【目的】研究二倍体和同源四倍体西瓜幼苗NaCl胁迫后形态学指标差异和DNA甲基化变化情况,分析不同倍性西瓜幼苗之间耐盐差异,结合形态学指标从表观遗传学角度解释二倍体和四倍体抗逆性差异机制。【方法】以3组不同倍性（二倍体、四倍体）西瓜幼苗为研究对象,待长至三叶一心时,用含有0、100、200、300和400 mmol·L^-1 NaCl的1/2 Hoagland营养液处理西瓜幼苗,NaCl处理8 d之后,鉴定西瓜幼苗受到的盐害指数,并运用甲基化敏感扩增多态性（methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP）技术,分析NaCl处理8 d之后二倍体和四倍体西瓜幼苗叶片基因组DNA甲基化水平和模式的变化。【结果】NaCl处理后,形态学指标比较发现,随着NaCl浓度的增加,三组西瓜幼苗的受伤害程度都随着增加,在不同的西瓜品种之间受伤害程度有差异,但是同一品种内同一NaCl浓度下,西瓜幼苗受伤害程度二倍体大于四倍体;从甲基化水平看,西瓜幼苗基因组DNA全甲基化率、半甲基化率、总甲基化率都随着NaCl浓度的增加而降低,同一NaCl浓度处理下甲基化率二倍体大于四倍体,二倍体和四倍体西瓜甲基化水平与其受伤害程度呈正相关;从甲基化模式来看,NaCl胁迫后DNA的去甲基化比率降低,超甲基化比率升高,并且其变化幅度是四倍体大于二倍体,不同倍性西瓜幼苗的甲基化模式与其受伤害程度呈负相关。【结论】NaCl胁迫后西瓜幼苗基因组DNA的甲基化状态发生了变化,并且这种变化与NaCl胁迫程度高度线性相关,西瓜幼苗通过降低甲基化率和降低去甲基化比率来应对NaCl胁迫,四倍体较二倍体有更低的甲基化比率和去甲基化比率,抗逆性四倍体强于二倍体。     

泥鳅二倍体与四倍体trim63a基因的克隆及表达分析

试验以泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus,Ma)为研究对象,采用PCR技术克隆获得trim63a基因(tripartite motif containing 63,又名肌肉环状指基因1)的cDNA部分序列,生物信息学分析结果显示,Matrim63a基因cDNA的编码序列(coding sequence,CDs)为1 035bp,编码344个氨基酸,与硬骨鱼类相似度较高。采用荧光定量PCR技术检测人工繁殖获得的二倍体(D×D)和四倍体(T×T)胚胎不同发育时期Matrim63a的表达量以及泥鳅二倍体(D)和四倍体(T)成鱼不同组织中Ma-trim63a的表达量,基因表达分析结果显示,Ma-trim63a在泥鳅二倍体和四倍体成鱼肌肉中的相对表达量最高,其次是心脏;Ma-trim63a在泥鳅二倍体和四倍体胚胎的13个发育时期均有表达,但是不同倍性的胚胎表达差异较大。     

同域分布二倍体和四倍体泥鳅群体的遗传结构

采用SRAP标记和线粒体DNA控制区测序方法对武汉和洞庭湖2个二倍体和四倍体泥鳅同域分布区4个泥鳅群体的遗传结构进行研究.SRAP分析结果表明,18对多态性引物组合在4个泥鳅群体中共检测到534个位点,每对引物组合检测的位点数为23～40个;各群体的Nei's基因多样性(h)和Shannon's信息指数(I)平均值分别...     

二倍体、四倍体泥鳅与大鳞副泥鳅杂交子代DNA相对含量与染色体组型的比较

利用二倍体(D)、四倍体(T)泥鳅与大鳞副泥鳅(P)间的自交与杂交,获得9种细胞型子代,分别为（♀×♂）:D×D、D×T、D×P、T×D、T×T、T×P、P×D、P×T和P×P.采用流式细胞计数法和染色体制片技术分别对其进行了DNA相对含量测定和染色体组型分析.DNA相对含量结果显示:D×D、D×P、P×D和P×P属于...     

