PCR技术及其在动物胚胎性别鉴定中的应用研究

ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｒｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）为聚合酶链式反应或体外扩增技术,是１９８５年美国Ｃｅｔｕｓ公司人类遗传部、加利福尼亚大学洛杉矶和Ｈｏｗｇｈｅｓ医学院等联合创建的一项体外酶促扩增ＤＮＡ新技术,具有特异性强、敏感性高、操作简便、...     

PCR技术及其在牛早期胚胎性别鉴定中的应用

本文对PCR(聚合酶链式反应)的基本原理、优点、方法及其在牛胚胎性别鉴定中的应用情况进行了扼要综述。     

牛早期胚胎的性别鉴定PCR技术的研究

根据牛SRY(Y-染色体性别决定基因)基因序列自行设计合成3对常规PCR引物作为牛性别鉴定特异性引物,对15头公牛、20头母牛的样品进行检测.结果表明,第2对引物可清晰扩增出公牛基因组DNA750 bp左右条带,而母牛基因组DNA无此扩增条带,证明这条引物可以应用于牛的早期胚胎性别鉴定研究与应用.     

鸟类性别鉴别方法的研究进展

许多鸟类都是雌雄单态的,对于雌雄单态的鸟类,尤其是幼鸟,很难通过体型外貌鉴定其性别.对雏鸟而言,通常不能用形态学方法来确定其性别.但鸟类性别鉴定却是开展鸟类育种及进化研究的先决条件.通过充分利用决定性别基因的相关知识,家禽育种计划就有可能会取得更好的效果.对雌雄单态鸟类常用的性别鉴定方法有翻肛鉴别、腹腔镜检、粪便类固醇检测以及核型分析等.然而,这些方法不仅可靠性差、耗时、价格昂贵,并且有的方法会给鸟类带来一些疼痛,甚至危及生命.由于雌鸟带有一条Z性染色体和一条W性染色体,而雄鸟带有两条Z性染色体,因此个体的性别可以通过位于其性染色体上基因来确定.在众多的DNA分子技术中,使用P2-P8引物对扩增性别特异的CHD1基因进行性别鉴定的方法最为可靠.     

PCR在牛早期胚胎性别鉴定中的应用

早期胚胎性别鉴定的方法有很多种,大致可分为两大类：一是前期主要采用的非生物学方法,如组织方法,免疫学方法[~[p16]〔1〕],X-相关酶法[~[p16]〔2〕]等,这些方法都缺少准确性和速度;二是80年代末,随着DNA体 外重组技术而发展起来的分子生物学方法,如DNA探针法〔3〕,聚合酶链反应法（PCR）。其中PCR法以灵敏、特异、准确和快速等特点,而成为胚? 胎性别鉴定中最有研究价值的技术方法。自Herr等（1990）[~[p16]〔4〕]报道了用PCR进行奶牛胚胎性别鉴定技术之后,国内外许多学者从事了这方面的研究 ,使准确率接近或达到了[=]100%,同时操作过程也简化了许多,并且可以在几个小时内完成,为PCR法进行早期胚胎性别鉴定应用于生产提供了基础。     

鸟类性别鉴定的分子生物学方法

性别鉴定对鸟类特别是濒危珍稀鸟类的饲养管理、人工繁育、遗传疾病的防治和进化研究等方面都有非常重要的意义，作者总结了以往鸟类性别鉴定形态学和细胞生物学方法，分析比较了现行的较为先进可行的分子生物学方法，指出与其他鸟类性别鉴定方法相比， PCR鉴定方法尤其是CHD-W基因鉴定是到目前为止最为简单快捷、准确可靠的鸟类性别鉴定的途径，在未来存在广阔的应用前景。     

PCR法鉴定雏鸽性别的初步研究

雏鸽的雌雄外貌形态差别甚微,极难区别。为有效准确地鉴别雏鸽的性别,淘汰非目的性别,从而降低饲养成本,提高经济效益。本研究通过采用PCR方法,选定特殊的性别CHD1基因及鉴定引物,克隆出雏鸽特定性别基因序列鉴定雏鸽的雌雄。结果表明:在雏鸽雌性样本中扩增出1条带(777 bp),而雄性中未见扩增带,显示出CHD1基因的性别特异性,PCR扩增性别鉴定结果与样本解剖后对性腺观察的形态学鉴定结果也完全一致。在87份样品中,阳性克隆结果为25,阴性克隆结果为62,故87只雏鸽中雌鸽25只,雄鸽62只,其准确率达100%。     

