花青素合成调节基因Rosea1转化东方百合索邦的研究

以东方百合索邦无菌苗鳞片为受体材料,利用农杆菌介导法将花秦素合成调节基因Rosea1导入百合,并对遗传转化体系进行优化。结果表明,外植体经过1 d预培养、侵染液以及共培养基中均加入50μmol/L乙酰丁香酮(AS)、共培养基去除NH4NO3并将pH值调至5.5,共培养3 d,有利于提高遗传转化率。获得的部分抗性植株经PCR检测,扩增出特异条带,初步证明Rosea1基因已整合到索邦百合基因组DNA中。     

百合转P5CS-F129A基因的遗传稳定性和耐旱性检测

目的百合是世界上主要的商品花卉之一,具有很高的观赏价值和经济价值,然而目前的主栽东方百合品种耐旱和耐盐碱性较差,对其进行改良是提高百合价值的关键因素。方法对已获得的含抗逆相关基因P5CS-F129A的东方百合‘索邦’单拷贝转化株系L89和双拷贝株系L31进行了4年的组培继代培养和1年的温室栽培,检测了目的基因的稳定性和干旱胁迫处理下的表型和生理指标的变化。经Southern印迹杂交和cDNA检测显示目的基因能够稳定遗传。结果干旱胁迫处理结果表明:两个转基因株系叶片脯氨酸含量均高于普通‘索邦’,其中株系L31的脯氨酸水平最高;虽然干旱胁迫下两个转基因株系和普通‘索邦’叶片相对电导率均有所升高,但转基因株系叶片的相对电导率低于普通‘索邦’,重新灌水后,转基因株系恢复正常水平,普通‘索邦’未恢复;在表型性状等方面,经过胁迫并复水的株系L89和L31总体长势良好,两株系之间长势无显著差异,而普通‘索邦’叶片黄化严重,生长受阻。结论转P5CS-F129A基因植株具有更强的耐旱性和遗传稳定性,对抗逆性百合新品种的培育具有重要意义。      

索邦和西伯利亚百合的离体再生体系建立

【目的】确定索邦（Sorbonne）和西伯利亚（Siberia）百合的离体再生体系适合的诱导培养基、增 殖培养基、生根培养基以及最佳转化受体系统。【方法】选用索邦和西伯利亚百合的鳞茎球作为外植体,比较 它们在添加不同激素配比的培养基中的生长状况,得出两种百合诱导愈伤组织和不定芽、继代增殖、诱导生根 培养基和对卡那霉素敏感的最适条件。【结果】索邦百合最佳诱导培养基是 MS+2,4-D 1.5~2.0 mg/L,西伯利亚 百合最佳诱导培养基为 MS+2, 4-D 1.0~1.5 mg/L;两种百合的最佳继代增殖培养基均为 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L：两种百合的最佳生根培养基为 1/2MS+NAA 0.2 mg/L、1/2MS+IBA 0.2 mg/L;筛选转化植株时,质量浓度为 150 mg/L 的卡那霉素足以抑制非转化细胞或细菌的生长。【结论】为东方百合品种种球工厂化生产及遗传转化再 生体系充实理论依据。     

3种百合组培快繁体系的优化

为优化百合组培快繁体系,以东方百合‘索邦’、野生淡黄花百合及新铁炮百合‘雷山3号’为研究对象,采用组织培养技术,研究不同外植体诱导分化、组培苗继代增殖和鳞茎增大的最佳培养条件。结果表明:淡黄花百合种子萌发的适宜培养基为MS+0.01 mg/L NAA+60 g/L蔗糖;适宜‘索邦’、‘雷山3号’鳞片诱导不定芽的适宜培养基分别为MS+2.0 mg/L 6–BA+0.3 mg/L NAA和MS+0.5 mg/L 6–BA+0.2 mg/L NAA;适宜这3种百合组培苗增殖培养的培养基为MS+2.0 mg/L 6–BA+0.2 mg/L NAA;适宜‘索邦’无菌苗鳞茎增大的培养基为3MS+0.5 g/L AC+3.0 mg/L PP333+80 g/L蔗糖。     

优质观赏百合品种“索邦”愈伤组织培养研究

以观赏百合优质品种"索邦"鳞茎为材料进行愈伤组织培养研究,并成功获得再生植株。结果表明:最佳灭菌方法为75%乙醇30 s+0.1%Hg Cl215 min,污染率仅为30.00%;最佳再生培养基为1/2 MS+2.0 mg/L 2,4-D,平均再生苗数为10.3;再生苗最佳生根培养基为B5+0.10 mg/L NAA,平均生根数为22.7条。     