泥鳅cyp19a1基因克隆及其在倍性间的表达差异

克隆并分析泥鳅cyp19a1a的全长cDNA和5′侧翼序列,用qRT-PCR技术比较cyp19a1a在二倍体、四倍体泥鳅组织间和倍性间的表达差异。结果发现,泥鳅cyp19a1a的cDNA全长1 905 bp,包括29 bp的5′TR、301 bp的3′UTR和1 575 bp的ORF序列,其氨基酸序列中存在I-螺旋区、芳香化酶特异保守区以及血红素结合区等重要功能域。用hiTAIL-PCR克隆获得2 040 bp的5′侧翼序列,在该序列上预测到典型元件TATA-box,以及C/EBPβ、SRY、ER、CREB、GR等转录因子结合位点。12月龄四倍体泥鳅的体长、体质量均显著高于二倍体,但性腺发育明显滞后于二倍体。cyp19a1a和cyp19a1b分别在二倍体、四倍体泥鳅的性腺和脑中的表达量最高。倍性间比较结果显示,cyp19a1a在四倍体各组织中的表达均高于二倍体(除精巢外);cyp19a1b在四倍体雌鳅脑中的表达量显著高于二倍体,但在四倍体雄鳅脑中的表达量显著低于二倍体。综合分析上述结果,四倍体中相对较高的cyp19a1a表达可能与其性腺所处发育时期有关,较晚的性成熟有利于泥鳅将更多能量...     

萝卜-芥蓝异源四倍体F4和F10世代DNA甲基化变异的MSAP分析

以人工合成的萝卜-芥蓝异源四倍体的F4和F10世代为材料,用MSAP法检测2种材料DNA甲基化变异情况,以期为远缘杂交后不同世代间基因组DNA甲基化遗传和变异规律提供实验依据。结果表明:F4代和F10代甲基化程度分别为30.61%和33.10%,共检测12种甲基化变异模式,可以分为5种类型,甲基化变异位点占所有甲基化位点的41.71%。用甲基化抑制剂5-氮胞苷处理F4代,F10代材料,检测到甲基化程度分别为20.67%和25.75%,F代比F代受到了更大冲击,说明不稳定世代对环境的影响更加敏感。     

雌激素受体基因对泥鳅雌雄和倍性生长差异的表达调控作用

为探讨雌激素受体基因与鱼类雌雄及倍性生长差异之间的相关性,选取雌性生长快于雄性、且四倍体生长快于二倍体的泥鳅为研究对象,首先克隆泥鳅雌激素受体基因,获得ERα（1 821 bp）、ERβ1（1 008 bp）和ERβ2（1 197 bp）的cDNA序列,氨基酸序列比对发现泥鳅ERs分别与鲤科鱼类相应亚型具有较高的同源性。采用qRT-PCR检测ER基因在二倍体泥鳅性成熟前后5个关键时期的表达情况及二倍体、四倍体相关组织间的差异表达。结果显示,3个基因在雌雄个体性成熟前后脑、肌肉、肝脏和性腺组织中均存在差异表达,其中ERα 在泥鳅雄性个体脑、肌肉和性腺组织中的表达量显著高于雌性（P<0.05）,而在雌性肝脏组织中的表达量普遍高于雄性（P<0.05）;ERβ1和ERβ2在精巢组织中的表达量一直处于较高水平。泥鳅倍性间的比较结果显示,3个ER基因在泥鳅二倍体脑组织中的表达量显著高于四倍体的表达量,且雄性的表达量均高于雌性,其中〖JP2〗ERα表达差异最为显著。本研究结果表明,无论是针对倍性生长差异还是雌雄生长差异,ERα均表现为在生长较慢（二倍体、雄性）个体脑组织中有相对高表达,推测脑组织中ERα 基因对鱼类个体生长速度具有一定抑制作用。     

高粱的玉米黄质环氧化酶基因SbZEP表达与DNA变异分析

类胡萝卜素是维生素A的前体，是决定高粱籽粒营养品质的关键因素。为改良高粱籽粒营养品质，研究利用生物信息学和分子生物学试验方法对参试高粱类胡萝卜素中叶黄素循环的玉米黄质环氧化酶基因进行表达与DNA变异分析。结果表明，SbZEP为亲水性蛋白，亚细胞定位于内质网和叶绿体上；二级结构则以α-螺旋和无规则卷曲为主，SbZEP蛋白三级结构与预测一致，可信度高达90%；系统进化树分析表明，ZEP蛋白划分为6组，高粱与谷子的ZEP基因同源关系更近，同时在演化上有双子叶与单子叶的演化分隔。顺式作用元件分析表明，SbZEP含有光响应以及防御和应激响应元件，可能参与光反应和防御反应过程。高粱叶片发育过程中SbZEP基因的表达量明显增加；SbZEP在高粱种子、胚珠和茎表达水平较高；DNA重测序数据分析表明，SbZEP存在非同义突变，在不同品系对应不同位点的突变，可能与类胡萝卜素的合成与降解相关。     

