茄子TRV-VIGS体系的优化及SmIAA19基因功能初步分析

以经过改造的烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）载体PYL156为工具,采用叶片注射法侵染茄子（Solanum melongena L.）叶片,通过表型比较、TRV病毒分子检测和荧光定量PCR技术分析,探究环境温度、植株大小、目的基因插入片段大小对茄子TRV-VIGS沉默体系的影响。结果表明,昼夜温度为（25 ± 3）℃和（20 ± 2）℃时,接种茄子幼苗子叶的植株沉默效果明显,侵染后植株叶片中目的基因表达量与阴性对照相比明显降低;早春日光温室和秋季日光温室条件下,侵染植株表型性状和基因表达量差异不显著。沉默片段大小为200 bp左右时目的基因的沉默效果最好;侵染茄子幼苗子叶期植株出现明显病毒斑,而接种6周龄真叶则无明显表型差异。用茄子生长素诱导基因（SmIAA19）为靶基因对其进行验证,结果表明显著抑制了SmIAA19的表达,其在叶片中的表达量和生长素含量均显著降低,表明SmIAA19是1个与生长素代谢途径相关的基因。     

病毒诱导的基因沉默在番茄组织中的特异性分析

 病毒诱导的基因沉默（VIGS）是植物基因功能研究的新技术。以组成型表达gusA基因的转基因番茄为材料,通过VIGS技术沉默gusA基因,对VIGS在番茄中的组织特异性进行了初步分析。结果表明,VIGS技术能有效地诱导gusA基因在番茄植株的叶片、花、果实、侧枝、主茎及茎分枝点等部位和组织中沉默,证明VIGS在番茄中具有较强的系统性沉默特征。     

茄子SmMsrA基因VIGS表达载体的构建及表达分析

利用RT-PCR从茄子单性结实品系D-10中获得甲硫氨酸亚砜还原酶A基因(Sm Msr A)的编码区。通过Gateway同源重组技术,构建了3个分别含Sm Msr A基因不同片段的烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的基因沉默(VIGS)表达载体p TRV2-Sm Msr Ai。表达载体转入农杆菌GV3101后,用注射压迫法侵染茄子叶片。采用表型观察、TRV病毒分子检测和q RT-PCR技术,评价构建的VIGS体系对Sm Msr A基因的沉默效果。结果表明,报告基因PDS沉默后叶片呈现明显的光漂白现象,Sm Msr A基因沉默后叶片呈花叶状,果实变小,叶片和果实中的Sm Msr A基因的表达量明显降低,表明Sm Msr A基因是正向调控茄子果实发育的相关基因。     

李坏死环斑病毒诱导的桃PpPDS沉默体系的优化及验证

病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）是在桃（Prunus persica）上进行基因沉默的主要手段，现有VIGS体系效率较低，亟待开发针对桃的高效沉默体系。以桃八氢番茄红素脱氢酶（Phytoene desaturase）基因PpPDS为指示基因，探究不同侵染方式、病毒载体、温度、接种苗龄和菌液浓度对桃叶片VIGS效率的影响。结果表明，在侵染方式上，叶片注射是有效的方式；李坏死环斑病毒（Prunus necrotic ring spot virus,PNRSV）载体（pCaRNA1/2和pCaRNA3）优于烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）改造后的TRV载体（pTRV1和pTRV2）；温度为22℃左右PpPDS的沉默效率较高；苗龄为5～6片完全展开叶的桃苗沉默效率较高，达到85%；菌液浓度为OD600=1.0时沉默效率较高。以优化好的VIGS体系参数，选择桃叶绿素合成基因（PpGluTR和PpPOR）为目标基因进行验证，结果显示PpGluTR和PpPOR的表达均被显著抑制，叶片颜色变化明显。这些结果表明优化...     

CmsCRC与佛手指状结构的伸展相关并受低温激活

佛手(Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle)是香橼(C. medica L.)的变种,两者亲缘关系相近但果形差异巨大。青皮佛手一般为指状,如果以较高温度(20℃)诱导成花可以得到拳(状)佛手。石蜡切片发现拳佛手的内层心皮在开花前部分融合。利用q RT-PCR技术分析了CRC在拳佛手、指佛手及香橼从花芽到花后的表达,发现指佛手CRC表达量显著低于香橼和拳佛手,且CRC在拳佛手花器官的表达模式与香橼类似,表明果形的变化可能与CRC的差异表达有关。在香橼和指佛手中分离了CRC基因的全长,发现指佛手CRC启动子较香橼缺失了两个TATA-Box元件。构建指佛手和香橼部分CRC启动子的瞬时表达载体转化本氏烟,常温下指佛手Cms CRC启动子活性低于香橼。低温(4℃)诱导后,香橼和指佛手CRC启动子活性增强,且指佛手的活性强于香橼,表明相对于香橼,指佛手启动子在低温下更加敏感。因此,Cms CRC可能与佛手指状结构的伸展相关且受低温的诱导。     

