一株酸马奶乳酸菌分子生物学鉴定及降解胆固醇试验研究

从新疆伊犁农牧民传统发酵的酸马奶中分离筛选到呈革兰氏染色阳性,秆状,编号为H-1的菌株.通过对此菌株进行形态观察和普通生理分析,并测定该菌株降解胆固醇的活力,通过16S r DNA序列分析表明,分离菌株H-1与Lactobacillus casei具有100;相似性,说明此菌株即为干酪乳杆菌.使用ClustalX1.8程序和Mega2程序将该菌株与报道的相关乳酸菌进行系统发育分析,揭示了16S r DNA序列分析在菌株鉴定的正确性.     

重组毛囊特异性表达载体的构建与验证

[目的]构建毛囊特异性表达绵羊毛角蛋白Ⅱ型中间丝9（KIF Ⅱ-9）cDNA的毛囊特异性表达载体,并证明其表达的有效性。[方法]根据绵羊毛角蛋白关联蛋白6-1（KAP6-1）基因已知DNA序列设计合成2个特异性引物,以绵羊基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到KAP6-15’调控序列,然后与毛角蛋白Ⅱ型中间丝基因（KIFII-9）cDNA、去除CMV启动子的表达载体pcDNA3.1连接构成皮肤特异性表达载体pcDNA3.1-KK,新生小鼠皮下注射该重组载体证明其表达有效性。[结果]PCR扩增出1042 bp的特异性片段,DNA测序结果证明,该克隆片段与KAP6-1 5’端调控区序列相比具有极高的一致性;构建的毛囊特异性表达载体PCDNA3.1-KK,皮下注射新生小鼠,皮肤内KIF Ⅱ-9得到转录。[结论]该试验构建的载体PCDNA3.1-KK具有表达特异性。     

猪乙脑病毒河南分离株CSF.ZMD-3的分离鉴定及分子进化分析

采集河南省规模化猪场流产母猪死胎脑脊液作为样本,通过细胞盲传培养分离乙型脑炎病毒流行毒株,对新分离的病毒进行分子生物学鉴定,获得1株分离株并命名为CSF.ZMD-3。DNA序列测定及比对分析该分离株与已报道毒株基因的序列同源性,确定该分离毒株为乙脑病毒。使用MEGA3.1软件对CSF.ZMD-3毒株主要结构蛋白E蛋白的基因序列进行分子进化分析,确定CSF.ZMD-3为基因Ⅲ型乙脑病毒。     

抗菌肽Defensin基因pcr3.1真核表达载体的构建

通过克隆果蝇的defensin基因,构建了defeBSin基因的哺乳动物细胞真核表达栽体.把黑腹果蝇基因组DNA通过PCR获得defensin,克隆载体pMD18-T/defeBSin,并将其转化到大肠杆菌里.最后进行抗菌肽基因重组真核表达载体pcr3.1/defensin的构建和鉴定.结果表明,以果蝇总DNA为模板扩增出280bp左右的特异性条带,测序结果与GeneBank测序结果相比,除一个碱基外,其余的完全一致,译成的氨基酸序列相同.对重组质粒pcr3.1/defensin进行双酶切鉴定并测序.结果也完全一致.所以,重组质粒per3.1/defensin由真核载体pcr3.1和defensin DNA片段组成.且插入的defensin DNA片段与已知序列完全相同.     

中国野桑蚕DH-PBAN基因克隆研究初报

根据家蚕(Bombyx mori)滞育激素-性信息素合成激活肽(DH-PBAN)基因的DNA序列设计引物,以中国野桑蚕(Bombyx mandarina China)基因组DNA为模板进行PCR扩增.试验首先确立了比较稳定的从基因组扩增目的片段的扩增体系及程序,并用该扩增体系及程序克隆到中国野桑蚕DH,PBAN及DH-PBAN基因的第5内含子序列.试验还发现该基因第3内含子在家蚕和野桑蚕之间表现出多态性.     

