厚壳贻贝抗菌肽mytilin和myticin真核表达载体构建及表达的初步分析

[目的]研究厚壳贻贝抗菌肽mytilin和myticin真核表达载体构建及表达。[方法]通过对前期所获得的厚壳贻贝多条mytilin和myticin抗菌肽基因进行筛选,选择其中5条厚壳贻贝抗菌肽基因,采用PCR技术和DNA重组技术构建了相关的真核表达载体,并采用LiAC转化法将其转化到S78酿酒酵母中并进行初步表达分析。[结果]5种厚壳贻贝抗菌肽基因的真核表达载体构建成功,对转化酵母进行mRNA检测结果表明,5种厚壳贻贝抗菌肽的基因在S78酵母中成功转录。[结论]该研究结果为最终采取基因工程手段表达厚壳贻贝抗菌肽mytilin和myticin并在此基础上开展厚壳贻贝抗菌肽的后续研究奠定基础。     

抗菌肽Defensin基因pcr3.1真核表达载体的构建

通过克隆果蝇的defensin基因,构建了defeBSin基因的哺乳动物细胞真核表达栽体.把黑腹果蝇基因组DNA通过PCR获得defensin,克隆载体pMD18-T/defeBSin,并将其转化到大肠杆菌里.最后进行抗菌肽基因重组真核表达载体pcr3.1/defensin的构建和鉴定.结果表明,以果蝇总DNA为模板扩增出280bp左右的特异性条带,测序结果与GeneBank测序结果相比,除一个碱基外,其余的完全一致,译成的氨基酸序列相同.对重组质粒pcr3.1/defensin进行双酶切鉴定并测序.结果也完全一致.所以,重组质粒per3.1/defensin由真核载体pcr3.1和defensin DNA片段组成.且插入的defensin DNA片段与已知序列完全相同.     

厚壳贻贝低温无水保活技术

[目的]探索厚壳贻贝低温无水保活技术。[方法]以低温驯化后的厚壳贻贝为研究对象,进行了以低温保活技术为主的研究。在不同湿度条件下,对厚壳贻贝在0、4、8℃以及常温条件下的保活效果进行了大量的试验。[结果]成活率为98%时,在-1.5~-0.5℃下可保活9 d,在4和0℃下都可保活7 d,8℃可保活4 d。在生态冰温-1.5~-0.5℃下保活最好;用冰藏0℃的方法最实用。同时,控制湿度对厚壳贻贝保活效果有正面的影响。[结论]低温无水法保活厚壳贻贝技术具有成本较低、无污染等优点。     

猪PR39 真核表达载体构建

为构建猪源抗菌肽PR39的高效表达真核载体pVAX1-PR39,通过猪股骨骨髓组织基因组RNA合成c DNA,根据PR39基因全长序列,设计高效表达启动子,利用PCR扩增获得PR39全长基因,连接到真核载体pVAX1,构建重组载体pVAX1-PR39。转化大肠杆菌DH5α后进行菌落PCR鉴定和测序,测序结果与NCBI网站上猪源抗菌肽PR39基因序列完全一致,表明已成功构建了猪PR39的真核表达载体,理论上所构建的PR39表达载体能够提高猪的免疫能力。     

厚壳贻贝的钙化和呼吸对海洋酸化的响应

模拟了未来海洋酸化环境,采用碱度异常技术(Alkalinity anomaly technique)对生活在酸化海水中的厚壳贻贝的钙化率和呼吸率进行了测定。结果表明,厚壳贻贝的钙化和呼吸活动在酸化环境中发生显著变化,随着酸性程度的增加而骤降。当海水p H为7.80时,钙化率下降约43%,随后在p H 7.20时降至0。当海水酸碱度趋于中性时,呼吸率和耗氧率分别下降23.5%和11.0%,此时呼吸熵也明显变化。这些变化对厚壳贻贝而言是一个潜在的致命威胁。     