利用多重PCR技术快速鉴定牛性别的研究

为了建立一套简单、快速鉴定性别的方法,试验根据牛的Beta基因及SRY基因,设计2对引物(β-1,2和SRY-1,2),对牛96个牛肉DNA样本进行PCR性别鉴定。结果表明:雄性样品扩增出了300 bp和429 bp 2条片段,而雌性样品只能扩增出300 bp 1条片段。40个牛血液DNA样本鉴定结果与实际性别对比,雄性、雌性准确率均为100%。     

猪性别鉴定双重PCR方法的建立

哺乳动物的后代性别选择往往引起社会的关注。在畜牧业养殖生产中,公母畜个体在生长速度及生产价值等方面存在差异,人们往往希望后代是雌性,以满足经济要求,因此早期性别鉴定技术十分关键。有性精液技术在后代性别选择方面具有较高的准确性和可重复性,但目前对含X、Y精子的鉴定方法尚不十分准确。为快速鉴别猪的性别,研究建立了一种可靠、准确、简便的猪DNA样品双重PCR性别鉴定的方法。首先从NCBI获得了猪X性染色体特异性遗传基因A激酶锚定蛋白4(AKAP4)和Y染色体特异性遗传基因性别决定基因（SRY）的序列,设计双重PCR引物,测试引物的特异性扩增产物;之后对双重PCR扩增条件进行升级优化以获得最佳的反应条件,确定了反应的灵敏度;最后对20个猪DNA样品进行了盲检,性别鉴定结果均正确,准确率高、灵敏度高。实验获得的双重PCR方法为今后猪生产中性别鉴定提供了基础数据。     

应用PCR方法对奶牛早期体外受精胚的性别鉴定

试验以牛雄性特异序列BOV97M和牛属1.715卫星DNA序列设计引物进行PCR扩增,以进行牛的性别鉴定.共检测76枚胚胎,37枚为雌性,39枚为雄性,把雌性胚胎进行移植,受胎11头,受胎率29.73%,产出母犊10头,准确率为90.91%.     

The W‐ and Z‐linked EE0.6 sequences used for molecular sexing of captive Japanese crested ibis on Sado Island

The Japanese crested ibis Nipponia nippon is a critically threatened bird. Accurate sexing is necessary to perform effective management of captive breeding toward a national project for a tentative release of the Japanese crested ibis on Sado Island. A PCR‐based sexing method targeting a 0.6 kb EcoRI fragment (EE0.6) sequence on W chromosome with AWS03 and USP3 primers has been developed for the Japanese crested ibis. However, the primers were selected from the EE0.6 sequences from bird species other than the Japanese crested ibis. In this study, we determined the W‐ and Z‐linked EE0.6 sequences in the Japanese crested ibis, and clarified Japanese crested ibis sequence mismatch in the binding sites of the primers. Further, we found no polymorphism in the primer binding sites among five founder birds for the Sado captive Japanese crested ibis population. These findings validated the PCR‐based sexing method with the AWS03 and USP3 as accurate molecular sexing methods of captive Japanese crested ibis on the Sado Island. Additionally, we designed a primer set for a novel PCR‐based sexing, based on the EE0.6 sequences obtained in this study. This novel sexing method may be useful for future ecological research following the release of Japanese crested ibis on Sado Island. This is the first report to show the EE0.6 sequences in Japanese crested ibis.     

非电泳法PCR牛早期胚胎性别鉴定研究

为选出更高效、实用的牛胚胎性别鉴定方法，分别用成年牛血样提取的基因组DNA和冷冻的牛早期胚胎细胞DNA为样本，以电泳法和非电泳法用相应的性染色体DNA引物做胚胎PCR性别鉴定实验，以相对比。血液模板DNA结果与胚胎样本结果都表明，使用DYZ-1引物的非电泳法在比使用SE引物的电泳节约1h以上时间的同时，具有比SE更高的灵敏度。这次研究在我国首次成功地把非电泳PCR法应用到牛胚胎性别鉴定之中，减少了胚胎性别鉴定的操作步骤，并大大缩短了性别鉴定所需要的时间，从而使胚胎移植现场性别鉴定更加可行。     

定量PCR技术的研究现状及应用概述

定量PCR的问世是继定性PCR（即常规PCR）后分子生物学方法学研究的一大飞跃，实现了对核酸信息量的分析比较，为疾病的诊断和治疗提供了更多、更有效的基因水平信息。本旨在介绍定量PCR技术的研究现状，包括PCR产物定量检测的几种常用技术以及近年来研究和应用较多的几种重要的定量PCR方法。同时，对定量PCR技术在分子生物学和临床上的应用也作了探讨。     

Experiences of Using PCR for Sexing Bovine Embryos*

Bovine embryos were used to evaluate the accuracy and the efficiency of sexing embryos by amplifying male specific DNA using the polymerase chain reaction. Blind tests with biopsies and biopsied embryos suggested that the method is accurate. However, often the amplification was unsuccessful and the assay therefore uninformative. We were able to amplify male specific DNA from degenerated embryos as well as from embryos stained with Hoechst 33342.     