中国野桑蚕DH-PBAN基因克隆研究初报

根据家蚕(Bombyx mori)滞育激素-性信息素合成激活肽(DH—PBAN)基因的DNA序列设计引物,以中国野桑蚕(Bombyx mandarina China)基因组DNA为模板进行PCR扩增。试验首先确立了比较稳定的从基因组扩增目的片段的扩增体系及程序,并用该扩增体系及程序克隆到中国野桑蚕DH,PBAN及DH—PBAN基因的第5内含子序列。试验还发现该基因第3内含子在家蚕和野桑蚕之间表现出多态性。     

海南普通野生稻Waxy基因的分离和序列分析

根据已报道的栽培稻Waxy基因序列设计引物,对海南普通野生稻Waxy基因的DNA序列和cDNA序列进行克隆和鉴定。获得Waxy基因编码区的DNA序列3 330 bp,cDNA序列1 860 bp,该基因编码区存在13个外显子和12个内含子,编码609个氨基酸残基。海南普通野生稻与其他水稻Waxy基因序列之间存在显著差异,并且主要体现在内含子上,推测其可能影响Waxy基因的转录水平。Waxy基因聚类分析表明,栽培稻与海南普通野生稻亲缘关系较近。     

玉米19kD醇溶蛋白启动子克隆与植物表达载体构建

从玉米自交系9801基因组DNA中克隆了玉米19 kD醇溶蛋白基因(ze19)启动子,将其连接到pMD18-T载体上.测序结果表明该序列与已报道序列同源性为94%,包含TATAbox、CAATbox启动子基本元件以及GCN4、skn-1、prolamin box、-300 element等参与调节玉米醇溶蛋白表达及活性...     

系统发生分析软件PAUP和TreePuzzle使用方法介绍

系统发生分析被广泛应用于研究不同生物DNA、蛋白质序列的进化关系。PAUP和TreePuzzle是目前使用较多的系统发生分析软件,但其使用方法较为复杂,不易被初学者掌握。从序列信息模块、序列参数模块、运算命令模块3个方面介绍了PAUP软件的使用方法,同时也对TreePuzzle软件的使用和进化树的编辑与注释方法做了简单介绍。     

河南省马铃薯Y病毒的分子检测与鉴定

利用RT-PCR技术对郑州市和信阳市的马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)进行了鉴定。依据PVY p1基因序列设计合成1对引物,以带毒的马铃薯叶片总RNA为模板,RT-PCR扩增得到0.58kb的目的DNA片段,而健康对照无此片段。对PCR产物进行序列测定,Blast分析表明,该DNA序列与PVY N:O株系p1基因序列相似性可达99%,证明所得DNA片段确为PVY p1基因,从而建立了PVY的RT-PCR检测方法。在此基础上,从节省检测时间、优化反应程序及反应体系等方面进行了改进。     

缓步动物条形码及7种缓步动物系统发育研究

缓步动物属于微小水生无脊椎动物,以隐生现象著称。该实验对4种缓步动物11个个体的COⅠ基因序列进行提取测定和分析,并与GenBank中下载的6种缓步动物19条COⅠ基因序列进行比对分析,用贝叶斯法（BI）构建系统发育树,研究了共计7种缓步动物30个个体之间的系统发育关系。研究发现,缓步动物在DNA分子层面的分类与形态学分类结果基本一致,表明COⅠ基因可用于研究缓步动物系统分类及系统发育方面的问题。     

山羊痘病毒P32基因重组真核表达载体的构建与鉴定

根据已发表的山羊痘病毒P32基因序列设计合成1对带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的引物,用PCR方法从分离的贵州山羊痘病毒LD毒株中扩增出含P32基因的DNA片段,纯化后,经BamHⅠ/HindⅢ双酶切,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),获得pcDNA3.1(+)-P32/LD重组载体。通过PCR、双酶切及测序鉴定,证实重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-P32/LD构建成功。     

猪圆环病毒2型ORF2基因在PcDNA3.1中的表达效果

[目的]构建猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)ORF2 DNA核酸疫苗,并评价其免疫效果和安全性.[方法]设计一对特异性引物,扩增PCV2-ORF2,利用T载体对其进行克隆,与真核表达载体PcDNA3.1在同等条件下进行双酶切,并进行连接,转化感受态细菌DH5a并克隆,经双酶切鉴定筛选...     