温度和盐度对厚壳贻贝耗氧率的影响

采用实验生态学方法研究了温度和盐度对厚壳贻贝耗氧率（OR）的影响。根据厚壳贻贝的个体大小分为A、B、C 3组（壳长分别为5.72±0.18、7.12±0.14、8.40±0.19 cm,软体部干重分别为5.75±0.62、10.83±1.23、12.58±2.05 g）,温度设10℃、16℃、22℃、28℃、34℃5个梯度,盐度设14、19、24、29、34共5个梯度。结果表明：（1）温度、个体大小对厚壳贻贝的耗氧率有显著影响（F〉F0.01）,而温度和体重的交互作用对厚壳贻贝的耗氧率无显著影响（FF0.01）。盐度在14~29时,3组厚壳贻贝的耗氧率随盐度的升高而逐渐增加,当盐度升至34时耗氧率下降。厚壳贻贝单位耗氧率（ORS）与软体部干重（W）的关系可用回归方程表示为ORS=a2W-b2,a2值为0.533 9~1.487 3,平均值为0.971 6;b2值为0.307 8~0.566 9,平均值为0.431 7。     

黄鳝抗菌肽hepcidin基因大肠杆菌表达载体的构建

[目的]构建黄鳝抗菌肽hepcidin基因大肠杆菌表达载体。[方法]根据Genbank中黄鳝hepcidin基因序列设计引物进行PCR扩增,将测序正确的基因片段连接入载体pET-28a中。[结果]以黄鳝cDNA为模板,扩增出hepcidin基因片段,长度为291 bp,连接到pET-28a上。经PCR扩增、双酶切验证,证实成功构建原核表达载体。[结论]成功构建了黄鳝hepcidin基因大肠杆菌表达载体。     

杂合抗菌肽基因的设计及表达载体的构建

为高效表达具有高抗菌活性的抗菌肽,根据Magainin 2(MA)、Sapecin(SA)和Melittin (ME)基因核心序列,设计杂合抗茵肽MA-SA-ME(MSM)基因并进行密码子优化.生物信息学分析显示,该抗茵肽具有很好的抗茵作用.将MSM基因与毕赤酵母表达载体pPICZQ-A连接,构建重组表达载体pPICZ...     

重组抗菌肽LfcinB/LfampinB基因的克隆及表达载体的构建

根据GeneBank中提供的牛乳铁蛋白基因序列,设计并合成了重组LfcinB/LfampinB基因,并通过PGEM-Teasy载体扩增。酶切回收的LfcinB/LfampinB片段与中间载体pP6连接。pP6上的启动子、信号肽和调控序列与LfcinB/LfampinB共同切下,获得具有上游调控元件的PLfc/Lfa基因片段。将PLfc/Lfa与pME290表达载体连接,并转化绿脓杆菌。结果表明,本试验成功构建了重组pPLfc/Lfa表达载体。     

抗菌肽MagaininⅡ基因穿梭表达载体的构建

采用SOE法人工设计并合成抗菌肽MagaininⅡ基因。按正确的阅读框架定向克隆至高效穿梭表达载体pPICZαA上,经PCR鉴定及序列分析,所转化的大肠杆菌JM109菌落中含有插入MagaininⅡ基因的重组质粒pPICZαA-Mag,结果表明成功构建了抗菌肽MagaininⅡ基因穿梭表达载体pPICZαA-Mag。     

三种鸭防御素真核表达载体的构建及其表达分析

为研究鸭防御素的真核表达,人工合成了鸭防御素AvBD2、AvBD10和AvBD12基因,并将其插入到真核表达质粒pDoubleEx-EGFP-flag-N中构建重组表达质粒;重组表达质粒经酶切鉴定正确后,分别转染HEK293细胞进行表达,用RT-PCR和Westem-blot鉴定目的基因的表达情况。结果表明,酶切鉴定证实目的基因成功插入到真核表达质粒中;真核表达质粒转染HEK293细胞24 h后,在荧光显微镜下可见绿荧光蛋白表达;RT-PCR能检测到目的基因mRNA,但Western-blot没有检测到目的蛋白的表达条带。     

厚壳贻贝胚胎发育观察

[目的]研究厚壳贻贝的胚胎发育情况。[方法]选择性腺成熟的厚壳贻贝亲贝,通过催产受精,对厚壳贻贝受精、卵裂、幼体发育等细胞生物学现象用显微镜进行连续观察,经显微摄影,详细记录了厚壳贻贝的胚胎发育全过程。[结果]厚壳贻贝亲贝经阴干刺激,排出精卵,获得成熟受精卵,直径约75μm,在水温13~20℃的条件下,受精卵分裂,经过桑椹期、囊胚期、原肠期、担轮幼虫、D形幼虫、壳顶幼虫、匍匐幼虫等阶段,最后变成附着稚贝,其胚胎发育的全过程历时35 d。[结论]厚壳贻贝亲贝暂养温度要适当,一般在10℃左右。厚壳贻贝胚胎发育的时间与水温密切相关,其适宜温度为13~20℃,并由受精卵开始发育时相对较低的温度逐步升高。     