利用农杆菌注射法鉴定番茄黄化曲叶病毒的沉默抑制子

利用农杆菌注射法鉴定了番茄黄化曲叶病毒的沉默抑制子V2。将分别携带目标基因与GFP表达载体的农杆菌共注射到本氏烟草中,2 d后GFP瞬时高量表达。西瓜褪绿矮化病毒BV1基因表达载体和空载体pBIN分别与GFP共侵染7 d后,GFP表达量由于寄主沉默机制而急剧减弱。V2基因表达载体与GFP表达载体共侵染叶片7 d后,GFP仍保持高水平表达,说明V2作为番茄黄化曲叶病毒沉默抑制子可阻止寄主的沉默机制。农杆菌注射法可快速方便筛选植物病毒沉默抑制子。     

利用InDel标记筛选多胚山金柑珠心苗后代

【目的】柑橘的遗传转化通常以实生苗上胚轴为外植体。作为基因组高度杂合的无融合生殖物种，柑橘多胚种子中常含有一定比例的、因遗传重组较亲本表现出遗传背景差异的有性后代，从实生群体中筛选无性后代进行遗传转化实验可有效保证外植体材料遗传背景的一致性及后续相关研究的科学性和可靠性。基于此，开发分子标记用于快速准确筛选柑橘短童期种质——多胚山金柑（Fortunella hindsii）子代中的珠心胚实生苗，以期为优化完善山金柑遗传转化体系提供基础。【方法】利用母本山金柑材料DB02重测序数据进行InDel标记的挖掘，筛选出可以区分有性后代和无性后代的InDel标记，通过琼脂糖凝胶电泳对DB02系山金柑的子代幼苗进行鉴定。【结果】开发出7对可以区分DB02系山金柑种子中有性和无性后代的InDel杂合位点标记（InDel1～InDel7），基于这些标记进一步研究，发现土播幼苗和试管幼苗中的珠心苗比例分别为87.5%和74.2%。【结论】利用InDel标记可以成功筛选出与DB02系山金柑遗传背景一致的无性克隆后代，进一步完善了山金柑实生苗上胚轴遗传转化体系。     

山金柑四倍体资源的发掘与鉴定

在山金柑自然群体中通过流式细胞术发掘到1株四倍体植株,对其叶片、花朵、花粉、果实、种子等性状进行鉴定,并利用该材料自交创制新的四倍体材料。鉴定结果表明:四倍体相对于二倍体,叶片更宽、更厚、叶形指数变小,叶片气孔密度变小、气孔器更大;四倍体的花直径、整花长度、花瓣长度、花丝长度、雌蕊长度、花粉粒均极显著大于二倍体,花粉外壁纹饰密度极显著小于二倍体;四倍体的果形指数变大,果皮厚度增大,色泽指数无显著差异;四倍体种子横径与二倍体无显著差异,纵径极显著大于二倍体;其种子胚类型为多胚。四倍体山金柑自交后代均为四倍体,可作为柑橘育种和基础研究的资源。     

番茄青枯病抗性两个相关基因功能的初步鉴定

对抗性番茄材料‘Hawaii 7996’分别接种强致病力青枯菌（RsH）和中等致病力青枯菌（RsM）后,利用双向电泳技术找到了两个差异表达蛋白质--谷胱甘肽S转移酶L3和Remorin 1蛋白。在利用携带八氢番茄红素脱氢酶基因PDS的TRV重组病毒载体通过叶片浸润法证明VIGS体系可行后,进一步利用该技术沉默上述两个蛋白质的对应基因GST-L3和Rem-1,并用半定量RT-PCR检测沉默效果。结果表明,分别沉默GST-L3和Rem-1的番茄植株抗性减弱,在接种中等致病力青枯菌（RsM）后青枯病发病率和病情指数都明显高于对照植株,说明基因GST-L3和Rem-1与番茄对青枯病的抗性相关。     

香橼与佛手F1杂种鉴定及果形差异分析

以香橼(Citrus medica L.)为母本，佛手(C. medica var. L. sarcodactylis Swingle)为父本进行授粉杂交，将得到的种子进行培育获得19份材料。从佛手和香橼转录组数据筛选出SSR位点设计TP-M13-SSR分子标记引物，对19份材料进行基因分型。每对核心引物获得17～32个等位基因，平均等位基因数为24.188个。观测杂合度变化为0.188～1.000，多态性指数为0.944。19个F₁代株系中17个确定为真杂种，杂交率为89.47%。通过影像分析F₁代果形，指状果与柑果果形分离比为2︰3。佛手和香橼花芽石蜡切片观察发现，形成指状或柑果果形差异起始于现蕾期至现瓣期的心皮隆起。对现蕾期至花后3d的佛手、香橼花芽转录组信息与心皮特征进行相关性分析，分离得到一批雌蕊形成相关基因；在即将开花的佛手、香橼及F₁代雌蕊中进行qRT-PCR验证，分析这些基因与果形差异的关联性，WOX1基因在现蕾期和现瓣期的表达与指状特征相关。YABBY家族基因可与花发育C类和E类基因及WOX家族协同作用...     