LEF1基因在巴什拜羊不同毛色皮肤组织中的DNA甲基化及mRNA表达水平分析

【目的】分析LEF1基因在红棕色与青灰色巴什拜羊皮肤组织中DNA甲基化与mRNA的表达水平。【方法】运用BSP(亚硫酸盐修饰后测序PCR)与RT-RCR(实时荧光定量PCR),检测不同毛色巴什拜羊皮肤组织LEF1基因启动子区的甲基化水平与mRNA表达量。【结果】在红棕色巴什拜羊皮肤组织中的LEF1基因启动子区的甲基化水平高于青灰色的甲基化水平,且二者甲基化CpG位点不同,二者呈显著的负相关(P< 0.05)。【结论】DNA甲基化水平对红棕色与青灰色巴什拜羊的毛色形成具有调节作用,可作为一个候选的巴什拜羊毛色遗传标记。     

外源GA_3影响牡丹花芽DNA甲基化水平和相关酶基因的表达分析

【目的】外施赤霉素(GA)是生产上辅助解除牡丹花芽休眠进行反季节盆花生产的常用手段,赤霉素如何发挥作用解除牡丹花芽休眠是未解的科学问题,本文旨在明确赤霉素是否通过表观遗传方式参与内休眠调控。【方法】从DNA甲基化入手,以4年生‘鲁菏红’为材料,500 mg·L~(-1)的GA_3处理花芽,并在处理后0.5、1、3和5 d后取健壮顶芽,CTAB法提取花芽DNA,HPLC技术测定GA_3处理后牡丹花芽DNA甲基化水平的变化;利用转录组分析结合RACE技术得到牡丹3种DNA甲基转移酶基因PsCMT、PsMET、PsDRM和DNA去甲基化酶基因PsROS1的序列,生物信息学方法比对基因序列并分析可能的结构域,MEGA 5.0构建系统发育树;以Actin为内参,利用q PCR方法分析其组织表达特性和对GA_3的响应。【结果】3种DNA甲基转移酶基因(Dnmts)的开放阅读框长短不一,PsCMT、PsMET、PsDRM开放阅读框长度分别为1 118、1 056、2 175 bp,编码的氨基酸数目分别为372、351、724。3种DNA甲基转移酶均有甲基转移酶结构域。而DNA去甲基化酶基因PsROS1的序列较长,开放阅读框为6 636 bp,编码2 211个氨基酸。PsROS1上存在保守的DNA糖基化结构域。系统发育分析表明,牡丹中的PsCMT和PsDRM蛋白与葡萄的Vv CMT2蛋白亲缘关系最近,PsMET和PsROS1与大部分木本植物聚为一支,与烟草等距离较远。PsCMT、PsMET、PsDRM在牡丹初花期的各个组织(根、茎、叶、苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮)中均有表达,其中在牡丹根中表达量较高,而PsROS1在心皮中表达量最高。GA_3处理5 d,牡丹花芽迅速萌动,60 d时萌动率为97.5%,成花率为92.5%;对照20 d时才有少量花芽萌动,至60 d时萌动率仅为23.1%。GA_3显著降低了牡丹花芽DNA甲基化水平(P0.01),从处理前的38.9%降至处理5 d时的28.7%;GA_3处理提高了PsCMT和PsROS1的表达水平,降低了PsDRM的表达水平,而PsMET的表达水平差异不显著。【结论】GA_3处理通过诱导PsROS1表达、抑制PsDRM表达导致了DNA低甲基化,进而促进了牡丹休眠解除,可能是赤霉素发挥作用的一种重要方式。     

盐胁迫下盐穗木DNA甲基化程度与去甲基化酶基因(Ros1)表达的相关性研究

【目的】甲基化和去甲基化协同调控的DNA甲基化直接影响逆境胁迫相关基因的表达,植物的DNA去甲基化主要由去甲基化酶基因Ros1(Repressor of Silencing 1)介导的碱基切除修复实现。开展盐穗木(Halostachys caspica)DNA甲基化程度与HcRos1表达动态变化的分析,有助于阐明DNA甲基化应答盐胁迫的分子机制。【方法】利用qRT-PCR测定盐胁迫下盐穗木幼苗同化枝和根基因组DNA的甲基化程度,探讨DNA的甲基化程度与去甲基化酶基因HcRos1表达的相关性。【结果】在相同NaCl浓度胁迫不同时间下盐穗木同化枝和根中DNA甲基化程度呈现先升高后降低的趋势,盐穗木同化枝中的DNA甲基化程度大多高于根中的基因组甲基化程度,且均在24 h达到最高DNA甲基化程度。而在不同浓度NaCl胁迫处理24 h时,盐穗木同化枝和根中DNA甲基化程度也是先升高后降低的趋势,盐穗木同化枝中的基因组甲基化程度高于根中的基因组甲基化程度,且多在100 mmol/L达到最高DNA甲基化程度。HcRos1的基因表达量在低浓度NaCl胁迫下变化不大,但在700 mmol/L NaCl胁迫72 h时则显著升高。【结论】HcRos1表达量与DNA甲基化水平呈明显的负相关,盐胁迫能够提高HcRos1的表达,降低基因组DNA的甲基化程度,增强植物的耐盐性。     