厚壳贻贝人工育苗关键技术探讨

从壳顶幼虫培育、匍匐幼虫培育、附着基选择及投放、稚贝培育等方面探讨了厚壳贻贝人工育苗中的关键技术,以期为厚壳贻贝的人工育苗提供技术参考。     

东极厚壳贻贝养殖群体表型性状的相关与通径分析

[目的]为厚壳贻贝的选育工作提供理论指导.[方法]选取浙江省舟山市东极养殖区的厚壳贻贝作为研究对象,分别测量壳长(SL)、壳宽(SW)、壳高(SH)等10个形态性状以及总体重(GW)、壳重(KW)和软体重(RW)这3个重量性状,采用相关分析、多元回归分析和通径分析等方法探讨了形态性状对重量性状的影响.[结果]所测的表型性状之间均达到显著相关(P＜0.05),相关系数为0.233 ～ 0.975.建立了形态性状与总体重、壳重和软体重的回归方程,分别为GW=-34.511+ 10.058SH +5.844SW +2.121OC (R2=0.771);KW=-8.209+ 4.482SH+ 2.082SW (R2=0.771);RW=-9.549+ 2.274SH+1.648SW+1.025CD(R2=0.625).[结论]东极养殖区厚壳贻贝的人工选育可以壳高为选择目标,重视对壳宽的协同选择.     

微小隐孢子虫miR-2980真核表达载体的构建及初步鉴定(英文)

[目的]构建微小隐孢子虫miR-2980真核表达载体,并进行鉴定。[方法]从微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)基因组DNA扩增cp-miR-2980前体,克隆到pMD18-T载体上,经测序鉴定正确后亚克隆到pVAX1载体上,转染HCT-8细胞,提取细胞总RNA,RT-PCR检测cp-miR-2980的表达。[结果]成功地构建了cp-miR-2980真核表达载体pVAX-miR2980,RT-PCR检测证实其能在真核细胞HCT-8中表达。[结论]构建的真核表达载体pVAX-miR2980能在HCT-8细胞中成功表达cp-miR-2980,为后续研究cp-miR-2980的功能打下了基础。     

微小隐孢子虫miR-2980真核表达载体的构建及初步鉴定

[目的]构建微小隐孢子虫的miR-2980真核表达载体,并进行鉴定。[方法]从微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)基因组DNA扩增cp-miR-2980前体,克隆到pMD18-T载体上,经测序鉴定正确后亚克隆到pVAXⅠ载体上,转染HCT-8细胞,提取细胞总RNA,RT-PCR检测cp-miR-2980的表达。[结果]成功构建了cp-miR-2980真核表达载体pVAX-miR2980,RT-PCR检测证实其能在真核细胞HCT-8中表达。[结论]构建的真核表达载体pVAX-miR2980能在HCT-8细胞中成功表达cp-miR-2980,为后续研究cp-miR-2980的功能奠定了基础。     

籽鹅FSH真核表达载体的构建及表达

为了构建真核表达载体pEGFP-FSH-C2-α和pEGFP-FSH-C2-β,并检测其在籽鹅颗粒细胞中的瞬时表达。利用PCR技术合成籽鹅FSH全基因后,构建促卵泡素α、β亚基真核表达载体,并转染籽鹅卵泡颗粒细胞。结果表明:基因片段已正确插入真核表达载体,同时在颗粒细胞中检测到pEGFP-FSH-C2-α和pEGFP-FSH-C2-β的融合蛋白表达。说明已构建真核表达载体pEGFP-FSH-C2-α和pEGFP-FSH-C2-β,并在颗粒细胞瞬时表达成功,为研究和开发生物制剂奠定基础。     

猪pGH基因真核表达载体的构建及其表达

从120日龄的长白猪脑垂体组织中扩增出pGH基因的cDNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-N1真核表达载体上,构建pEGFP-N1-pGH重组质粒。通过PCR扩增、酶切电泳分析和测序的方法对重组DNA进行鉴定,并将其转染PK15细胞,通过荧光素酶活性检测特异性表达强度.结果表明,成功构建了pEGFP-N1-pGH真核表达载体,为转基因猪的研究奠定了基础。