猪COPG2和MEST克隆、印记状况和组织表达分析

【目的】为了在猪中找到更多新的候选印记基因并分析它们在哺乳动物之间的保守性,以期为猪分子遗传育种提供基础分子生物学信息和分子标记。【方法】以长白与荣昌猪杂交F1 代一月龄个体为研究对象,通过比较生物学的方法,克隆COPG2和MEST全长cDNA,并分析基因的序列特点,然后利用 IMpRH(法国农业科学院的辐射杂种克隆板)分析COPG2和MEST在猪染色体上定位信息。通过RT-PCR产物直接测序方法分析了这些基因在一月龄F1代个体11个不同组织(心、胃、肌肉、肾脏、肺、肝、小肠、膀胱、舌头、脾和脂肪)的印记状况,并进一步利用Real-time PCR方法,分析其在一月龄F1代个体11个不同组织的表达情况。【结果】克隆得到2 817 bp COPG2和2 219 bp MEST序列。其中COPG2 包括2 616 bp 完整CDS(coding sequenc,编码序列)区域,分析表明其编码含871个氨基酸的蛋白质,MEST包括981 bp完整CDS区域,编码326个氨基酸的蛋白质。IMpRH分析结果表明,猪COPG2和MEST都位于猪18号染色体上并且与标记CL365941紧密连锁,LOD值分别为14.32和8.5。印记分析表明COPG2在11个组织中呈双等位表达,MEST在心脏、胃、肌肉、肾、肺、膀胱、舌头和脂肪中表达父方等位基因,但在肝脏、小肠和脾脏中呈双等位表达。荧光定量结果显示COPG2 和MEST总的表达量在一月龄个体各组织间存在着显著性差异(P＜0.01),其中COPG2和MEST在肾脏中表达量均高于其它各组织(P＜0.01)。【结论】在哺乳动物之间,COPG2序列较为保守但是印记状况却缺乏保守性;MEST序列和印记状况均较为保守,但MEST在猪中印记状况具有组织特异性。此外,染色体定位信息和印记状况证实了在猪的18号染色体上有由COPG2和MEST构成的新的印记域。     

猪SDHD和DCN基因多态性及遗传印记

为揭示猪SDHD和DCN基因印记表达特征,该研究以长白、大白、蓝塘3个品种的166头纯种猪为试验材料,在猪的SDHD和DCN基因的外显子内寻找SNP,通过PCR-SSCP方法对SDHD和DCN基因多态性进行检测;分别选取SDHD基因外显子4和DCN基因外显子2的SNP为杂合子的仔猪3头,以其主要的组织器官mRNA的产物...     

猪CAⅢ基因CDS区克隆、生物信息学及组织表达分析

对猪碳酸酐酶Ⅲ(Carbonic anhydraseⅢ,CAⅢ)基因进行克隆及生物信息学分析,并分析该基因的时空表达特性。通过RT-PCR和克隆测序技术获得猪CAⅢ基因的CDS序列,综合利用多种生物信息学软件,对该基因编码的蛋白质生物学特性进行预测,采用qRT-PCR技术检测CAⅢ基因的组织表达谱和时序表达规律。结果表明,猪CAⅢ基因CDS区长783 bp,编码260个氨基酸;CAⅢ蛋白为亲水性碱性蛋白,无信号肽,主要在细胞质中发挥作用;CAⅢ基因在心脏、肝脏、胰脏、肺、胃、背最长肌、皮下脂肪、脾脏、盲肠等9种组织中均有表达,但在背最长肌中表达量最高,极显著地高于其他组织。从初生到5月龄,大白猪背最长肌中CAⅢ基因 mRNA表达量呈上升—下降—上升—下降的趋势,初生时最低,随后表达量逐渐升高,到3月龄时达到峰值,之后开始下降;马身猪中,从初生到5月龄,CAⅢ基因 mRNA的表达量基本呈上升趋势,在5月龄时达到峰值,极显著地高于其他各个阶段。2个不同品种相比,3月龄和4月龄时,大白猪CAⅢ mRNA表达量显著或极显著地高于马身猪;而在5月龄时,马身猪CAⅢ mRNA表达量极显著地高于大白猪,其他阶段2个品种CAⅢ mRNA表达量无显著差异。CAⅢ基因可能直接或间接参与猪骨骼肌的生长发育过程。     

