贯叶金丝桃ISSR反应体系的建立与优化

以药用植物贯叶金丝桃为研究对象,对其ISSR—PCR反应体系中模板DNA用量、Mg2＋浓度、dNTP浓度、Taq酶含量及退火温度等因素进行了梯度试验,得到最佳ISSR—PCR反应体系,并初步筛选出13条条带清晰、多态性高、重复性好的ISSR引物,为贯叶金丝桃遗传多样性及种质资源鉴定等方面的研究奠定基础。     

桉树的ISSR反应体系建立及优化

以改进的CTAB法提取桉树嫩叶总DNA,进行ISSR分析,分别测试了退火温度、模板DNA浓度、Mg2 浓度、dNTPs浓度、TaqDNA聚合酶用量对反应结果的影响。桉树ISSR-PCR分析较适宜的扩增条件是:25μL PCR反应体积中,buffer(10 mM Tris-HCl,pH9.0,50 mM KCl,0.1%Triton X-100),1.25 U TaqDNA聚合酶,4种dNTPs各0.2 mM,0.4μM引物,2.0mM MgCl2,50 ng模板DNA。最佳扩增程序为:94℃预变性5 min,然后进行45个循环:94℃变性45s,52℃~55℃复性45s,72℃延伸90s,循环结束后72℃延伸7min。     

利用正交设计优化茶树ISSR反应体系

为优化茶树ISSR分子标记反应体系,对影响茶树ISSR反应较大的Mg2+浓度、dNTP浓度、模板DNA浓度、TaqDNA聚合酶浓度、引物浓度5个因素在4水平上进行优化试验,建立了适合于茶树ISSR-PCR(Inter Simple Sequence Repeats-Polymerase Chain Reaction)的最佳体系:20μL反应体系中,TaqDNA聚合酶0.75U/μL,10×buffer(含Mg2+)2.0mmol·L-1,模板DNA20ng,dNTP0.1mmol·L-1,引物0.3μmol·L-1。反应程序为:94℃预变性5min,94℃变性1min,50～60℃退火40s,72℃延伸90s,34次循环,72℃延伸7min,4℃保存。     

樟树ISSR-PCR反应体系优化研究

以樟树基因组DNA为材料,分析了影响樟树ISSR-PCR的主要参数,确立了适用于樟树的ISSR反应体系和扩增条件。结果表明获得清晰、重复性高的樟树ISSR-PCR扩增条件为:20μL PCR反应体积中,1×PCR Buffer(10 mmol.L-1Tris.HCl,pH8.3,50 mmo.lL-1KCl),2.0 mmo.lL-1MgCl2,200μmol.L-1dNTPs,50 ng模板DNA,200 nmo.lL-1引物,0.5 UTaq DNA聚合酶。在扩增过程中,引物的适宜退火温度比其Tm值平均高3℃。这为今后利用ISSR标记技术开展樟树种间遗传多样性分析提供参考。     

杉木 SRAP-PCR 反应体系优化与建立

采用L16（45）正交实验设计,对杉木SRAP-PCR反应体系中Mg^2＋、 dNTPs、 Taq DNA聚合酶用量、引物浓度及模板DNA用量等5个因素进行了优化,并确立了适宜杉木的最佳SRAP-PCR反应体系。杉木的SRAP-PCR最佳反应体系为：反应体系总体积为25μL,含2.0 mmol／L Mg^2＋、0.3 mmol／L dNTPs 、0.3μmol／L引物,1.0 U Taq DNA聚合酶、50 ng模板DNA及1×PCR buffer。各因素对杉木基因组DNA SRAP-PCR扩增结果的影响程度不同,其中dNTPs浓度影响最大, Mg^2＋浓度的影响最小。运用杉木单株基因组DNA对优化SRAP-PCR反应体系进行验证,均获得多态性丰富、条带清晰的扩增图谱,表明所确立的杉木SRAP-PCR反应体系稳定可靠。     

杠柳ISSR引物的筛选及PCR反应体系的优化

为建立适用于杠柳ISSR分子标记研究的扩增体系,进一步利用ISSR标记研究杠柳遗传多样性,探讨了杠柳ISSR分子标记中的各影响因素,分别对河北11个不同地区杠柳基因组DNA进行PCR扩增,在Taq MasterMix(康为世纪)基础上对影响ISSR-PCR扩增结果的模板DNA浓度、循环次数、引物退火温度进行梯度筛选。结果表明:在100条通用引物中共筛选出34条扩增条带清晰、整齐的ISSR引物;确立了适合杠柳ISSR分子标记的反应体系:总反应体积25μL,其中Taq MasterMix(含DNA聚合酶、MgCl_2、dNTPs、反应缓冲液以及稳定剂)12.5μL,模板DNA 1μL(70ng/μL),正向引物和反向引物各1μL(10μmol/L)。该体系的确立为今后利用ISSR技术对杠柳种质资源的遗传多样性分析奠定了技术基础。     

