抗副结核分枝杆菌细胞壁抗原单克隆抗体的制备和特性鉴定

用3M 氯化钾浸出的副结核分技杆菌细胞壁抗原(KCl-Ag)免疫的 BALB/C 小鼠脾细胞和 NS-1骨髓瘤细胞融合,制备出3株抗副结核分枝杆菌单克隆抗体—McAb-JM_1、JM_2、JM_3。用 ELISA 方法对3株单克隆抗体与副结核分枝杆菌及其他6种分枝杆菌不同抗原的反应性进行了研究.McAb-JM_1与副结核分枝杆菌不同菌株间的 KCl-Ag 和部分胞浆抗原(PPD)发生交叉反应;在其他分枝杆菌抗原中,仅与牛草分枝杆菌的 PPA 和禽型结核分枝杆菌 KCl-Ag 发生交叉反应.McAb-JM_2在副结核分枝杆菌中.与强毒株抗原发生较强反应.而与弱毒株抗原反应性较弱。McAb-JM_3在分枝杆菌中.除 Teps 株和偶发分枝杆菌抗原外.均发生交叉反应。本文讨论了这些单克隆抗体在副结核病血清学诊断及抗原分析中的意义和用途。     

应用单克隆抗体对副结核分枝杆菌抗原性的研究

通过四次细胞融合,获得了5株产生抗副结核杆菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将这5株单克隆抗体与13株副结核杆菌抗原进行ELISA,结果表明,13株副结核杆菌可初步被5株单克隆抗体分成三组:C_1、C_3、P_(10)、Teps为A组;C_2、C_4、C_5、C_6、C_8、C_(11)、C_(12)、1555为B组;P_(18)为C组。     

新疆奶牛副结核分枝杆菌的分离鉴定

为进一步确定新疆某规模化牛场疑似奶牛副结核病病原,本研究从PCR检测阳性牛粪便样本中共分离获得4株细菌,对其进行菌落形态观察、抗酸染色镜检以及16S r RNA、IS900特异性基因及亚型分型基因的扩增、序列测定与分析。结果显示,所分离的4株细菌为抗酸染色阳性菌,对其IS900基因及亚型分型基因检测均为阳性,它们的16S r RNA、IS900基因及亚型分型基因之间同源性为100%,与Gen Bank中登录的副结核分支杆菌序列同源性在99%以上,从而确定所分离的4株菌株均为Ⅱ型(牛型)副结核分枝杆菌。     

副结核分枝杆菌不同株的生化特性

测定了20株野生型和2株实验室副结核分枝杆菌菌株的生化活性。测定的项目有:在30℃、37℃和42℃时生长;产脲酶、尼克酸、异烟酰胺酶、芳香基硫酸酯酶和过氧化氢酶;水解Tween 80;还原硝酸盐和亚碲酸盐;以及在5％NaCl中生长。还测定了对二噻吩羧酸酰肼(10μg/ml)、氯化新四唑(1∶40,000)、链霉素(2μg/ml)、利福平(0.25μg/ml)和异烟肼(10μg/ml)等抗菌剂的敏感性。一般说来,副结核分枝杆菌在生化上不活跃,只有少数菌株产异烟酰胺酶和加热后保持过氧化氢酶活性。所有菌株在37℃生长最佳,30℃少量生长,42℃不生长。野生型菌株在有氯化新四唑、链霉素和利福平时不生长,在有二噻吩羧酸酰肼和异烟肼时生长。虽然生化测定可以用作鉴定副结核分枝杆菌的一种辅助手段,但是生长速度和分枝菌素依赖仍是阳性判定的主要标准。     

犬副流感病毒单克隆抗体的研制及其特性鉴定

为研制犬副流感特异性诊断试剂,我们以犬副流感病毒(CPIV)免疫8周龄BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术获得4株稳定分泌针对CPIV的单克隆抗体(MAb)细胞株,分别命名为4F386、584C9、4G7F4和4C9D8.4株MAb腹水针对CPIV的间接ELISA抗体效价达1:10~5～1:10~6,与犬瘟热病毒(CDV)和犬细小病毒(CPV)均不发生交叉反应.MAb 4F386和4C9D8为IgG,5B4C9和4G7F4为IgM.Western blot检测表明,4F386与CPIV的F蛋白发生特异性反应,4G7F4与CPW的HN蛋白发生特异性反应,而584C9和4C9D8不与变性的CPIV蛋白发生反应.4株MAb均具有中和病毒活性,间接免疫荧光检测均呈为阳性.本研究为进一步研制CPIV特异性诊断和治疗制剂创造了条件.     