在质体中表达EPSPS赋予烟草草甘膦抗性

在烟草质体中应用来源于玉米的复合型顺式表达元件驱动来源于Isoptericola variabilis的新型耐草甘膦EPSPS基因AroA_(I.va*)的表达,使其在叶片及非绿色组织中同时高效表达。对获得的同质化质体转化植株进行转录及蛋白水平分子检测,结果表明:AroA_(I.va*)基因在转基因植株叶片及根部组织中均得到有效表达;达到同质化的烟草转基因植株pLSZ3#2和pLSZ3#3的T_0代种子可耐受高于12 mmol/L(2 000 mg/L)的草甘膦处理,在温室中培养的转基因植株可耐受1 800 mg/L剂量的草甘膦喷施处理。野生型与转基因植株的正反交实验证实通过质体转化获得的草甘膦抗性转基因植株具有母性遗传的特点。     

导入抗逆基因的转双抗虫基因741杨的获得

为培育更多抗非生物胁迫的转基因杨树,以转双抗虫基因741杨(P.alba×(P.davidaiana×P.sirnonii)×P.tomentosa)为材料,建立了叶片诱导的转双抗虫基因741杨的高频再生体系,并采用根癌农杆菌介导法,探索了影响其遗传转化效率的主要因子。结果表明:最佳不定芽诱导培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA;继代培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IBA,最佳生根培养基为1/2MS+0.05 mg/L IBA。对影响转化因子的研究结果表明,共培养时间为3 d时,不定芽诱导率最高;共培养培养基加入乙酰丁香酮、pH值调到5.2时,诱导潮霉素抗性芽效果最显著;最佳潮霉素筛选质量浓度为3 mg/L;将抗逆基因AtNDPK2通过农杆菌导入到转基因741杨中,经PCR检测,在抗性植株DNA中扩增出与目的基因大小相同的片断,初步确认目的基因已经整合到转基因741毛白杨基因组中。     

MdSPDS1基因导入毛白杨的遗传转化体系优化研究

为了建立农杆菌介导的高效毛白杨遗传转化体系,并大量获得转MdSPDS1基因的转基因毛白杨,对MdSPDS1基因导入毛白杨的遗传转化体系中关键转化因子进行了优化。获得的优化转化体系如下:叶片预培养3d后,用OD600为0.4的菌液侵染7min,再共培养3d。卡那霉素抗性芽的二次筛选中,卡那霉素的选择压分别为20和50mg/L。实验获得毛白杨卡那霉素抗性植株共43株,经PCR检测,其中9株呈阳性,占抗性植株总数的20.9%,优化转化系统的阳性植株转化率达到9.38%。本研究为下一步鉴定基因功能和转基因植株耐盐性的分析奠定了基础。     

农杆菌介导遗传转化获得转CP4基因籼稻的研究

  目的  建立籼稻‘中恢161’Oryza sativa subsp. indica ‘Zhonghui 161’农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导的转化体系。  方法  以籼稻‘中恢161’的成熟胚为材料,设置了5个草甘膦质量浓度(100、200、300、400和500 mg·L?1)进行胚性愈伤组织的草甘膦敏感性试验。利用农杆菌介导法,将草甘膦抗性基因CP4-EPSPS导入‘中恢161’的胚性愈伤组织中,转化后的胚性愈伤组织分别在含有300、350和400 mg·L?1草甘膦的选择培养基上进行抗性筛选。抗性愈伤组织进一步分化、成苗。  结果  草甘膦质量浓度为300~400 mg·L?1时,愈伤组织褐化率约50%,具有很好的选择效果。经统计,300、350和400 mg·L?1草甘膦抗性筛选后,愈伤组织阳性率分别为40.16%、61.72%和84.04%,抗性愈伤组织的分化率为46.43%,成苗率为32.84%。共获得67株再生小苗,经PCR检测,43株成功转入CP4基因,再生植株阳性率为64.18%。  结论  建立了‘中恢161’农杆菌介导的转化体系。图5参20     

农杆菌介导的2mG_2-epsps基因转化玉米自交系18-599R幼胚的研究

【目的】对农杆菌介导的抗草甘膦新基因2 mG2-epsps转化玉米18-599R幼胚的体系进行优化,以获得具有明显草甘膦抗性的转基因植株。【方法】以玉米18-599R幼胚为受体,采用农杆菌介导法,对转化时的预处理条件、菌液浓度×浸染时间、草甘膦筛选浓度设置处理,以优化转化体系;并用PCR、实时荧光定量PCR和喷洒草甘膦鉴定外源基因在转基因植株中的表达情况。【结果】热激处理对抗性愈伤率没有明显的提高作用,离心处理会降低抗性愈伤率;菌液浓度为OD600=0.6,浸染时间为10 min时,平均抗性愈伤率最高,为37.33%;草甘膦浓度为2.0mmol/L是比较理想的筛选浓度;实验共得到46株再生植株,5株PCR检测呈阳性,阳性率为10.87%;实时荧光定量PCR表明外源基因在T2代植株的根、茎、叶中均有表达;对T2代转基因植株喷洒1.5g/L的草甘膦,表现出耐受性。【结论】实验成功将2 mG2-epsps导入18-599R基因组,并获得了明显的草甘膦抗性。     