南方红豆杉ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以南方红豆杉DNA为模板,采用正交试验设计对影响南方红豆杉ISSR-PCR扩增的参数进行了优化。结果表明较佳的南方红豆杉ISSR-PCR的反应体系(20μL)为模板DNA 60 ng,10×PCR buffer 2.0μL,25 mmol/L的MgCl21.0μL,2.5 mmol/L的dNTPs 1.0μL,10μmol/L的引物1.0μL和反应酶0.2 U。适宜的扩增条件为94℃预变性4 min,41个PCR循环(94℃变性30 s,54.5℃退火45 s),72℃延伸80 s,72℃延伸5 min,4℃保存。     

狗牙根ISSR—PCR反应体系的建立与优化

以改良的CTAB法提取的狗牙根叶片DNA为模板,采用单因素多水平方法对狗牙根ISSR反应体系进行构建和优化,系统分析Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物和buffer这6种1SSR反应成分的浓度对扩增结果的影响,结果表明:20.0μL PCR反应体积中,20.0 ng模板DNA,0.4 μmol/L引物,0.5mmol/L Mg2+,0.05mmol/L dNTPs,0.2U TaqDNA聚合酶,2.0 μL 10×buffer.反应程序为;94℃预变性5 min;94℃变性45 s,55 C退火45 s,72℃延伸1.5 min,35个循环;再72℃延伸7 min,4℃保温.     

短柄ISSR-PCR反应体系的优化

以短柄(Quercus glanduliferavar.brevipetiolata)的DNA为材料,对影响PCR扩增效果的一些因素诸如模板DNA用量、Taq酶的用量、镁离子浓度、dNTP的浓度、引物用量和牛血清白蛋白浓度等指标进行筛选和优化。结果显示适合短柄ISSR-PCR分析最适宜的PCR反应条件为:10μL PCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol.L-1Tris-HCl,pH9.0,50 mmol.L-1KCl,0.1%Triton X-100),0.75UTaq DNA聚合酶,2 mmol.L-1MgCl2,0.2 mmol.L-14×dNTP,12 pmol引物,10 ng模板DNA,2 mg.mL-1牛血清白蛋白。短柄ISSR扩增较适宜的退火温度为54.4℃。     

红楠ISSR-PCR反应体系的建立和优化

为建立稳定的红楠ISSR-PCR最佳反应体系,在探索红楠基因组DNA提取的基础上,利用单因子试验和正交试验设计对反应体系进行优化。首先采用单因子试验对Mg²⁺、引物、模板DNA、dNTPs的不同浓度水平进行优化,找出ISSR-PCR反应各因素的最佳浓度;同时为进一步增加结果的可靠性,采用正交试验设计方法 对Mg²⁺、引物、模板DNA、dNTPs 4个因素3个浓度水平进行优化和筛选。综合两种试验方法结果,最终获得了红楠ISSR-PCR最佳反应体系:反应体系为20 μL,Taq酶0.05 U·μL^-1,Mg²⁺ 2.0 mmol·L^-1,模板DNA 1 ng·L^-1,dNTPs 0.3 mmol·L^-1,引物(835) 0.5 μmol·L^-1,1×PCR缓冲液。建立重复性好、稳定性优良的ISSR-PCR反应体系,为下一步红楠群体遗传结构和遗传变异研究提供了技术支持。     

云南河谷构树的遗传多样性研究

以云南省境内金沙江、元江、红河和怒江流域自然分布的构树为试材,采用AFLP分子标记技术对90份构树种质资源进行了遗传多样性分析研究.结果表明:筛选出的7对引物组合共扩增获得786条清晰可辩的条带,其中,多态性带632条,多态性条带百分率达80.4％,平均每对引物组合检测出90.3个多态位点.分布于4条水系流域的构树居群间,金沙江流域构树居群的遗传多样性水平最高,Nei's基因多样性指数为0.145 5,而元江流域构树居群的遗传多样性水平最低,Nei's基因多样性指数为0.1129.4个构树居群间的遗传分化系数为0.038 6,表明构树的遗传变异主要存在于居群内不同个体之间.在遗传距离为0.003时,4个构树居群可分为2组,第1组由金沙江流域的构树居群构成,第2组包含分布于红河、怒江和元江流域的3个构树居群.     