抗κ-酪蛋白单克隆抗体的制备及其特性鉴定

To obtain the anti-kappa casein monoclonal antibody and complete the identification of the antibody characteristics. The BALB/c mice were immunized with kappa casein using foot-pad immunization. Popliteal lymph node cells from the immunized mice were fused with SP2/0 myeloma cells in the presence of PEG. Three hybridoma strains (1C4, 3G3, 3E6) which secreted the antibody specific for kappa casein were obtained．The sub-class of the antibodies were IgG1. The ascites were purified by Protein G affinity layer absorption column. The antigenic epitope of 3G3 and 3E6 were different and it was close between 1C4 and 3E6.The titer of purified ascites(1C4) was 1.28×10⁶ and the affinity constant was 2.89×10⁸ mol/L. A anti-kappa casein monoclonal antibody with good affinity had been achieved,which provided foundations for the rapid detection of casein in bovine milk samples.     

辽宁绒山羊副结核分枝杆菌的分离鉴定及分子生物学检测

为了对某辽宁绒山羊饲养场疑似副结核病例作出正确诊断,本研究针对疑似病羊的内脏组织和肠内容物在Dubods油酸琼脂培养基上经过37℃条件下9～13周培养,从其肝脏组织中分离获得1株细菌,对该分离菌株开展了形态学观察、抗酸染色镜检、PCR检测及基因序列测定等研究工作。结果显示,分离菌为抗酸染色阳性菌,而且形态学符合副结核分支杆菌的特征; PCR检测结果为阳性,测定的序列与Gen Bank中J Ⅱ-1961(CP022105. 1)基因序列同源性高达100%,证实了该分离菌株为副结核分支杆菌。     

抗猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白单克隆抗体的制备及其部分特性鉴定

以纯化的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行融合,间接ELISA方法进行筛选,采用有限稀释法进行细胞克隆,经过3次克隆筛选,最终获得一株分泌抗重组TGEV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系(命名为E10F10D5),其染色体平均记数为87±10对,间接ELISA检测制备的腹水效价达1:12 800,以全病毒为抗原对杂交瘤细胞(E10F10D5)产生的腹水进行Westernblot分析,该腹水识别病毒结构蛋白质分子量约43ku,即TGEV天然N蛋白.     

抗旋毛虫单克隆抗体细胞林的建立及其特性鉴定

为筛选旋毛虫保护性抗原,建立了4株分泌抗旋毛虫McAb的细胞株。经连续培养30余代,仍稳定地分泌抗体。其中,2G3和2C10的靶抗原为旋毛虫幼虫表膜。免疫球蛋白 型及亚 鉴定表明,2G3和2C10为IgG_1,1D5为IgG_3,1C9为IgM。除2C10和IC9对伊氏锥虫可溶性抗原呈现阳性反应外,未见对猪圆线虫、猪囊尾蚴、伊氏锥虫表膜抗原和正常猪肉反应。经ELISA测定,2G3、2C10、1D5、1C9均可与施毛虫幼虫可溶性抗原作用,其腹水效价分别为1:50000、1:10000、1:1000、1:800。各McAb均与旋毛虫幼虫排泄分泌物抗原(ES抗原)作用,经ELISA测定表明,2G3腹水效价达1:320000。     

副结核分枝杆菌抗原诊断研究进展

副结核病是由副结核分枝杆菌(MAP)引起的慢性炎性肠道疾病[1],临床症状主要包括持续性腹泻、体重减轻、产奶量下降等症状[2-3].本病广泛流行于世界各地.根据血清学试验,仅在美国就有3.4%的奶牛和21.6%的牛场感染副结核,每年对农业造成15亿元的经济损失[4].     