水稻OsDDM1a和OsDDM1b基因应答非生物胁迫的表达特性分析

环境胁迫会引起植物基因组DNA甲基化水平改变和组蛋白修饰变化,而DNA甲基化与组蛋白修饰在基因表达的调控过程中具有重要作用。分析表明水稻OsDDM1a和OsDDM1b基因属于SWI2/SNF2家族,编码染色质重塑酶,氨基酸序列的相似性达92.82%。OsDDM1a和OsDDM1b的表达均受ABA、NaCl、低温和干旱胁迫诱导,且这两个基因的启动子序列中均含有ABRE、DRE、MYC和WRKY等应答不同胁迫信号的元件。因此,推测水稻在感受外界刺激后可能通过激活OsDDM1a和OsDDM1b的表达,使水稻基因组DNA发生相应的甲基化修饰,进而调控相关基因的表达,表明OsDDM1a和OsDDM1b在水稻胁迫应答反应中发挥重要的作用。     

鲤科鱼类RNase1基因的进化与组织表达模式

为探究RNase 1在鱼类食性适应性进化中的作用,对不同食性的9种鲤科鱼类,包括草食性的草鱼(Ctenopharyngodon idella)和团头鲂(Megalobrama amblycephala)、杂食性的鲢(Hypophthalmichthys molitrix)、鳙(Hypophthalmichthys nobilis)、鲤(Cyprinus carpio)、黄尾鲴(Xenocypris davidi)和斑马鱼(Danio rerio)以及肉食性的翘嘴鲌(Culter alburnus)和鳡(Elopichthys bambusa)的RNase 1基因进行鉴定、序列特征分析、进化规律及组织表达模式分析。研究结果显示,与哺乳动物不同,9种鲤科鱼类基因组中只存在1个RNase 1基因,序列同源性高,且具有RNase A超家族的序列特征,包括N端信号肽序列,6个间隔的半胱氨酸残基,3个催化碱基形成的催化三联体和"CKXXNTF"序列;系统发育树显示,硬骨鱼和哺乳动物的RNase 1聚为不同分支,鲤科鱼类单独聚为一支;qRT-PCR结果显示,植食性的团头鲂和草鱼、杂食性的鳙和肉食性的翘嘴鲌的RNase 1基因在不同组织中的表达模式各不相同,4种鱼类在肝脏中相对表达量高,在团头鲂和翘嘴鲌的脾脏中表达量也高。以上结果表明,鲤科鱼类的RNase 1的进化与物种食性的关联性不大,但符合物种进化的规律。     

绵羊BMPR1A基因组织表达及其多态性与产羔数的关联分析

为探索BMPR1A基因在不同生理时期(卵泡期和黄体期)和不同繁殖力(单羔组和多羔组)小尾寒羊组织表达特征及其多样性与小尾寒羊产羔数的关系,采用qPCR技术检测BMPR1A基因在小尾寒羊14种组织中的表达特征。同时,采用Sequenom MassARRAY~?SNP技术对BMPR1A基因3个SNPs位点在大群中的多态性进行检测,并与小尾寒羊产羔数进行关联。qPCR结果显示,BMPR1A在14种组织中均有表达,其中在大脑、下丘脑和甲状腺组织高表达;BMPR1A在卵泡期和黄体期多羔组下丘脑和卵巢组织表达量均高于单羔组,但未达到显著水平。分型发现BMPR1A基因g.41128335AT和g.41127600CT位点在单、多羔绵羊品种间的基因频率和基因型频率达到显著水平。卡方适合性检验结果显示,3个SNPs在大多数绵羊品种中均处于Hardy-Weinberg平衡状态。关联分析结果发现,3个SNPs多态性与小尾寒羊各胎产羔数均无显著相关,但g.41128335AT和g.41127598AG位点突变型产羔数基本上均高于野生型。以上结果初步表明,BMPR1A基因表达与小尾寒羊产羔数增加存在一定程度的正相关,但3个SNPs与小尾寒羊各胎产羔数均无显著关联,说明它们可能均不是影响BMPR1A基因功能的关键位点。