黄瓜根系蛋白质组分析的双向电泳技术条件优化

双向电泳(2-DE)是蛋白质组学研究的重要支撑技术之一。为建立适于黄瓜根系蛋白质组分析的双向电泳技术,对黄瓜根系蛋白质样品提取方法、裂解缓冲液配方及SDS-PAGE分离胶浓度等参数进行研究。结果表明:采用TCA/丙酮法提取黄瓜根系中的蛋白质,裂解缓冲液为8mol·L-1尿素、2mol·L-1硫脲、2%IPG Buffer、4%CHAPS、1%TBP、65mmol·L-1DTT、2mmol·L-1EDTA、0.001%溴酚蓝和1%鸡尾酒,SDS-PAGE分离胶浓度为11%时,可获得分离效果较好的双向电泳图谱。该技术条件为适合黄瓜根系蛋白分离的较优双向电泳体系。     

适于番茄叶片蛋白质组分析的双向电泳优化体系的建立

[目的]建立适于番茄叶片蛋白质组分析的双向电泳(2-DE)技术,为开展番茄蛋白质组学研究奠定技术基础.[方法]对番茄叶片蛋白质提取方法、蛋白质裂解液、上样量、胶条pH范围等关键步骤进行优化.[结果]采用三氯乙酸／丙酮法提取番茄叶片总蛋白质,含有7 moL/L尿素,2 mol/L硫脲,4; CHAPS,30 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)裂解缓冲液,上样量为100 mg,以pH 4 ～7、18 cm的IPG胶条在12; SDS-PAGE凝胶浓度下进行双向电泳,得到了蛋白点均匀分布、低峰度蛋白点较为清晰,蛋白点数目多且分辨率高的2-DE图谱.[结论]建立了一套适于番茄叶片蛋白质分析的双向电泳技术体系,为下一步在蛋白组学水平上分析番茄逆境胁迫等相关蛋白提供了技术支持.     

适用于小麦叶片蛋白质组分析的样品制备方法

 【目的】建立适用于小麦叶片蛋白质组分析的样品制备方法。【方法】以Taichung 29小麦苗期叶片为材料，分别采用改进的酚提取-甲醇/醋酸铵沉淀法及尿素/硫脲提取法提取总蛋白，进行双向电泳分离和胶体考染，并选取代表性的蛋白点进行MALDI-TOF质谱分析及数据库搜索。【结果】上述的两种方法可检测到较多的蛋白点数，分别为1 016±203和1 014±281，并能成功地完成代表性蛋白点的鉴定。【结论】作者建议，进行小麦叶片蛋白质组分析时，可采用本实验提供的两种样品制备方法。     

小麦叶片蛋白质组分析中高丰度蛋白Rubisco酶的快速去除方法研究

【目的】建立一种小麦叶片蛋白质组分析时去除全蛋白提取物中高丰度蛋白Rubisco酶的方法,为富集低丰度蛋白,提高双向电泳灵敏度提供技术支持。【方法】采用分离技术,以铭贤169小麦苗期叶片为材料,使用不同浓度(1,2,5,10 mmol/L)的肌醇六磷酸钠,结合二水氯化钙在不同温度(4,20,37℃)去除小麦叶片蛋白中的Rubi-sco酶,筛选去除小麦叶片蛋白Rubisco酶的最佳条件,并采用一维凝胶电泳(1-DE)、Western blot方法检测去除Rubisco酶的有效性,用二维凝胶电泳(2-DE)评估该方法对样品在二维凝胶上分辨率的影响。【结果】在37℃条件下,采用10 mmol/L肌醇六磷酸钠结合10 mmol/L的二水氯化钙去除小麦叶片蛋白中的Rubisco酶,可以获得较好的去除效果。在上述条件下作用10 min,小麦叶片水溶性蛋白提取物中超过80%的Rubisco酶得以沉淀去除,二维电泳图谱上有更多的低丰度蛋白点显现,且水平条纹明显减少,分辨率有所提高。【结论】得到了一种用于小麦叶片蛋白质组分析时去除高丰度蛋白Rubisco酶的方法,该方法具有快速、高效、成本低的特点。     