佛手果形发育观察及果形相关基因表达分析

通过超景深显微镜和扫描电镜观察不同发育阶段的佛手（Citrus medica L. var. sarcodactylisSwingle）花芽形态,发现佛手指状部分并非发育自柱头,而是来自雌蕊子房。同时,在佛手中分离了CmsSUN20、CmsOFP7、CmsOFP12 和CmsYABBY5 等4 个果形相关基因的全长,与甜橙序列比对的相似性大于95%,构建进化树分析发现其与甜橙聚在一个分支。收集佛手和香橼（C. medica L.）果实发育相同阶段不同组织（叶片,花瓣,雌蕊,雄蕊）材料,以qRT-PCR 法分析了上述4 个基因的表达。结果表明CmsSUN20 在佛手雌蕊的表达显著高于香橼,在其他组织中差异不显著或相反,表明该基因可能与佛手雌蕊发育有关。CmsYABBY5 在佛手雌蕊和雄蕊中都显著高表达,而在叶片中却显著低表达,表明CmsYABBY5 有可能对佛手雌蕊和雄蕊发育有重要作用。而CmsOFP7 和CmsOFP12 在佛手叶片、雌蕊和雄蕊中均高表达,由于并非特异在雌蕊中高表达,所以可能并不对佛手果形建成起决定作用。     

中国商陆抗病毒蛋白基因的克隆及其转化辣椒

根据美洲商陆抗病毒蛋白基因序列设计引物,从中国商陆（Phytolacca acinosa）叶片基因组DNA扩增克隆缺失无毒型中国商陆抗病毒蛋白基因（PacPAP1）,构建该基因植物表达载体,采用农杆菌介导的叶盘法转化辣椒,对转基因植株进行分子检测,TMV及CMV人工接种鉴定,25d后统计发病情况。结果表明：克隆得到缺失无毒型PAP基因PacPAP1,大小为714bp,与美洲商陆抗病毒蛋白基因（Pam-PAP）的同源性为99.7%;得到了PacPAP1整合入辣椒基因组中的阳性植株;接种TMV、CMV的阴性对照植株都明显发病,转PacPAP1植株未出现症状,说明转基因辣椒植株可获得抗TMV和CMV材料。     

苏网1号

苏网1号系苏州市蔬菜研究所新育成的网纹甜瓜一代杂种。植株生长势中等，易坐果，抗病、抗逆性强。叶片掌状，叶缘波状，适宜坐果节位为第12～15节，从开花至果实成熟50～55d（天），全生育期100-115d（天）。果实高圆形，表面网纹细密，果皮黄绿色，果肉绿色，肉厚4cm，单果质量1．5kg左右，可溶性固形物含量16％左右，水分多、口感佳、脆甜爽口。适宜保护地栽培，春、夏、秋季均可种植。     

查尔酮合酶基因对桃果实花色苷代谢的影响

从桃（Prunus persica）果皮中克隆了493 bp的查耳酮合酶（Chalcone Synthase,CHS）基因片段,利用病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）构建干扰载体TRV-LIC-CHSi,通过农杆菌渗入法沉默目的基因CHS的表达,从而研究CHS在桃果实花色苷代谢途径中的功能。干扰CHS基因的表达后,CHS的表达量降低88.8%,果皮中花青素糖苷含量下降87%,槲皮素糖苷含量下降35%,绿原酸含量升高57%,原花青素含量、儿茶素含量和山奈酚糖苷含量无显著变化。研究结果表明,沉默CHS基因,会使整个花色苷代谢途径转向绿原酸及其复合物方向。CHS基因调控着类黄酮类物质的代谢方向,是花色苷代谢途径中的重要基因。     

盆栽佛手栽培技术

佛手（Citrus medica var.sarcodactylis）,别名五指柑、佛手柑、佛指香椽,芸香科,柑橘属。佛手是枸椽的变种,常缘灌木或小乔木,树冠开张,枝条稀疏有刺。总状花序有花8~13朵,一年可开3~4次花,以夏季最盛。花色有白、紫之分。11~12月果实成熟,果实如拳的称佛拳、闭佛手、拳佛手;张开如指的叫开佛手、佛手、真佛手,橙黄色,味芳香。     