牛双芽巴贝斯虫新疆株HSP20基因的克隆和真核表达质粒的构建

通过设计牛双芽巴贝斯虫热休克蛋白HSP20基因序列的特异性引物,采用 PCR方法从疑似"牛焦虫病"的患牛全血基因组中扩增得到699 bp的HSP20基因,将其连入pMD18-T测序、鉴定,再将验证的699 bp的HSP20基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核载体PCDNA3.1-HSP20.经再次测序、鉴定后,尾静脉注射小白鼠进行HSP20基因的瞬时表达,取其肝脏提取总 RNA,经RT-PCR方法扩增出一条534 bp的目的条带,表明真核表达质粒构建成功.     

犬黑皮质素受体4真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达

[目的]构建犬黑皮质素受体4真核表达载体并在COS-7细胞中进行瞬间表达。[方法]以犬MC4R线性DNA为模板,进行引物设计,PCR特异性扩增,扩增产物连接到pMD18-T载体上,酶切鉴定后测序。将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)。重组体pcD-NA3.1(+)-MC4R经过酶切和测序鉴定。采用FuGENE HD介导转染技术将pcDNA3.1(+)-MC4R导入COS-7细胞,提取细胞内总RNA,RT-PCR扩增犬MC4R基因的全长cDNA编码序列。[结果]克隆犬MC4R基因的全长cDNA序列,并以pcDNA3.1(+)表达载体为骨架,构建真核表达载体,测序的扩增片段与GenBank公布的模板序列经Blast比对相似性为99%。采用G418筛选,获得带有pcDNA3.1(+)-MC4R的COS-7细胞。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1(+)-MC4R,重组体能在真核细胞中表达。     

福建栓菌多样性及分子系统学研究

在研究福建省福州市和闽南地区泉州市尧厦门市和漳州市木腐菌的过程中、获得6 种栓菌、共19 个样 品、此6 种栓菌在福州市均有发现、而云芝栓孔菌（Trametes versicolor）尧毛栓孔菌（T. hirsuta）和血红栓菌（T. sanguinea）是常见的种、至少在两个采样的地区均有出现。在总结前人对福建栓菌研究的基础上、从GenBank 里查找 到相关种已有的ITS 序列、并结合本研究中6 个种的19 条ITS 序列、通过PAUP 4.0尧MrModeltest尧MrBayes 和 Treeview 等软件进行系统发育学分析研究、结果发现17 个种的大部分种都可以形成自己独立的分支、但彼此间的关 系尚不明确。最后根据子实体的颜色和气味尧菌盖的特征尧孔口的形状尧数量和担孢子的大小等形态特征对目前已知 的福建的21 种栓菌进行了分类检索。     

半胱氨酸蛋白酶抑制剂的系统发生分析(英文)