榕江香猪Noggin基因的组织表达

采用RT-PCR的方法对榕江香猪Noggin基因的组织表达进行研究,结果显示,Noggin基因在大脑、卵巢、子宫表达,其中大脑的表达量显著高于卵巢和子宫组织（P〈0．05）;脾、肺、脊髓、肝、肾等组织中未检测到Noggin基因的表达;对脑、子宫和卵巢检测分子长194bp的cDNA片段进行测序后,证实表达的片段为Noggin基因,与马、人、鼠、鸡和青蛙存在2～66个碱基的差别。研究结果证实Noggin基因在香猪的大脑、卵巢和子宫中表达,对这些组织可能有直接的调节作用。     

大足黑山羊PHLDA2基因的克隆、组织表达与印记状况分析

【目的】克隆大足黑山羊PHLDA2（pleckstrin homology-like domain, family A, member 2）基因序列,分析其组织表达特征、印记状况以及与胎盘性状的关系,为深入研究该基因在山羊胎盘中的功能积累数据。【方法】根据人、牛和猪PHLDA2的保守区域设计引物以RT-PCR方法扩增大足黑山羊该基因部分cDNA序列,进一步利用5′-和3′-RACE技术获得全长cDNA序列;利用ORF Finder和ProtParam等在线工具分析PHLDA2基因序列特征;采用Real-time PCR方法分析PHLDA2在大足黑山羊心、肝、脾、肺、肾、大脑、肌肉、脂肪、舌和胎盘等10个组织的表达差异;寻找大足黑山羊和波尔山羊PHLDA2基因序列SNP位点,基于表达SNP的方法分析该基因在F₁代组织中的印记状况;采用线性回归的方法分析PHLDA2表达量与胎盘性状的关系。【结果】克隆得到935 bp大足黑山羊PHLDA2的cDNA全长序列,其中5′-UTR、3′-UTR和编码序列分别为62 bp、450 bp和420 bp,其编码140个氨基酸。预测的山羊PHLDA2蛋白分子量大小为15 638.7 Da,等电点为9.18,二级结构由α-螺旋(37.14%)、β-转角(9.29%)、延伸链(23.57%)和无规卷曲(30%)组成, 并且包含保守的PH（pleckstrin homology）结构域。③BLAST分析发现,山羊PHLDA2定位于29号染色体,其与牛、猪、猕猴、马和人同源基因核苷酸序列的相似性分别达到91%,90%,90%,90%和89%,在核苷酸和氨基酸序列上与牛的亲缘关系最近。④荧光定量PCR结果显示PHLDA2在山羊胎盘中表达量最高（P < 0.01),在心、肝、肺、肾、肌肉、脂肪、舌和大脑组织中表达量很低且差异不显著（P > 0.05), 在脾中未检测到表达。⑤印记分析表明,PHLDA2在初生山羊胎盘、心脏和肝脏组织表达母源等位基因,但在肺、大脑和肌肉组织为双等位基因表达。⑥PHLDA2表达水平与山羊胎盘重回归关系显著（n = 15,R²=0.855,P <0.01）。【结论】山羊PHLDA2基因序列和结构特征具有物种间的保守性,但是其印记状况具有组织特异性; PHLDA2为山羊胎盘的生长和功能调控的重要基因。     