适用于甜玉米叶片蛋白质组分析的双向电泳技术

采用改良的TCA/丙酮法提取叶片总蛋白,建立了一套适用于甜玉米叶片的蛋白质组学研究方法,并对蛋白溶解液、蛋白上样量、第一向IEF等电聚焦时间等条件进行了优化.用改进的蛋白溶解液提取叶片总蛋白,明显减轻了离子干扰造成的蛋白点横拖;500μg蛋白上样量的检出蛋白点最丰富,可达750个以上;延长8 000 V等电聚焦至30 000 Vh可获得良好的蛋白点分离效果;采用优化条件后的双向电泳参数,结果重复性较高,检出蛋白点的线性回归相关系数可达0.93以上.     

Extraction of Proteins from Apple Leaves for Two-Dimensional Electrophoresis Analysis

In order to develop an efficient method about protein extraction which is suitable for apple proteomic analysis, four protocols of total protein extraction from apple leaves, which are trichloroacetic acid/acetone precipitation method （TCA）, phenol extraction methanol/ammonium acetate precipitation method, Tris-HCl extraction method and modified Tris-HCl extraction method were compared. The results showed that the modified Tris-HCl extraction method was the most suitable method in protein extraction for two-dimensional electrophoresis （2-DE） from apple leaves based on the highest resolution and more informative spots of 2-DE gels with no apparent vertical or horizontal streaking.     

枯萎病菌胁迫下黄瓜叶片蛋白质组分析

以黄瓜感枯萎病品系1900和抗枯萎病转基因品系1905为试材,采用灌根法接种枯萎病菌分生孢子悬浮液,48h后提取叶片蛋白质,采用差异蛋白质双向电泳技术研究枯萎病胁迫下黄瓜叶片蛋白质组的变化.结果表明:黄瓜幼苗在枯萎病菌胁迫下,感病和抗病品系的双向电泳图谱存在一定差异.通过质谱分析,共鉴定出3-磷酸甘油醛脱氢酶、景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶、木葡聚糖内转糖苷酶、聚光复合体叶绿素a/b结合蛋白、假拟蛋白和5类表达差异的蛋白点.这些植物代谢中产生的能量和一些小分子可能激发了黄瓜抗枯萎病基因的表达.     

干旱胁迫下小麦根部蛋白表达变化的双向电泳分析

干旱是影响小麦生长和产量的主要环境因素之一,研究小麦耐旱机制对提高小麦产量保证粮食安全有重要的意义。本研究以耐旱小麦晋麦79为材料,利用双向电泳技术,对其两叶一心期幼苗在16. 7%PEG-6000胁迫0、1、6、72 h的根部蛋白质表达谱进行分析,比较不同胁迫时间点的小麦蛋白质表达谱的差异。结果表明,相对于0 h的表达谱,67种蛋白质在不同的胁迫时间点改变了其表达丰度。对其中至少在某一个时间点上调表达2倍以上的20个蛋白质点进行基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)分析,质谱结果中得到了18个阳性蛋白质点的信息,包括9个功能已知的蛋白和9个未鉴定的蛋白。已知功能的蛋白涉及到能量代谢、胁迫耐受性、信号转导和蛋白质合成/代谢等生理生化过程,表明植物在干旱胁迫下调节多种蛋白质的表达,综合调控其耐旱性。同时,干旱胁迫下未鉴定的丰度差异蛋白质点(DAPs)为克隆新的干旱相关基因和进一步研究小麦的耐旱机理提供了有价值的信息。本试验结果为进一步研究小麦耐旱机理奠定了基础。     

