华癸中慢生根瘤菌7653R SraG sRNA的共生固氮功能

基于前期对华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)7653RsRNA(small non-coding RNA,sRNA)的生物信息学预测,经Northern blot验证获得SraGsRNA。本研究采用RACE与转录组高通量深度测序确定了SraG全长,并分别利用RNAfold软件和TargetRNA软件预测了SraG二级结构和靶位点,进而构建了M.huakuii 7653R的SraG插入失活突变体(M.huakuii SraGmut),并对突变体接种紫云英的共生表型进行了检测。盆栽试验结果表明,与野生型菌株M.huakuii 7653R相比,接种突变株M.huakuii SraGmut的固氮能力显著下降,突变株固氮酶活性下降约40%,植株鲜质量和根瘤数目也显著降低。结果表明,SraG的功能与M.huakuii 7653R的共生固氮过程相关,作为sRNA可能参与根瘤菌的共生固氮调控过程。     

华癸中慢生根瘤菌7653R MCHK_8182基因的共生固氮功能

根据华癸中慢生根瘤菌7653R全局转录组分析结果,获得在共生固氮阶段显著上调表达的基因MCHK_8182;设计重叠延伸PCR引物,构建MCHK_8182双交换突变重组质粒载体;通过三亲本杂交,将突变载体导入7653R;在蔗糖压力培养下进行筛选,最终获得MCHK_8182双交换突变株。PCR及测序验证双交换突变株构建成功。植物盆栽试验结果显示,与7653R野生型接种的植株相比,MCHK_8182突变菌株接种的植株根瘤数减少,但固氮酶活未见明显差异。     

利用细菌双杂交文库筛选华癸中慢生根瘤菌7653R中与外膜蛋白Opa22互作的蛋白

为研究华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)7653R外膜蛋白Opa22在共生固氮过程中的作用机制,构建了细菌双杂交基因组随机文库,并以Opa22为诱饵,钓取与其相互作用的候选靶蛋白。结果获得12个与Opa22蛋白互作的阳性克隆,为后续研究Opa22的作用机制提供了新的线索和思路,同时也为开展根瘤菌蛋白互作的研究构筑了良好的技术平台。     

MCHK_7135基因在华癸中慢生根瘤菌共生固氮中的功能

为研究MCHK＿7135基因在根瘤菌与宿主植物共生固氮中的功能,用同源重组的方法构建了MCHK＿7135基因的突变体及回补菌株,对突变菌株和回补菌株在人工培养条件以及与宿主植物紫云英共生下的各项表型进行了考察,结果显示：与野生型菌株相比,突变菌株对氧胁迫的敏感性增强;接种突变株的紫云英长势矮小,侵染线及根瘤原基数目减少,根瘤数量少,固氮酶活性低,而向突变菌株导入完整MCHK＿7135基因后,各项共生表型得到不同程度恢复。研究结果表明,华癸中慢生根瘤菌的过氧化物还原酶基因MCHK＿7135基因在根瘤菌与宿主植物共生固氮的过程中具有重要功能。     

用Tn5标记带发光酶基因的华癸根瘤菌（Mesorhizobium huak …

在ｐＲＫ２０７３的辅助作用下,通过三亲本接合转移,将Ｔｎ５（ｓａｃＢ－ｌｕｘＡＢ）插入华癸根瘤菌７６５３Ｒ菌株基因组中。将３２００个Ｔｎ５标记菌株影印到含有８％蔗糖的ＹＭＡ平板,检测这些菌株的发光酶知性和新霉素抗性。共获得８个菌株,其选择标记消失。质粒检测发现其共生质粒有不同程度的缺失甚至消除。结瘤实验证明,所有共生质粒部分缺失（有的缺失达１／３）的菌株依然结瘤。经用ｌｕｘＡＢ探针的分子杂交证实,     

华癸中生根瘤菌共生基因exo56的克隆和功能初步分析

利用Tn5-sacB转座子随机插入突变的方法,从Mesorhizobium huakuii 7653R的400个突变株中筛选获得1个共生缺失突变株HK56.使用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)的方法从M.huakuii 7653R中克隆了exo56序列.exo56全长969 bp,编码322个氨基酸,其编码产物Exo56与糖基转移酶2个家族的成员有很高的相似性,糖基转移酶为胞外多糖合成所必需.盆栽结果表明,ezc56基因突变株只能形成少量的不固氮根瘤.     

天冬氨酸转氨酶在中慢生根瘤菌MAFF303099共生固氮中的作用

为寻找根瘤菌中与共生固氮相关的调控基因,采用同源重组法,分别敲除中慢生根瘤菌MAFF303099在与豆科植物百脉根共生固氮过程上调表达的10个基因,研究它们对共生固氮的影响。结果显示:Δmlr5883敲除突变体相比于野生型MAFF303099,其固氮酶活性下降40%,侵染细胞形态未发生显著改变,对Δmlr5883回补可恢复固氮酶活性;预测mlr5883编码天冬氨酸氨基转移酶,体外检测该酶的天冬氨酸转氨酶活性为16.67 U/mg。该基因的突变会影响固氮效率,推测其可能参与对植物供给碳源的代谢过程。     