苏淮猪VRTN基因克隆、组织表达特征与多态性分析

【目的】获得苏淮猪VRTN基因编码区序列,了解其序列特征和组织表达特征,分析苏淮猪VRTN基因ins291位点的多态性。【方法】以苏淮猪卵巢组织cDNA为模板,采用克隆测序技术分离获得苏淮猪VRTN基因编码区序列。利用BioEdit 7.0软件分析其序列特征和蛋白理化性质。利用Clustal W软件进行核苷酸和蛋白质序列比对分析。利用UCSC基因组浏览器与NCBI基因组数据库进行猪VRTN基因的染色体定位和基因组结构分析。利用SMART软件预测蛋白质功能域,CPHmodels软件预测蛋白质三级结构。随机选取3头成年苏淮猪母猪,屠宰后立即采集心、肝、脾、肺、肾、下丘脑、肌肉和卵巢等组织,提取组织总RNA,采用RT-PCR技术分析苏淮猪VRTN基因的组织表达谱。采集106头成年苏淮猪繁殖母猪耳组织样,提取基因组DNA,采用 PCR-凝胶电泳分析苏淮猪VRTN基因ins291位点的多态性。【结果】苏淮猪VRTN基因编码区序列全长为2 097bp,与其它哺乳动物如人、小鼠、牛和羊的一致性分别为84.98%、74.53%、85.84%和86.45%,而与鸡的一致性只有54.42%。基因组结构分析发现猪VRTN基因由2个外显子和1个内含子构成,定位在猪7号染色体上。苏淮猪VRTN基因编码蛋白含有698个氨基酸残基,与人、小鼠、牛和羊等的一致性分别为85.55%、70.07%、86.20%和86.06%,但与鸡的一致性只有51.17%,可见哺乳动物VRTN基因在进化过程中比较保守。氨基酸组分分析显示苏淮猪VRTN蛋白氨基酸序列存在全部20种氨基酸,其中Leu（亮氨酸）含量最高,达到10.44%,而Asp天冬氨酸含量最低,只有1.43%。蛋白结构分析发现苏淮猪VRTN蛋白含有 HTH结构域等典型结构域,由6个α螺旋、5个β折叠以及若干无规则卷曲组成。RT-PCR分析表明VRTN基因在苏淮猪心、肝、脾、肺、肾、下丘脑、卵巢和肌肉组织等组织中均有表达,说明VRTN基因是一个广泛表达的基因。在苏淮猪群体中检测到VRTN基因ins291位点的3种基因型,其中仅有93bp条带的为野生纯合型（wt/wt）,仅有384bp条带的为突变纯合型（Q/Q）,含有384和93bp条带的为杂合型（wt/Q）。在苏淮猪群体中wt/wt型为优势基因型,基因型频率为0.717;wt为优势等位基因,基因频率是0.816;高脊椎数等位基因Q的频率为0.184。遗传多态性分析发现苏淮猪VRTN基因ins291位点的多态信息含量为0.331,为中度多态位点,杂合度为0.40,变异程度相对较低。【结论】 获得了苏淮猪VRTN基因序列,其表达无组织特异性;苏淮猪群体中存在高脊椎数等位基因Q。     

撒坝猪MCUR1基因克隆、生物信息学分析及其组织表达量检测

本研究克隆了撒坝猪MCUR1基因,对其进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR检测其在撒坝猪、大白猪不同组织中的表达水平。根据GenBank上公布的猪的MCUR1基因序列(登录号:XM_003128183.4)设计引物,通过PCR扩增及测序获得撒坝猪MCUR1基因CDS序列,该序列全长1 095 bp,编码364个氨基酸;MCUR1蛋白的分子式C₁₇₈₇H₂₉₄₉N₅₃₃O₅₀₃S₁₄,相对分子质量40.398 ku,理论等电点(pI)10.27,不稳定系数55.70,脂肪指数95.99,平均亲水性为-0.213,属于亲水蛋白;MCUR1蛋白没有信号肽和跨膜结构,含有2个螺旋卷曲结构,主要在细胞质中发挥生物学功能;含有32个磷酸化位点;含有一个CpG island;二级结构由58.24%的α-螺旋,4.12%的β-转角,30.22%的无规则卷曲,7.42%的延伸链构成;猪MCUR1基因编码区序列与牛、鸡、狗、山羊、人、猴、鼠、绵羊的同源性分别为85.3%、68.0%、83.6%、87.9%、84.4%、80.3%、76.8%、88.2%,与绵羊、山羊、牛的亲缘关系较近,与鸡的关系较远;在肝脏中的表达量最多,肺脏中的表达量最少。在大白猪的背最长肌中MCUR1的表达量高于撒坝猪的背最长肌(P<0.01)。     

猪BYSL基因克隆、序列特征及表达分析

BYSL基因是哺乳动物胚胎着床和胚胎发育的关键因子。为进一步研究猪BYSL基因的结构与功能,揭示其表达模式,本研究结合基因同源序列克隆技术和RT-PCR方法克隆了猪BySL基因;利用生物信息学软件对该基因进行序列特征和结构分析;利用Real-time PCR技术分析了BYSL基因的时空表达模式。结果表明,猪的BYSL编...     

