实时荧光定量PCR在植物病害流行学中的应用

实时荧光定量PCR广泛应用于植物病理学研究的各个领域。近年来已开始应用于植物病害流行学的定量研究中,本文对近年来实时荧光定量PCR技术在病菌初始菌源的定量分析、病害流行动态的监测、寄主抗病性的快速鉴定和植物病原菌的抗药性监测等方面的应用进行了综述。     

实时定量PCR的原理及其在植物病理学研究中的应用

实时定量PCR(Real-time quantitative)是一种利用荧光信号实时监测每个循环的扩增产物,从而实现对模板进行定量分析的新技术。它具有快速、灵敏、精确等优点。该技术在分子诊断、分子生物学研究、动植物检疫以及食品安全检测等方面有广泛的应用。本文综述了实时定量PCR的原理、影响因素及其在植物病理学研究中的应用。     

基于PCR技术的植物病原菌分子定量检测技术研究进展

植物病原菌的菌源量是病害发生和流行的重要因子之一,对其精准的定量测定或检测可大大提高植物病害预测的准确性,本文对实时荧光定量PCR (qPCR)与数字PCR在植物病原菌定量检测、以及基于RNA水平的real-time PCR和基于核酸染料(EMA/PMA)与qPCR相结合的技术在植物病原菌活体定量检测中的应用进行了综述,并展望其在植物病害流行和预测中的应用前景。     

三种PCR方法检测柑橘黄龙病菌的效果比较

为了比较常规PCR、巢式PCR和实时荧光定量PCR方法在大田检测中对柑橘黄龙病(Huanglongbing, HLB)的检测效果, 首先比较了3种检测方法对柑橘黄龙病菌检测的灵敏度, 结果发现：3种检测方法的灵敏度依次为常规PCR<巢式PCR<实时荧光定量PCR。运用3种检测方法对广东5个柑橘品种上的189个黄龙病疑似病样进行检测, 结果发现：黄龙病检出率依次为常规PCR<巢式PCR<实时荧光定量PCR。研究表明：常规PCR适合以较低成本大规模检测黄龙病; 实时荧光定量PCR具有最大的检测灵敏度; 巢式PCR检测技术同时具有前两者的一些优点, 但操作较复杂, 适合技术熟练的研究者使用。     

甘蔗宿根矮化病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

 甘蔗宿根矮化病是由Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx)引起的一种世界性甘蔗细菌病害。根据Lxx的Pat1基因保守序列,设计并合成了一对特异性引物Pat1F (5′-GGTTCCATTGCTTACCGATT-3′)/Pat1R(5′-CAAGTTTCGACAGGAACAGC-3′),和一条TaqMan探针(FAM-5′-CCACGGCTACGTCAATTCGGG-3′-TAMRA),建立了一种特异性强、灵敏度高的甘蔗宿根矮化病菌实时荧光定量PCR检测方法。结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR方法,对Lxx的检测最低下限为10² copies·μL^-1。应用实时荧光定量PCR与常规PCR方法对14个甘蔗品种进行Lxx检测,阳性检出率分别为86%和43%,表明实时荧光定量PCR比常规PCR检测方法具有更高的灵敏度。研究结果为甘蔗宿根矮化病的诊断、田间发生动态监测、脱毒健康种苗检测及品种/材料交换检疫检测提供了新技术支撑。     

番茄煤污假尾孢叶斑病菌实时荧光定量PCR检测技术的建立及应用

为快速、准确地对番茄煤污假尾孢Pseudocercospora fuligena进行检测与定量分析,基于其Avr4基因设计特异性引物JWB-9F/JWB-7R,建立实时荧光定量PCR检测技术,分析该检测技术的特异性和灵敏度,并利用采集自重庆市、河北省和广西壮族自治区的14份材料对该检测技术的应用效果进行验证。结果表明,引物JWB-9F/JWB-7R仅可从番茄煤污假尾孢基因组DNA中扩增出232 bp的目的片段,特异性良好;实时荧光定量PCR检测技术的灵敏度为67.09 copies/μL,是普通PCR检测技术的1 000倍。且该实时荧光定量PCR检测技术可以实现未显症样本中番茄煤污假尾孢的定量检测,检测限为6.02×10~2copies/μL,实际应用效果较好。表明所建立的实时荧光定量PCR检测技术可用于番茄煤污假尾孢叶斑病的早期诊断和预测预报。     

番茄褪绿病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR方法

 根据番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus, ToCV)热激蛋白70(Hsp70)的基因序列,设计ToCV实时荧光定量PCR特异引物。利用重组质粒ToCV-1为标准品建立SYBR Green I实时荧光定量方法。针对引物浓度、退火温度、特异性、灵敏度、重复性和稳定性进行系列优化。结果表明,最适退火温度为63℃,最适引物浓度为0.3 μmol·L^-1。熔解曲线为特异性单峰,表明其特异性良好。建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR较常规PCR灵敏100倍,且具有良好的重复性和稳定性。基于SYBR Green I实时荧光定量PCR技术建立的ToCV检测方法,速度快、特异性强、灵敏度高、重复性好,可以用于ToCV的定量检测。     

