菌株尼古丁降解代谢中agnH基因的克隆表达与纯化

对从湖北省襄阳市烟草种植土壤中分离筛选得到的尼古丁降解菌根癌土壤杆菌SCUEC1菌株中agnH基因进行克隆表达,并对AgnH蛋白的表达和纯化条件进行优化,为解析agnH基因的功能和揭示根癌土壤杆菌SCUEC1菌株尼古丁降解的分子机制提供理论依据。通过PCR扩增获得agnH全长基因(585 bp),构建重组质粒pET28a(+)agnH,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行异源表达,研究不同IPTG浓度、诱导温度和诱导时间对重组质粒pET28a(+)agnH诱导表达的影响,用不同浓度的咪唑洗脱液洗脱重组蛋白,采用SDS-PAGE检测重组蛋白。结果表明：在IPTG浓度为0.4 mmol/L、诱导温度为25℃且诱导时间为25 h条件下,AgnH蛋白表达量较高;在250 mmol/L的咪唑洗脱液洗脱下,得到浓度较高的AgnH蛋白。     

两种根癌土壤杆菌介导的荧光素酶在植物体内表达分析

根据报道的荧光素酶(Luciferase,Luc)基因设计引物,PCR扩增获得Luc基因,经BamH I和Pst I酶切连接到栽体pCHF3上,成功构建植物表达栽体pCHF3-Luc.将pCHF3-Luc分别转入根癌土壤杆菌株EHAl05和LBA4404细胞内,利用根癌土壤杆菌渗入法导入本氏烟和大麦,荧光检测仪内检测本氏烟和大麦叶片中瞬时表达的Luc活性.结果表明:两种根癌土壤杆菌介导的Luc可以在本氏烟中成功表达,而在大麦中不能表达;利用根癌土壤杆菌渗入法在本氏烟中表达外源基因时,EHA105菌株优于LBA4404菌株.     

枯草芽孢杆菌XF1菌株中XFsacA基因的克隆及功能验证

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis XF1是从土壤中分离的一株利用蔗糖快、能高效防治根肿病的专利菌株.为探明其高效的蔗糖代谢机制,用PCR从该菌中扩增到蔗糖代谢关键基因蔗糖-6-磷酸水解酶基因(XFsacA基因),其编码的蛋白质氨基酸序列与枯草芽孢杆菌B168菌株中的XFsacA基因有97%的相似性,且发生了12个氨基酸突变.将该基因中约1.4 kb的编码框序列连接到表达载体pQE30上,构建了重组表达质粒pQE30-XFsacA,该质粒转入到不能利用蔗糖的Escherichia coli BL21中,后者能在以蔗糖为唯一碳源的M9无机离子培养基中正常生长,并表达出了一条约54 000蛋白条带.结果预示XFsacA基因氨基酸序列的替代可能是XF1高效利用蔗糖的基础,同时XFsacA基因的克隆与其在E.coli中的表达研究,为利用蔗糖发酵的工程E.coli构建奠定了基础.     

产酶溶杆菌OH11菌株几丁质酶基因的克隆与表达

利用PCR方法从产酶溶杆菌OH11菌株中克隆到编码几丁质酶的chiA基因.同源性比较发现,其推测产物与产酶溶杆菌C3菌株和N4-7菌株的ChiA有97%以上的序列一致性.基因经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到含T7启动子的高表达载体pET21a( )上构建重组质粒pChiA,并转化宿主菌BL21(AI)产生BLChiA表达菌株.经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后发现,BLChiA菌株产生相对分子质量约为75×103的蛋白质.生物活性试验表明,该蛋白能水解几丁质,在几丁质培养基上产生一透明的水解圈,并对立枯丝核菌菌丝的生长有抑制作用.因此该蛋白具有一定的生物防治作用.     

根瘤菌,根癌土壤杆菌与寄主植物相互识别的机制

介绍了豆科植物－根瘤菌和双子叶植物－根癌土壤杆菌两个互作体系中关于病菌吸附专化性的理论，评述了奇主－细菌相互识别的机制。     

水稻OsRFP1基因的原核表达与蛋白纯化

以推导的氨基酸序列分析,水稻OsRFP1基因编码一分子量为34.24kDa锌指蛋白。将OsRFP1基因编码区cDNA序列插入到pGEX4T-3载体中构建OsRFP1-gst融合基因的表达载体,并将质粒转化宿主菌大肠杆菌BL21DE3。经IPTG诱导,融合蛋白在BL21DE3细胞中获得表达。利用亲和层析的方法对融合蛋白进行了纯化,SDS-PAGE蛋白电泳显示获得一60kDa的唯一蛋白条带,即OsRFP1-GST融合蛋白。     

27种中草药对根癌土壤杆菌的抑菌效果

采用纸片法检测了27种中草药对根癌土壤杆菌的抑菌效果。结果表明,黄连的抑菌效果明显,其抑菌圈直径为22mm,最低抑菌浓度（MIC）为15．62mg／ml;大黄和穿心莲也有抑菌作用,其抑菌圈直径分别为19．5和18．9mm,MIC均为31．25mg／ml。在此基础上,对抑菌效果好的黄连和大黄采用高效液相色谱法进行有效成分的鉴定和分析。     