农杆菌介导的百合ACO反义基因遗传转化的研究

以东方百合‘索邦’(Liliumoriental‘Sorbonne’)无菌苗鳞茎、鳞片叶及愈伤组织为外植体,通过EHA105和GV3101两种根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株介导,将ACO反义基因导入东方百合"索邦"。结果表明,愈伤组织预培养7 d,侵染30 min,EHA105菌液浓度OD=0.8,共培养5 d,可获得7.14%的转化率。经GUS、PCR、PCR-Southern及基于梯状胶回收的PCR法检测证明ACO反义基因已转入转化植株基因组中。     

Regular Production of Transgenic Wheat Mediated by Agrobacterium tumefaciens

Wheat is the number one crop both in acreage and total yield in the world. Therefore, it is very important to improve wheat by gene engineering techniques even though it belongs to the plants insensitive to gene transformation, especially to Agrobacterium-mediated transformation. Wheat immature embryos of 1.0-1.5mm in size, C58c1 of Agrobacterium strain harboring pPTN249, pPTN270, pPTN254, and pSIS-GFP respectively (all the vectors contain the aphA selectable gene driven by enhanced 35S promoter and a target gene controlled by ubi promoter or E35S promoter), AB medium for Agrobacterium activate culture, WCC medium for co-culture, were used in this study. The embryos with 4 days of pre-culture were transferred onto selection medium with 10mg/L geneticin, 50mg/L ticarcillin, 50mg/L vancomycin, and 50mg/L cefotaxine after 30 minutes of infection and 2 days of co-cultivation with Agrobacterium. Followed callus production,shoot regeneration on selection medium, 114 resistant plantlets were obtained from 10 transformation experiments of four genotypes. By nptⅡ ELISA (nptⅡ enzyme assay), PCR, Southern blot and leaf bleach,29 positive plants were identified from two genotypes of Bobwhite and Yanglmai 10, with an average transformation efficiency of 0.82 %. The result tested by Southern blot also showed that the transgenic plants with single- copy integration of target gene took 65.52% among total positive plants. The ELISA value of transgenic plant was also related to the copies of alien DNA integrating into wheat chromosomes, the transgenic plants with single copy integration giving higher ELISA value than the ones with 2 or 3 copies integration.     

通过农杆菌介导法将口蹄疫结构蛋白全长基因P1导入大豆的研究

本研究以大豆体细胞胚为受体。用农杆菌介导法将口蹄疫病毒结构蛋白全长基因P1导入大豆基因组中．获得了抗性植株。经GUS染色、PCR及PCR-southern杂交等分子检测。证明目的基因已导入并整合到大豆基因组中。为利用大豆作为生物反应器生产口蹄疫新型口服疫苗奠定了基础。     

冬小麦遗传再生体系及根癌农杆菌介导的转化研究

以临优145的幼胚为外植体诱导植株再生,并进行农杆菌转化研究.以冬小麦品种临优145的幼胚为外植体,消毒后用解剖刀挑取幼胚,盾片朝上接种于MS+2,4-D 2 mg/L+肌醇100 mg/L+MES 400 mg/L+CH 100 mg/L+40 g/L麦芽糖+8 g/L琼脂的培养基中诱导愈伤组织,每2周继代一次,将诱导出的淡黄色、颗粒状Ⅱ型胚性愈伤组织接种于分化培养基(MS+ZT 1 mg/L+IAA 1mg/L+MES 400 mg/L+CH 100 mg/L+麦芽糖40 g/L+gelrite 2.6 g/L,pH 5.8)上培养2-3周,然后转接到再生培养基(1/10 MS+NAA 0.5mg/L+KT0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+gelrite 2.6 g/L,pH 5.8)中进行再生成苗.接种1229块幼胚,得到987块愈伤组织,Hyg抗性愈伤组织123块,抗性再生植株34株.在建立了再生体系的基础上,用根癌农杆菌介导法将GUS基因导入幼胚愈伤组织,抗性植株的PCR检测呈阳性.X-gluc染色表明,少部分愈伤组织出现肉眼可见的蓝色晕斑,说明GUS基因已经在小麦幼胚愈伤组织中表达.     