副结核分枝杆菌MAP1068胞外蛋白酶的特性研究

为研究副结核分枝杆菌(MAP)1068蛋白的特性,本研究以MAP参考株K10基因组为模板,PCR扩增其map1068基因,构建p ET28a-map1068重组载体,将其转化BL21后诱导表达并纯化MAP1068蛋白。利用纯化的重组蛋白免疫(100μg/只/0.1 m L)小鼠制备多克隆抗体,应用该抗体对MAP1068蛋白进行亚细胞定位。以酪蛋白为底物测定MAP1068蛋白的酶活性。结果显示,MAP1068蛋白以包涵体形式表达;经变性、复性、亲和层析纯化后获得目的蛋白;将该蛋白免疫小鼠后其血清抗体效价可达1∶204 800;该蛋白主要定位于MAP细胞壁,可降解酪蛋白,为胞外蛋白酶。本实验为进一步研究MAP的致病机制奠定了基础。     

抗产气荚膜梭菌ε毒素单克隆抗体的研制和部分特性鉴定

小鼠SP2/0骨髓瘤细胞和用产气荚膜梭菌ε类毒素免疫BALB/C鼠的脾细胞,以PEG为融合剂进行融合,伙得分泌抗产气荚膜梭菌ε毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株13株。经鉴定,杂交瘤所分泌的单克隆抗体在ELISA中均特异地与产气荚膜梭菌ε毒素反应,而不与α和β毒素反应。13株单克隆抗体均为IgG_1亚类,经毒素抗毒素中和试验 测定,13株单克隆抗体中,12株具有中和ε毒素的活性。     

抗猪传染性胃肠炎M蛋白单克隆抗体的制备及部分特性鉴定

以纯化的猪传染性胃肠炎病毒重组M蛋白免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行融合、筛选,最终获得3株抗TGEVM蛋白的杂交瘤细胞系1B3、3C2、4A5,染色体平均记数为89对、92对、90对,间接ELISA检测1B3、3C2、4A5细胞培养上清的效价分别为1/4000、1/1000、1/4000,腹水效价分别为2×10~4、2×10~5、2×10~5。通过间接ELISA做病原检测,这3株单抗不与猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒和猪轮状病毒发生交叉反应,而与传染性胃肠炎病毒显示良好的特异性。用制备的单抗通过间接免疫荧光做病原检测,发现染色后TGEV感染的细胞培养物在胞浆和细胞膜上出现黄绿色荧光,未接种病毒的细胞培养物未见有黄绿色闪亮荧光,结果表明,所制备的抗重组TGEVM蛋白的单抗对病原检测具有很高的特异性,为TGEV准确快速的病原诊断和TGEV感染相关的基础性研究提供了物质基础。     

抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的研制及其特性鉴定

以新生乳猪增殖猪流行性腹泻病毒（ＰＥＤＶ）,通过蔗糖密度梯度离心将其纯化,获得较为完整的病毒颗粒。病毒ＥＬＩＳＡ效价为１∶３×１０５,蛋白含量为３．９６ｇ／Ｌ。将提纯的ＰＥＤＶ免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,取免疫鼠脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞进行融合,融合率为９５．６％。用间接ＥＬＩＳＡ进行筛选,共检出３８个阳性孔,阳性率为２８．８％。对其中１５个阳性值较高的孔进行３次再克隆,阳性率达１００％,最后获得１５株稳定分泌特异性抗ＰＥＤＶ单抗（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞。ＥＬＩＳＡ阻断试验与交叉试验证明,其分泌的抗体具有高度特异性。腹水和细胞培养上清的ＥＬＩＳＡ效价分别为１∶１０３～１∶１０６和１∶１２８～１∶５１２。经鉴定,１５株ＭｃＡｂ的分子类型均为ＩｇＧ,均无免疫沉淀特性。杂交瘤细胞的染色体数目为９０～１１０,平均９５。尤为重要的是,这些杂交瘤细胞所分泌的抗体,有的对ＰＥＤＶ具有中和作用,能够阻断病毒对猪只的侵害作用。