27种中草药对根癌土壤杆菌的抑菌效果

采用纸片法检测了27种中草药对根癌土壤杆菌的抑菌效果。结果表明,黄连的抑菌效果明显,其抑菌圈直径为22 mm,最低抑菌浓度(MIC)为15.62 mg/ml;大黄和穿心莲也有抑菌作用,其抑菌圈直径分别为19.5和18.9 mm,MIC均为31.25 mg/ml。在此基础上,对抑菌效果好的黄连和大黄采用高效液相色谱法进行有效成分的鉴定和分析。     

PBP1基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化

将获得的拟南芥黑芥子酶结合蛋白PBP1基因表达载体pTYB2-PBP1导入大肠杆菌ER2566细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳显示,PBP1-CBD融合蛋白获得了较好的表达。进一步对PBP1蛋白进行分离纯化,SDS-PAGE电泳结果显示分离纯化效果较好,所获得的纯化的PBP1蛋白可进一步用于研究PBP1与MBP6的酵母双杂交技术。     

根癌农杆菌介导油菜CBF1基因转化拟南芥

[目的]为油菜CBF1基因应用于作物抗逆遗传改良提供理论依据。[方法]采用根癌农杆菌介导法将油菜CBF1基因转入拟南芥,筛选抗性转基因拟南芥植株,进行PCR检测和GUS染色。[结果]与不抗潮霉素的野生型拟南芥幼苗相比,对潮霉素具有抗性的转基因拟南芥幼苗的叶片比较大,根特别长。PCR检测表明38株抗性拟南芥植株中有29株能扩增出与目的基因大小一致的条带,阳性率为76.3%,而野生型拟南芥植株没有扩增出相应条带。阳性PCR扩增产物的测序结果表明油菜CBF1基因已经转入到拟南芥。GUS染色表明有22株转基因拟南芥植株呈现阳性。[结论]油菜CBF1基因可以整合到拟南芥基因组并能稳定表达。     

转Bt基因抗虫玉米根茬和根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的田间降解动态

【目的】研究转cry1Ab杀虫蛋白基因玉米收获后玉米根茬及其根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的降解动态,比较两种Bt玉米根茬和根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度。【方法】以两种表达Cry1Ab杀虫蛋白的Bt抗虫玉米MON810和Bt11为材料,采用ELISA方法测定玉米收获后根茬残体和根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的田间降解动态。【结果】转Bt基因玉米根茬残体和根际土壤中杀虫蛋白是逐渐降解的,Bt玉米MON810根茬中Cry1Ab杀虫蛋白含量较高,降解的速度也较慢,收获后8个月时还不能完全降解;Bt玉米Bt11根茬中Cry1Ab杀虫蛋白含量较低,降解速度比MON810根茬中Cry1Ab杀虫蛋白降解速度快,到7个月时已检测不到Cry1Ab杀虫蛋白。Bt玉米MON810根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的降解较Bt11的慢,MON810和Bt11根际土壤分别在8个月和7个月时检测不到Cry1Ab杀虫蛋白。【结论】种植过Bt11和MON810抗虫玉米的田块,在第二年春播农作物已经出土时,其根茬和根际土壤中残留的Cry1Ab杀虫蛋白尚不能完全降解,还有少量残留。     

肝素黄杆菌2-O-sulfatase基因的克隆与表达

[目的]研究肝素黄杆菌2-O-sulfatase基因的克隆与表达。[方法]以肝素黄肝菌为模板,通过PCR从肝素黄杆菌基因组DNA中扩增2-O-sulfatase的基因,测序正确后插入到表达质粒PET-28a（＋）上构建表达载体,重组质粒转化E.coil BL21（DE3）进行蛋白质表达。[结果]成功地将PCR扩增得到的测序正确的2-O-sulfatase基因构建入PET-28a（＋）载体上,重组质粒转入E.coil BL21（DE3）后,表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定得到目的蛋白。[结论]克隆并成功表达了黄杆菌2-O-sulfatase基因,为分析肝素多糖分子及其降解产物结构奠定了基础。     

Cry1Ia蛋白的表达与纯化

苏云金芽孢杆菌表达的Cry1Ia蛋白对鳞翅目和鞘翅目昆虫具有较好的杀虫活性。为便于后期评价不同的Cry1Ia蛋白,建立了Cry1Ia蛋白的表达与纯化体系。将一个cry1Ia基因的编码基因接入pET28aDel表达载体,并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)star菌株。在大肠杆菌中诱导Cry1Ia蛋白的表达,并与Bt中的表达产物进行比较。最后,利用Cry1Ia蛋白C端包含的组氨酸标签,对大肠杆菌表达的Cry1Ia蛋白进行纯化。结果显示,大肠杆菌中Cry1Ia蛋白随着表达时间的延长,产物积累显著,并且其表达量高于Bt菌株,因此,其更适宜生产完整的Cry1Ia蛋白。对大肠杆菌表达的Cry1Ia进行纯化,获得了理想的结果。研究构建了Cry1Ia蛋白的大肠杆菌表达体系,并成功对其进行纯化,可为进一步研究此类蛋白的杀虫活性和机制奠定基础。     