油茶SRAP-PCR反应体系的优化

Camellia oleifera is one of the important oil tree species in south China, and C. oleifera industry is quickly developed with the support of the national policies in recent years. The disorder of C. oleifera varieties is one of the key issues restricting the development of C. oleifera industry. Because of high polymorphism, good repeatability, less use of DNA and so on, SRAP as a new marker was used in identification of cultivars, analysis of genetic resources and genetic diversity in recent years. In this paper, the orthogonal design was used to optimize SRAP-PCR system for C. oleifera by 5 factors (Mg²⁺, dNTPs, primer, Taq polymerase, DNA template) and 4 levels, respectively. The data were analyzed by software SPSS V13.0. A suitable SRAP-PCR system (20 μL) was established as: 75 ng DNA template, 1.5 mmol·L^-1 Mg²⁺, 0.15 mmol·L^-1 dNTPs, 1U Taq DNA polymerase, 0.4 μmol·L^-1 primer, 1×PCR buffer. The result of optimal SRAP-PCR system will provide a foundation for the identification of C. oleifera cultivars.     

红椿SSR-PCR体系建立和多态性引物筛选

[目的]本研究旨在建立红椿SSR-PCR最佳反应体系,并筛选适于红椿SSR分析的高多态性引物。[方法]通过L16(45)正交试验设计,确立红椿SSR-PCR最佳反应体系;利用优化后的体系对来自楝科植物的135对SSR引物,在6个不同的红椿居群中进行扩增,筛出能有效扩增的引物并进一步筛选出适于红椿的高多态性引物。[结果](1)10μL基于荧光d UTP的SSR-PCR体系中包含:10×buffer 1.0μL,Taq酶(5 U·μL-1)0.1μL,Mg Cl2(25mmol·L-1)0.8μL,d NTP(200 mmol·L-1)0.025μL,荧光d UTP(1 nmol·μL-1)0.01μL,引物(10 mmol·L-1)0.8μL,DNA模板45 ng剩余用dd H2O补足;(2)筛选出29对能有效扩增的引物,复选后获得了12对适于红椿SSR分析的高多态性引物。[结论]建立了SSR-PCR最佳反应体系并筛选出高多态性引物,为红椿的分子标记等遗传学研究提供了基础。     

鹅掌楸Genomic-SSR反应体系优化

The optimization of the Genomic-SSR reaction system is a basic protocol when the Genomic-SSR is used for genetic analysis in Liriodendron. The concentrations of Mg²⁺, dNTP, Primer and rTaq were tested by L₉(3⁴) orthogonal experiment and single factor gradient experiment to gain the optimal reaction system. The results indicated that the optimal reaction system should contain 75 ng of genomic DNA, 1 μL of 10×buffer, 0.4 μL of 10 mmol·L^-1 dNTP, 0.75 μL of 2.5 mmol·L^-1 MgCl₂, 0.25μL of 10 μmol·L^-1 Primer, 0.05 μL of 5 U rTaq and final volume of 10μL. Repeated trials and two verification tests showed that this optimal reaction system was stable, reliable, efficient and suitable for the applications of Genomic-SSR in Liriodendron population genetics and quantitative genetics research.     

漾濞泡核桃ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以漾濞泡核桃优株为研究对象,研究其ISSR-PCR反应体系中的5个影响因子(模板DNA浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度)对PCR扩增效果的影响,从而建立起漾濞泡核桃的最佳ISSR-PCR反应体系。结果表明:模板DNA最佳浓度为50 ng/(25μL),Taq聚合酶浓度为0.75U/(25μL),引物浓度为0.7mmol/L,dNTPs浓度为0.20mmol/L,Mg2+浓度为2.0mmol/L,利用该最佳体系对试验中所选取的样本进行扩增反应。建立了适宜于漾濞泡核桃的ISSR-PCR扩增的最佳体系,该体系的建立为利用ISSR分子标记技术对漾濞泡核桃进行种质资源研究奠定了基础。     

香樟ISSR-PCR反应体系的正交优化

应用L9(34)正交表建立了适合于樟树ISSR-PCR的优化反应体系,即20μL ISSR反应体系中含有1×PCR buffer、dNTP0.25 mmol/L、引物0.3μmol/L、Mg2 2.0 mmol/L、Taq酶1 U和模板DNA50 ng.适宜的扩增条件为:94℃预变性4 min;94℃变性40 s,58℃退火1 min,72℃延伸2 min,42个循环;72℃延伸10 min;4℃保存.     

山茶ISSR扩增条件的优化

以山茶基因组DNA为材料,测试山茶ISSR扩增的最适退火温度,并采用单因素试验,测试了模板DNA量,Mg2+浓度,dNTP浓度,BSA浓度,引物用量,Taq酶用量等6个因素对山茶ISSR扩增的影响。结果显示:山茶ISSR扩增的最适退火温度为56.3℃;适宜的扩增体系为:10μL PCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol.L-1Tris.HCl pH 9.0,50mmol.L-1KCl,0.1%Triton X-100),2 mmol.L-1MgCl2,0.6 mmol.L-14×dNTP,2 mg.ml-1BSA,16 ng模板DNA,10 pmol引物,0.5 U Taq酶。