佛手的用途和栽培管理

1　用途佛手是芸香科 ,柑桔属 ,枸橼类 ,香橼种中的一个变种 ,又名佛手柑、五指柑和五指香橼。按果实大小分为小果佛手、中果佛手和大果佛手三个类型 ,栽培上多选大果型和中果型两种。佛手的果实皮色金黄 ,肉质白嫩 ,香脆干甜 ,除鲜食外 ,还可制作蜜饯、果脯 ,并可加工成佛手茶、佛手露、佛手果冻和佛手香酒。花、幼果和成熟果实均可入药。佛手枝青叶大 ,一年发枝 4～ 5次 ,终年常绿 ,花期长 ,全年都有花开 ,但以春季开的花结果最好。花朵外红里白 ,果实成熟时金黄 ,形态奇异 ,是观树、观叶、观花和观果皆宜的优良绿化、美化和观赏植物。特…     

草莓生长素合成限速酶FaYUC11基因的克隆和功能分析

【目的】克隆草莓YUC家族新基因,探究其在草莓中的具体调控作用。【方法】以‘久香’草莓为材料,利用同源克隆技术克隆草莓果实大小调控相关的新基因,利用病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)结合定量RT-PCR技术,分析新基因在草莓果实膨大调控中的作用。【结果】从‘久香’草莓果实中克隆到1个草莓果实大小调控相关的新基因,命名为FaYUC11(Gen Bank登录号:JX417083.1),用草莓幼果微注射法建立了病毒诱导FaYUC11基因沉默的转基因草莓体系,结果发现,FaYUC11基因沉默后果实的膨大和正常生长均受到影响,并且导致果实瘦果(种子)中游离生长素含量下降、果实纵横径增长率降低。【结论】FaYUC11基因是草莓生长素合成途径中的关键基因,该基因通过调控生长素的合成继而调控果实的膨大。     

低温胁迫下佛手和枳乙烯应答因子6（ERF6）表达变化的比较分析

 以柑橘属寒敏感植物佛手‘青皮’品种叶片cDNA为模板,通过RT-PCR与RACE扩增,获得一个1 160 bp的乙烯应答因子（ethylene response factor,ERF）基因的cDNA序列,其基因编码区共999 bp,含有一个保守的AP2/EREBP结构域,与拟南芥AtERF6为同源基因,命名为CmsERF6（GenBank登录号为HQ698835）。4 ℃低温处理佛手和枳（柑橘属近缘种耐寒植物）植株,测定其寒胁迫生理指标（电解质渗出率、丙二醛含量）。使用实时荧光定量PCR,对佛手和枳叶中的ERF6表达含量进行测定分析,结果表明：低温对佛手与枳的ERF6表达均具有诱导作用,且表达量的变化趋势存在明显的差异。尤其在枳中,ERF6的表达较对照组上升约4 000倍,且电解质外渗率的变化与ERF6基因表达量变化具有一致性,说明ERF6基因参与低温胁迫应答。     

中国商陆抗病毒蛋白基因的克隆及其转化辣椒的研究

本研究的目的是获得抗病毒病的辣椒材料,为选育抗病毒病辣椒品种奠定基础。根据美洲商陆抗病毒蛋白基因序列设计引物,从中国商陆（Phytolacca acinosa）叶片基因组DNA扩增克隆缺失无毒型中国商陆抗病毒蛋白基因（PacPAP1,构建该基因的植物表达载体,采用农杆菌介导的叶盘法转化辣椒,对转基因植株进行分子检测、TMV及CMV的人工接种鉴定,接种25d后,统计发病情况。结果表明：克隆得到缺失无毒型PAP基因PacPAP,大小为714 pb,与美洲商陆抗病毒蛋白基因（PamPAP）的同源性为99.7%;得到了PacPAP1整合入辣椒基因组中的阳性植株;接种TMV、CMV阴性对照植株都明显发病,转PacPAP1基因植株未出现症状,说明转PacPAP1辣椒植株可获得抗TMV和CMV材料。     

从山金柑试管实生苗直接诱导胚性愈伤组织的研究

山金柑(Forrunella hindisti Swingle)种子在MT培养基上培养50天,可从幼苗子叶下0.1—2.0厘米处产生胚性愈伤组织,并能在无激素的基本培养基中继代保存,仍有胚性再生能力。取自田间植株的种子,其试管苗产生胚性愈伤组织的频率为16.7％,显著地低于温室盆栽树种子试管苗愈伤组织的发生频率37.1％,不同年份之间这种频率没有显著差异。产生愈伤组织的实生苗高度只有未产生愈伤组织苗高的66.4％,叶片数也只有后者的1/3,将子叶以下0.5厘米的茎段在基本培养基上进行离体培养,38.5％的外植体产生了胚性愈伤组织。