根癌农杆菌介导的玉米萌动胚NPR1基因遗传转化

以玉米萌动胚为外植体,研究了影响根癌农杆菌介导的玉米NPR1基因遗传转化的若干因素。结果表明,在感染液和共培养基中分别都加入100μmol/L乙酰丁香酮,根癌农杆菌LBA4404的菌液,浸染时间12 h,40 mg/L潮霉素进行转化苗筛选,为转化的适宜条件。对转化苗进行PCR检测,证明外源目的基因已整合到玉米基因组中。     

一种新的草甘膦氧化还原酶基因的克隆及活性蛋白表达研究

本研究构建了一个草甘膦污染土壤的宏基因组文库,利用草甘膦抗性筛选方法从该文库中筛选得到一个草甘膦抗性克隆,测序结果表明,其上存在一个草甘膦氧化还原酶(glyphosate oxidoreductase,简称GOX)的编码基因,命名为goxA。该基因长为1 296 bp,编码一个由431 aa组成的蛋白质。goxA碱基序列与已报道的gox相差6个碱基,编码产物GOXA与GOX蛋白质氨基酸序列相差2个氨基酸。为了验证GOXA的功能,对其进行了原核表达与纯化,活性电泳结果表明,GOXA具有明显的草甘膦氧化还原酶活性,goxA的发现为草甘膦抗性植物的研发提供具有潜在应用价值的基因资源。     

根癌农杆菌介导LFY基因转化苹果的研究

将苹果杂交种（长富2号×新红星）种子打破休眠,经消毒处理后接种在MS培养基上获得无菌组培苗。以组培苗叶片为试材,通过不同激素组合试验,获得了适宜植株再生的培养基MS＋NAA 0.4 mg/L＋TDZ 2.0 mg/L。利用含LFY基因的根癌农杆菌EHA105转化苹果叶片,得到转LFY基因的阳性植株,经PCR和RT-PCR检测,有2株出现特异性条带,证明该基因已经整合到苹果基因组中。     

产酶溶杆菌OH11菌株β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆与表达

利用PCR方法从OH11菌株中克隆到β-1,3-葡聚糖酶基因,通过同源性比较发现其推测产物与产酶溶杆菌C3菌株和N4-7菌株的β-1,3-葡聚糖酶有90%以上的同源性。该基因经NdeⅠ、XhoⅡ或HindⅢ酶切后连接到含T7启动子的高表达载体pET21a( )和载体pET30a( )上构建重组质粒,并分别转化宿主菌BL21(AI)和BL21(DE3)产生表达菌株。表达菌株BLGluA和BLGluC经IPTG诱导后分别产生相对分子量约为29 000(GluA蛋白)和44 000(GluC蛋白)的蛋白。酶活性和抑菌活性测定结果表明,GluA蛋白和GluC蛋白能将海带多糖水解,在海带多糖培养基上产生透明的水解圈,并对立枯丝核菌菌丝的生长有抑制作用,具有一定的生物防治作用。     

根癌农杆菌介导的甜瓜基因转化及其转基因植株的再生

含双元载体pBEWMV的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)　LBA4404感染甜瓜（Cucumis melo）子叶外植体,获得了可育的转基因甜瓜植株。该质粒载体内含选择标记基因npt-Ⅱ（新霉素磷酸基转移酶Ⅱ基因）和WMV-Ⅰ CP基因（西瓜花叶病毒1号外壳蛋白基因）。NPT-Ⅱ酶活性检测、DNA分子点杂交、PCR检测及Southern杂交试验表明,外源的WMV-1 CP基因确已通过农杆菌介导的转化途径导入甜瓜细胞。     

小豆抗病相关基因VaAC1的克隆与表达分析

利用简并引物从小豆中扩增出1条与植物几丁质酶基因高度同源的片段,命名为VaAC1,通过RACE技术延伸VaAC1基因的3’端和5’端,VaAC1基因完整ORF长度为885 bp,编码294个氨基酸,拥有几丁质酶蛋白家族典型保守结构域GH18_chitinase-like。RT-PCR分析表明,VaAC1基因在小豆根、茎和叶中均有表达,且在叶中的表达相对较高;大豆花叶病毒处理后,VaAC1基因在叶中的表达量显著增强,显示小豆VaAC1基因与病毒病密切相关。     

根癌农杆菌介导FPF1基因转化菊花的研究

经过转化材料的筛选、KM筛选浓度、Cef抗菌浓度以及延迟筛选时间的测定,以根癌农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)LBA4404菌株介导FPF1基因转化菊花,对转化材料进行连续KM筛选,获得105株抗性苗,部分植株经PCR检测呈阳性.田间观察部分抗性株与对照相比在株型、叶色及花期上表现出差异.