紫苏PfPDCT基因序列特征及表达分析

采用生物信息学技术和在线分析软件对紫苏PfPDCT基因序列及所编码的蛋白质进行分析,并且利用实时荧光定量PCR技术研究该基因在晋紫苏1号种子发育不同时期的表达特性,旨在探究磷脂酰胆碱甘油二脂转磷酸胆碱酶(PDCT)在植物脂肪酸代谢过程的作用。结果表明,紫苏PfPDCT基因c DNA全长序列为2 098 bp,开放阅读框为1 683 bp,编码560个氨基酸残基。生物信息学分析结果表明,PfPDCT蛋白分子量约为59.315 ku,等电点为9.48,不稳定系数为35.00,推测其为稳定蛋白,与已知赤藓PDCT蛋白高度同源。通过荧光定量PCR分析可知,紫苏PfPDCT基因在不同发育时期的种子中均有表达,其中,在开花后20 d表达量最高,为开花后10 d的1.92倍。研究结果可为进一步阐明紫苏PfPDCT基因的功能及作用机制奠定基础。     

Characterization, Imprinting Status and Tissue Distribution of Porcine GTL2 Gene

The callipyge （CLPG） phenotype, exhibiting polar overdominance （POD）, is an inherited skeletal muscle hypertrophy described in sheep. The callipyge locus maps to the distal portion of ovine chromosome 18 within the DLKI-GTL2 region and corresponds to human chromosome 14 and mouse chromosome 12. The POD phenomenon is confirmed to the homologous region of swine chromosome 7. In order to clone and investigate the expression of porcine GTL2 gene, DNA and RNA samples from 60-day-old F1 animals, generated with reciprocal crosses between Large White and Meishan breeds and their parents, were used. The authors showed that porcine GTL2 acted as a uoncoding RNA. cDNA samples exhibited maternal expression of the gene in the heart, liver, spleen, lung, kidney, stomach, small intestine, skeletal muscle, and fat in pigs, and a unique tissue-specific expression different from that of humans and mice. These results indicated that the gene was conserved in the pig, human, mouse, and bovine. It will be of interest to further study the gene functions in muscle growth and fat deposition.     

鸡DLK1基因的生物信息学分析

DLK1基因是哺乳动物的一个印记基因,DLK1蛋白促进哺乳动物肌肉的生长发育,但抑制脂肪的生长发育。禽类不存在基因组印记现象,目前禽类DLK1基因的功能和调控机制还不清楚。本研究针对鸡等13种动物的DLK1蛋白进行了多序列比较分析、分子进化分析及糖基化分析,同时还比较了人、鼠及鸡的DLK1基因结构、基因同线性、启动子结...     

猪Mighty基因的克隆与组织表达分析

Mighty基因是在骨骼肌中发现的一个新颖的肌形成前期因子。基于电子延伸序列,本试验成功克隆出了Mighty基因,其全长874 bp,开放阅读框为579 bp,编码有193个氨基酸,提交GenBank(EU559709)。同时,试验采取半定量RT-PCR法,以18S rRNA为内标,研究了Mighty基因在仔猪18个组织中的分布和mRNA的表达水平。     

猪CISD1基因电子克隆与验证

对通过抑制差减杂交技术所筛选的猪前脂肪细胞诱导分化后差异表达的CISD1基因的EST序列为探针进行电子克隆,用克隆序列设计引物,通过RT-PCR、克隆测序、同源比对证实所获序列为猪CISD1基因的mRNA序列,并将序列提交到Genebank,登录号为GQ913654。所获猪CISD1基因的mRNA序列全长为631 bp,CDS包含321 bp,由其编码的CISD1蛋白包含106个氨基酸残基,理论等电点为9.20,属脂溶性不稳定蛋白。猪CISD1蛋白的1~23位氨基酸可能是信号肽,53~91位氨基酸形成CDGSH锌手指域,为该蛋白的重要功能域,猪CISD1蛋白的三级结构与人CISD1蛋白相似度为89.333%。     