[目的]对已知半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因编码蛋白的分子量、等电点、信号肽、结构域等进行分析。[方法]在NCBI中检索半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因,下载相应的氨基酸序列。采用SMART软件预测结构域,用SingalP程序查找信号肽,用TMHMM程序搜寻预测跨膜区。多序列比对采用CLUSTALW程序。运用MEGA3.1软件,采用Neighbor-joining法构建进化树。[结果]半胱氨酸蛋白酶抑制A(Homo sapiens)、半胱氨酸蛋白酶抑制M(H.sapiens)、半胱氨酸蛋白酶抑制F(H.sapiens)、半胱氨酸蛋白酶抑制(Mus musculus)、半胱氨酸蛋白酶抑制C(M.musculus)、半胱氨酸蛋白酶抑制F(Rattus norvegicus)、半胱氨酸蛋白酶抑制C(R.norvegicus)、半胱氨酸蛋白酶抑制S(R.norvegicus)、半胱氨酸蛋白酶抑制I(Zea mays)、半胱氨酸蛋白酶抑制(Brugia malayi)、半胱氨酸蛋白酶抑制(On-chocerca volvulus)和半胱氨酸蛋白酶抑制(Acanthocheilonema viteae)有信号肽,其余的半胱氨酸蛋白酶抑制基因没有信号肽,TMHMM程序搜寻结果显示,这些半胱氨酸蛋白酶抑制都没有跨膜区,均为胞外蛋白。SMART软件分析结果表明它们均含有1个高度保守的半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域。多序列比对结果表明半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因存在高度保守的QxVxG基序,意味着该基序可能对半胱氨酸蛋白酶抑制剂的抑制活性具有重要意义。系统进化分析可预示半胱氨酸蛋白酶抑制半胱氨酸蛋白酶活性在进化过程中可能也是保守的。[结论]该研究可为半胱氨酸蛋白酶抑制剂抑制半胱氨酸蛋白酶的功能研究方面提供理论参考。     

半胱氨酸蛋白酶抑制剂的系统发生分析

[目的]对已知半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因编码蛋白的分子量、等电点、信号肽、结构域等进行分析。[方法]在NCBI中检索半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因,下载相应的氨基酸序列。采用SMART软件预测结构域,用SingalP程序查找信号肽,用TMHMM程序搜寻预测跨膜区。多序列比对采用CLUSTALW程序。运用MEGA3.1软件,采用Neighbor-joining法构建进化树。[结果]多序列比对结果表明半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因存在高度保守的QxVxG基序,意味着该基序可能对半胱氨酸蛋白酶抑制剂的抑制活性具有重要意义。系统进化分析可预示半胱氨酸蛋白酶抑制半胱氨酸蛋白酶活性在进化过程中可能也是保守的。[结论]该研究可为半胱氨酸蛋白酶抑制剂抑制半胱氨酸蛋白酶的功能研究方面提供理论参考。     

类猪圆环病毒P1-ORF1真核表达质粒pcDNA 3.1(+)-ORF1的构建

为研究类猪圆环病毒P1-ORF1能否在真核细胞中表达,本文通过PCR技术扩增P1-ORF1基因,利用pcDNA3.1(+)载体构建重组质粒pcDNA3.1(+)-ORF1,通过lipofectamine 2000脂质体介导转染PK-15细胞以表达P1-ORF1基因,再通过RT-PCR及免疫组织化学技术从转录和蛋白质水平上鉴定该基因的表达。结果显示:从转染的细胞中提取总RNA,经Recombinant DNase I处理除去基因组DNA后,RT-PCR能够扩增出359 bp的目的片段;免疫组化分析显示:pcDNA3.1(+)-ORF1重组质粒样品能够与抗P1-ORF1多克隆抗体发生特异性反应。研究结果表明类猪圆环病毒P1-ORF1真核表达质粒pcDNA3.1(+)-ORF1构建成功,为进一步研究P1-ORF1蛋白的免疫学特性奠定基础。     

河川沙塘鳢线粒体细胞色素b(Cytb)基因序列分析

采用特异性引物PCR扩增获得了河川沙塘鳢细胞色素b基因序列,并与塘鳢科其余22种细胞色素b基因序列进行比对,运用Mega 3.1软件通过NJ法构建了塘鳢科鱼类系统发育树。结果显示:2尾试验鱼构成1支;Eleotris、Hypseleotri 2个属构成1支;Odontobutis、Perccottus glehni 2个属构成1支;Bostrychus、Butis、Oxyeleotris、Ophiocara 4个属构成1支;Ptereleotris heteroptera单独构成1支。该研究结果可为深入探讨沙塘鳢属及塘鳢科鱼类的系统分类与重新整理提供依据。