水稻叶片质膜的纯化及质膜蛋白质双向电泳分析

采用双水相分配法和离心法对水稻叶片的细胞质膜进行了纯化.选用聚合物Dextran T 500/PEG 3350质量分数分别为6.1%、6.2%、6.3%、6.4%、6.5%的双水相体系,对3次分配后的细胞质膜纯化效果进行了研究,并进行了细胞质膜标志酶H+-ATPase的活性测定、柠檬酸铅-醋酸铀双染色及电镜检测.结果表明:聚合物质量分数为6.3%的双水相体系可以获得高纯度的质膜微囊,且随分配次数的增加,可以有效减少其他内膜的污染,其质膜标志酶VO34--ATPase的相对活性高达93.5%.粗质膜经过3次两相分配后的蛋白质产率为2.73%.非离子型去垢剂Brij 58对质膜H+-ATPase的活性变化影响结果表明,纯化的质膜微囊封闭性较好,主要为正向型质膜微囊.质膜蛋白质经增溶缓冲液溶解及1-D SDS-PAGE的结果表明,纯化后的质膜有效减少了特定蛋白质条带的丰度,使蛋白质条带的分布更为均匀.双向电泳结果表明,纯化后的质膜双向电脉图谱具有低背景、高分辨率和重复性的优点,为进一步的水稻质膜蛋白质组研究提供了可靠的试验材料.     

玉米幼苗根、茎、叶总蛋白质双向电泳方法的优化

利用改进的三氯乙酸/丙酮法对5叶期玉米根、茎、叶的总蛋白质进行双向电泳获得了高分辨率的电泳图谱。在等电点4～7范围内,根、茎、叶电泳图谱上的蛋白质点数分别为1100±89、1275±72和1327±98个。3个器官蛋白质点的分布在分子量25～75 kD和等电点5～6的范围内相对集中。通过优化样品的清洗程序结合对蛋白质在丙酮水化液中的2次沉淀能够较好地除去样品中的杂质而保证电泳质量。优化后的方法可用于玉米幼苗的根、茎、叶总蛋白质双向电泳的试验研究。     

玉米叶片蛋白质双向电泳方法的优化

摘要：为了建立适合玉米叶片蛋白质组研究的双向电泳方法,以抗旱玉米自交系齐319为实验材料,采用三种不同的蛋白提取方法提取玉米叶片总蛋白,进行单向SDS-PAGE和双向电泳,并进行硝酸银染色。结果表明,TCA/丙酮沉淀法适合玉米叶片蛋白质的提取。建立了适合玉米叶片可溶性蛋白的双向电泳体系,即采用24cm、pH4-7的IPG胶条,蛋白上样量0.25mg。IEF程序为:100V 1h;300V 1h;500V 1h;1000V 2h;8000V 3h;8000V 10h。SDS-PAGE的电泳条件为 1W/胶条 1h,3W/胶条,直到溴酚蓝到达玻璃底部为止。本研究为下一步在蛋白质组水平上分析干旱胁迫下玉米叶片蛋白质的变化提供了技术支持。     

银杏小孢子叶球蛋白提取和双向电泳体系优化(Ⅱ)

以银杏小孢子叶球为材料,比较了不同的提取的方法、蛋白质裂解液组成、pH值范围以及不同质量浓度SDS-PAGE凝胶对双向电泳的影响.结果表明:TCA/丙酮/酚法比TCA/丙酮法更适合于银杏小孢子叶球蛋白的提取;含有硫脲的蛋白质裂解液Ⅱ,可显著提高蛋白质的溶解性,在2-DE图谱上可分辨出748个蛋白质点,比用蛋白质裂解液Ⅰ...     

一种适于cDNA-AFLP分析的茶树叶片总RNA提取方法

茶树富含多糖、多酚,从茶树组织中提取高质量的RNA较为困难,cDNA-AFLP技术对RNA质量要求较高,因而从茶树叶片中提取高质量的RNA是cDNA-AFLP试验正常进行的重要保障。该试验采用改进的CTAB法从茶树叶片中提取总RNA,结果表明:琼脂糖凝胶电泳显示28S、18S、5S 3条带清晰,完整性好,产率高;A260/A280值为2.07,范围为1.8~2.1,DNA和蛋白质污染较少;经逆转录、双链cDNA合成和cDNA-AFLP检测,证实提取的RNA能满足cDNA-AFLP技术对RNA质量和数量的要求。该方法为应用cDNA-AFLP技术顺利开展茶树分子生物学方面的研究奠定了基础,处理方式简单且成本较低。