应用Y—DNA特异片段的PCR技术鉴定牛和绵羊胚胎性别及应用研究

本研究采用国际八十年代中后期研究成功的特定ＤＮＡ片段扩增技术—聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，进行牛和绵羊胚胎性别鉴定。采用删除富集法，构建富含牛和绵羊Ｙ—ＤＮＡ文库，筛选出特异克隆，并根据其序列，分别设计合成引物，用ＰＣＲ技术分别扩增牛Ｙ染色体上约１４０ｂｐ的片段，绵羊Ｙ染色体上约１３０ｂｐ的片段。对已知性别的牛和绵羊血液样品进行检测，准确率均为１００％（１０／１０；１１／１１）。应用已建立的简易、快速胚胎取样方法及防污染措施，以及设计合成的引物和ＰＣＲ检测胚胎性别的技术方法，奶牛胚胎经性别鉴定后移植，产犊牛７头（４头公犊，３头母犊），准确率为１００％（７／７）。在内蒙牧区生产现场，对绵羊胚胎经性别鉴定后移植，共移植成功１８只受体母羊（每只母羊移植２－４枚同性别胚胎），产羔２５只（８只公羔，１７只母羔），准确率为８０％（２０／２５）。     

黑冠鹤性别的分子鉴定方法

黑冠鹤，也称戴冕鹤，在我国数量较少，对其进行人工繁殖与人工育种意义很大。本研究采用非伤害性采样方法，利用黑冠鹤羽毛提取基因组DNA，之后利用2个引物组合对黑冠鹤EE0.6基因上的相关片段进行了特异性扩增。结果显示，这2个引物组合都能从雄鹤中扩增出1条片段，从雌鹤中扩增出2条片段，从而成功地对黑冠鹤的性别作出了准确判断，有利于黑冠鹤的成功配对和繁殖。     

鉴别牛早期胚胎性别PCR方法引物的设计与筛选

根据牛Y-染色体特异重复序列、睾丸特异蛋白基因以及性别决定基因序列设计合成5对公牛Y-染色体特异引物，依据牛骨胳肌α肌动蛋白前体基因和微卫星DNA序列设计合成4对牛DNA特异引物(内标引物)。单重PcR扩增牛基因组DNA，筛选出4对牛Y-染色体特异引物和1对牛DNA特异内标引物。将不同的Y-染色体特异引物与内标引物组合，多重PCR扩增牛基因组DNA、已知性别的牛成纤维细胞和克隆胚胎，筛选出2个可用于牛早期胚胎性别鉴别的PCR引物组合：B34／A12和B78／A12。     

应用PCR/RFLP技术对广西禽白血病病毒的检测与分型研究

对2000～2003年间从广西的南宁、玉林、桂林、钦州、柳州、梧州等地采集的有肿瘤/可疑肿瘤的250份鸡病例进行肿瘤病的检测.结果发现,外源性禽白血病阳性的有32份,阳性率为12.8%.其中,同时为马立克氏病阳性的有30份,两者共感染率高达93.75%(30/32);根据禽白血病病毒囊膜糖蛋白gp85基因的限制性片段长度多态性分析,对其中20份外源性禽白血病病毒进行分型鉴定,结果证实全部属于A亚群.     

兽用疫苗支原体污染的PCR检测技术的建立及应用

根据支原体的16 S rRNA基因设计特异性引物,以兽用疫苗中常见的支原体DNA为模板进行PCR试验,优化反应体系,建立了兽用疫苗支原体污染的PCR 检测方法,并对市场上的兽用疫苗随机抽查检测,其检出率为24.4%(22/90)。结果表明该方法特异性强,灵敏度高,有望成为兽用疫苗支原体污染的检测方法之一。     

PCR在肉类科学中的应用

聚合酶链式反应技术是一项体外酶促扩增DNA技术,具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速高效等特点,在肉品科学方面有潜在的应用价值。综述了PCR在肉类科学中的应用,如微生物的检测、肉类品种的鉴定等。