用Tn5标记带发光酶基因的华癸根瘤菌(Mesorhizobium huakui)7653R质粒

在ｐＲＫ２０７３的辅助作用下,通过三亲本接合转移,将Ｔｎ５（ｓａｃＢ－ｌｕｘＡＢ）插入华癸根瘤菌７６５３Ｒ菌株基因组中。将３２００个Ｔｎ５标记菌株影印到含有８％蔗糖的ＹＭＡ平板,检测这些菌株的发光酶活性和新霉素抗性。共获得８个菌株,其选择标记消失。质粒检测发现其共生质粒有不同程度的缺失甚至消除。结瘤实验证明,所有共生质粒部分缺失（有的缺失达１／３）的菌株依然结瘤。经用ｌｕｘＡＢ探针的分子杂交证实,８个菌株中有３个对应的标记菌株其Ｔｎ５插在共生质粒上。     

用Tn5标记带发光酶基因的华癸根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) 7653 R质粒

在pRK2073的辅助作用下,通过三亲本接合转移,将Tn5(sac B-luxAB)插入华癸根瘤菌7653R菌株基因组中.将3200个Tn5 标记菌株影印到含有8%蔗糖的YMA平板,检测这些菌株的发光酶活性和新霉素抗性.共获得8个菌株,其选择标记消失.质粒检测发现其共生质粒有不同程度的缺失甚至消除.结瘤实验证明,所有共生质粒部分缺失(有的缺失达1/3)的菌株依然结瘤.经用luxAB探针的分子杂交证实,8个菌株中有3个对应的标记菌株其Tn5插在共生质粒上.     

慢生根瘤菌及其与花生共生机制研究进展

氮是植物生长发育所必需的大量元素之一,豆科植物通过与根瘤菌的共生固氮获得氮素.这种共生关系的建立包括结瘤和固氮两个过程,涉及复杂的互作调控机理,并受环境因素的显著影响.花生与慢生根瘤菌的共生对花生生产尤为重要,具有较多特异和未知的共生机制.本文综述了慢生根瘤菌及其与花生共生的相关内容,具体包括:(1)花生的慢生根瘤菌多...     

华癸中生根瘤菌的分离、回接及质粒检测

从华中农业大学的水稻田中采集的紫云英根瘤中分离到62株华癸中生根瘤菌,对其中的57株进行了回接结瘤试验,供试菌株均能正常结瘤.并对其中的44株进行质粒检测,13株含3个质粒,21株含2个质粒,7株含1个质粒,3株不合质粒,质粒分子量范围约为174～510kb,为研究华癸中生根瘤菌内源性质粒的相互作用及其共生固氮效应奠定了良好的基础.     

青花菜上皮硫特异蛋白基因的功能

为探明上皮硫特异蛋白(epithiospecifier protein,ESP)在芸薹属蔬菜中对芥子油苷代谢的调控作用及其功能,通过构建青花菜上皮硫特异蛋白基因(BoESP)CaMV35S过量表达载体,并通过浸花法转化模式植物拟南芥,对BoESP基因进行功能验证。结果表明:BoESP的过量表达改变了芥子油苷的代谢产物组成,与野生型植株相比,BoESPCaMV35S过量表达的拟南芥植株4-methoxy-indole-3-acetonitrile含量增加,而1-isothiocyanato-4-methanesulfinyl-butane显著减少。这为青花菜BoESP在体内对芥子油苷水解代谢的调控提供了直接的证据。     

苎麻纤维素合成酶基因cDNA的功能分析

运用克隆的苎麻纤维素合成酶(BnCesA1)基因cDNA及植物表达载体pWM101,构建了35S启动子控制的苎麻BnCesA1基因核心区段反义融合表达载体(pWM-BnCesA),并通过根癌农杆菌介导法将其转化至模式烟草WS38,获得了转基因烟草.对转基因烟草植株进行的分子检测和初步组织学研究表明,转反义BnCesA1基因核心区段对纤维素的合成产生干扰,植株叶柄切片初生组织细胞较野生烟草松散,其基本组织细胞涨大,间隙也相应增大,证实BnCesA1基因的纤维素合成功能,表明BnCesA1基因在植物初生组织和次生组织的细胞壁合成中都发挥作用.     

灰葡萄孢产孢相关基因BC1G_03293功能的初步研究

据灰葡萄孢菌丝发育和菌核形成时期的RNA-seq数据,挑选出在这2个时期表达量差异较大的基因BC1G__03293进行基因功能的研究。结果发现,BC1G__03293在菌核发育时期表达明显上调,表达量比菌丝生长时期上调了70倍以上。该基因编码的蛋白质含有229个氨基酸,N端包含信号肽,但不含有任何已知保守结构域。通过同源重组的方法得到了BC1G__03293的敲除转化子ΔBC1G__03293-2和ΔBC1G__03293-4,并运用农杆菌转化技术得到了互补转化子ΔBC1G__03293-2-C2和ΔBC1G__03293-2-C3。BC1G__03293基因敲除后生长、致病及菌核形成等表型无明显变化,但敲除转化子的分生孢子产量显著下降,仅为野生型菌株B05.10分生孢子产量的45%,并且BC1G__03293基因互补可使敲除转化子的产孢量得到明显恢复。结果说明BC1G__03293基因与灰葡萄孢的分生孢子形成相关。