东方百合茎尖组培技术研究

[目的]研究东方百合索蚌（Sorboune）、元帅（Acapulco）、西伯利（Siberia）茎尖分生组织分化,生产脱毒种苗。[方法]利用MS培养基和外源激素,对东方百合品种进行茎尖组织培养。[结果]鳞片诱导小仔球的最适培养基为MS＋6-BA 1.0mg／L＋NAA 0.2mg/L。茎尖诱导和分化的最适培养基为MS＋6-BA 1.0mg／L＋NAA 0.5mg／L。[结论]在百合种球产业化生产中,该方法是获得百合复壮原种的主要手段。     

农杆菌介导的明恢63转化体系的建立

本试验优化了籼稻的农杆菌遗传转化系统,并以明恢63为材料进行了遗传转化.结果显示,从1 100块愈伤组织中获得133块抗性愈伤,其抗性愈伤率为12.7%,分化率为81.3%,所获取的转基因植株后代的分离绝大多数符合孟德尔遗传规律.因此,此系统是一个较好的农杆菌介导的遗传转化系统,可用于基因功能验证、新基因在后代的遗传方式及共转化培养marker-free转基因植株.     

Study on Transformation of Oriental Hybrid Lily by Agrobacterium-mediated

An efficient procedure was described for the transformation of the monocotyledonous oriental hybrid lily, Lilium cv. Siberia. by Agrobacterium-mediated genetic transformation via leaves regeneration, The leaves of leaflets which derived from bulbs were sliced into 1.0 cm long and were co-cultivated with A. tumefaciens strain LBA4404/pB2AE12, which harbored a vector carrying the neomycin phosphotransferase, DREB2A genes in the T-DNA region. The suitable genetic transformation condition was determined as follows： the bacterial concentration reached 0.5-0.6 （OD600）, 15 min infection time, 20 mg.L^-1 acetosyingone, and 10.6 mmol.L^-1 NH4NO3 medium was used for co-cultivation 3 days, delayed 7 days for selecting by 30 mg.L^-1 kanamycin containing regeneration medium. Efficient shoot regeneration was observed on MS medium supplemented with 1.0 mg.L^-1 naphthaleneacetic acid, 0.5 mg.L^-1 benzyladenine and 0.1 mg.L^-1 Kinetin after about 6 weeks culture. The presence ofDREB2A gene in the genomic DNA of regenerated plants was detected by means of PCR analysis.     

离体百合鳞茎发育及淀粉合成酶基因LohGBSSI的克隆与表达

  目的  淀粉是百合Lilium spp.鳞茎的主要组成成分，淀粉代谢对于百合鳞茎发育至关重要，对其开展深入研究有助于解决鳞茎繁育慢等产业化难题。  方法  以主栽品种东方百合‘索邦’Lilium ‘Sorbonne’离体鳞茎为材料，在观测不同发育时期形态和淀粉积累的基础上，利用cDNA末端快速扩增技术（RACE），克隆淀粉合成代谢关键酶颗粒结合型淀粉合成酶基因LohGBSSI，并对其开展不同组织及发育期基因表达谱分析。  结果  ① 根据形态及源-库转换，离体百合鳞茎形成和发育过程可分为小鳞茎膨大初期（0~15 d），小鳞茎快速膨大期（15~55 d）及小鳞茎膨大后期（55~75 d）。②‘索邦’颗粒结合型淀粉合成酶基因LohGBSSI（GenBank登录号:MF101407.1）全长1 913 bp，开放阅读框（ORF）长为1 665 bp，编码554个氨基酸。氨基酸序列与兰州百合Lilium davidii var.unicolor GBSSI同源性较高（92%），推测该基因可能属于GBSSI基因家族。③LohGBSSI基因在鳞茎和叶中表达显著高于茎段和根，表明直链淀粉合成的最主要部位为源-库关键器官；不同发育时期鳞茎内LohGBSSI的表达在15 d时最高，暗示鳞茎形成初期需淀粉快速合成以便形态建成。  结论  为后续解析淀粉合成关键酶基因GBSS在鳞茎发育中的功能奠定了基础，也为百合进行淀粉相关基因修饰提供了依据。     

Cry1 Ac基因组织特异表达载体构建及水稻遗传转化

为了提高转基因抗虫水稻的生物安全性,构建了由组织特异性启动子序列RSP1、RSP2及组成型启动子35S带动Bt基因Cry1Ac的双元载体pCAM RSP1 Cry1A(c)、pCAM RSP2 Cry1A(c)及pCAM 35S Cry1A(c),并通过农杆菌EHA105介导对两个水稻品种"秀水11"和"秀水63"进行了遗传转化。"秀水11"和"秀水63"的平均转化率分别为72 9%和83 2%,经抗性愈伤组织的分化培养两个品种分别获得346和448株再生植株,其中PCR检测阳性株数分别为295和414。