猪TAF7基因的克隆、染色体定位和组织表达谱分析

 【目的】通过对猪TAF7基因初步的研究,为猪分子遗传育种提供基础分子生物学信息,为猪的遗传育种提供分子标记。【方法】以五指山猪为研究对象,克隆TAF7基因,分析该基因结构特点,然后利用IMpRH（the INRA-University of Minnesota porcine radiation hybrid,法国农业科学院-明尼苏达大学的辐射杂种克隆板）分析该基因在猪染色体上定位信息,利用半定量RT-PCR方法,分析该基因在成年五指山猪16个不同组织（心脏、背肌、淋巴、脾脏、肝脏、肾脏、肺脏、子宫、睾丸、胃、小肠、大肠、卵巢、胸腺、脑、脂肪）的表达谱信息。【结果】克隆得到长1 701 bp的五指山猪TAF7基因序列,其中包括1 050 bp完整CDS（Coding Sequence,编码序列）区域,分析表明其编码含349个氨基酸的蛋白质。利用IMpRH分析结果表明,猪TAF7基因与分子标记SW1879和IL4（interleukin-4,白细胞介素-4）紧密连锁,LOD（Limit of Detection,检测极限）值分别为6.69和6.15。组织表达谱分析结果显示该基因在大多数组织中均有表达,其中在睾丸表达量较高,而在心脏、背肌中表达很低。【结论】猪TAF7基因5’UTR中有一个短的内含子,而在该基因CDS区域没有内含子。猪TAF7蛋白序列与人TAF7蛋白序列的相似性较高,二者在生物系统发育树中的距离最接近。猪TAF7基因在大多数组织中均表达,在猪睾丸中表达量较高,证实它调节目的基因转录具有广泛性。     

猪博卡病毒NP1基因的克隆及其生物信息学分析

根据Gen Bank发表的猪博卡病毒主要抗原基因NP1基因设计1对引物,采用降落PCR方法进行扩增,克隆后测序,并对该基因进行生物信息学分析。结果表明:成功克隆到猪博卡病毒NP1基因;NP1蛋白的二级结构中自由卷曲含量最高(51.77%),无跨膜蛋白,含有1个糖基化位点、30个磷酸化位点,有6个线性B细胞优势抗原表位,分别位于NP1蛋白的7—14位、27—50位、59—73位、85—94位、102—108位、151—155位。     

猪细小病毒NS1基因和VP2基因的克隆与序列分析

根据GeneBank 上发表的猪细小病毒(PPV)的基因组序列,分别设计扩增非结构蛋白NS1基因和结构蛋白VP2基因的特异性引物,采用PCR方法扩增PPV泰安株(PPV-TA)NS1基因和VP2基因.结果表明,PPV-TA NS1基因长1989 bp,编码662个氨基酸,与参考PPV NS1基因核苷酸同源性在98.3 %～99.9 %之间.PPV-TA NS1蛋白有3个糖基化位点分别是356NIS、446NFS、513NLT,除PPV Tomau/1/02在356位缺失了一个糖基化位点之外,PPV-TA与其他PPV参考毒株一致;这表明不同毒株NS1蛋白调节功能可能有差异.PPV-TA NS1蛋白的潜在磷酸化位点是Thr435和Ser473,与PPV参考毒株相同.NS1基因系统发生分析表明,PPV-TA与PPV china亲缘关系最近.PPV-TA VP2基因长1740 bp,编码579个氨基酸,与PPV参考毒株VP2基因核苷酸同源性在98.3 %～99.8 %之间.PPV-TA VP2蛋白的378D、383H、436S氨基酸残基决定了PPV的组织嗜性,与PPV-NADL-2和PPV-china相同,这表明这3个毒株的组织嗜性是一致的.但与其他PPV参考毒株有差异,这表明不同毒株在动物体内的组织分布是有差别的.PPV-TA VP2蛋白有9个线性抗原位点,与PPV NADL-2和PPV china的线性抗原位点是一致的,这表明具有相同的抗原特性.VP2基因系统发生分析表明,PPV-TA与PPV NADL-2亲缘关系较近.     

猪圆环病毒1型ORF2基因的克隆与序列分析

参照Genbank上公开发表的PCV1全基因序列设计引物,以质粒pSK-PCV为模板扩增出PCV1-ORF2基因,插入pMD18-T载体,对筛选出的阳性质粒进行测序,将测序结果同Genbank上发表的PCV1基因序列相比较,同源性达97％,再与Genbank上发表的PCV2的ORF2基因序列相比较发现PCV1-ORF2和PCV2-ORF2的差异表现在两者在核苷酸序列的2个部位互相存在基因缺失现象。将推导出的PCV1-ORF2的氨基酸序列同PCV2-ORF2进行比较,发现二者在几个功能区相当保守,尤其是N-末端的核定位序列、N-糖基化位点以及酪氨酸磷酸化位点。