葡萄根瘤蚜TaqMan-MGB实时荧光定量检测方法的研究

为建立葡萄根瘤蚜实时荧光定量PCR的检测方法,参考Karen Herbert等设计的特异性引物与TaqMan-MGB荧光探针,构建以标准阳性质粒作为标准品制作标准曲线,并经优化反应条件,建立葡萄根瘤蚜的实时荧光PCR绝对定量检测方法,进行敏感性和重复性试验,并对受葡萄根瘤蚜为害的葡萄根际土壤进行初步定性检测.结果表明:该方法的灵敏度可达1.625拷贝/μL,3次重复检测的变异系数均小于5％.提取0.25g含有10头葡萄根瘤蚜若虫土壤的DNA,并将其梯度稀释,用建立的荧光定量PCR进行检测,将DNA稀释103倍后,仍能检测出阳性结果.对受害葡萄根际土壤检测结果为阳性.葡萄根瘤蚜TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测技术具有特异性强,敏感性高,易操作等优点,有很好的应用前景和研究价值.     

半巢式反转录实时荧光PCR检测马铃薯黑环斑病毒

本研究根据基因组中RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)保守序列,设计合成了3条巢式PCR引物和1条TaqMAN荧光探针,建立了半巢式反转录实时荧光PCR检测PBRSV的新方法.该方法采用E.Z.N.A TM快速提取植物总RNA,并有机地结合了巢式PCR和TaqMAN探针检测技术.第二步半巢式反转录实时荧光PCR既是对第一步信号的进一步放大,也是对第一步PCR产物的确认,因此,检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、单重Realtime PCR等方法高.实验结果表明,该方法检测灵敏度可达300fg/μL植物总RNA.     

利用常规PCR和实时荧光定量PCR检测杨梅凋萎病菌

凋萎病是近年来危害杨梅的主要病害。为了快速灵敏的检测杨梅凋萎病菌(Pestalotiopsis versicolor和P.microspora),本研究开发了常规PCR和SYBR Green实时荧光定量PCR技术各一套。利用P.versicolor(JN861773)和P.microspora(JN861776)的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列的相同部分设计引物对(Pvm1L/Pvm1R)。该引物对利用常规PCR技术能特异性扩增出杨梅凋萎病菌188 bp的目标产物而对照菌株则呈阴性。该常规PCR体系能够检测人工接种后21 d和田间自然发病的有病症杨梅组织中的凋萎病菌,检测下限是0.6×10~5拷贝数。利用Pvm1L/Pvm1R进行SYBR Green实时荧光定量PCR,检测灵敏度是常规PCR的100倍,检测下限是0.6×10~3拷贝数,能够检测出人工接种及田间已经感染但尚未表现症状的杨梅组织中的凋萎病菌。这两项技术简单、快速、灵敏特异性强,可以应用于杨梅凋萎病的诊断和苗木检疫。     

靶标抗性点突变基因型检测技术

杀虫剂的不合理使用导致害虫的抗药性日趋严重。抗药性是一种涉及一个或几个昆虫基因的遗传特征。靶标抗性通常与点突变相关,对抗性相关的点突变的快速检测诊断是抗性治理的基础之一。评述了5种基因型检测技术——单链构象多态性、固相微型测序、双向等位特异PCR扩增、实时荧光定量PCR和焦磷酸测序的优缺点及其在突变检测中的应用。     

AFLP分子标记技术在昆虫学研究中的应用及展望

扩增片段长度多态性技术（AFLP）已经成为一个普遍应用的分子标记技术,具有集成高效性、高信息量、无需知道序列信息等诸多优点,近年来又在酶切、扩增体系、检测和分析方法等方面不断得到改进,已广泛应用于生物学的各个领域。近十年来,AFLP分子标记技术在昆虫学研究中得到广泛应用,极大地促进了人们对昆虫多样性遗传基础的了解。目前研究人员已经利用该技术绘制了有益昆虫以及农艺学上重要害虫的基因连锁图谱,并对控制相关性状的基因进行了标记以及QTL定位等。本文简要介绍了AFLP分子标记技术在有益昆虫、重要农业害虫、检疫害虫等研究中的应用,并对该技术应用前景进行了简单的展望。     

大草蛉雄虫卵黄原蛋白基因的鉴定和表达特征

为探索卵黄原蛋白基因对大草蛉雄虫生殖生理等活动的调节作用,利用PCR技术克隆了大草蛉卵黄原蛋白基因部分cDNA序列,采用生物信息学方法分析其序列特征,通过实时荧光定量PCR技术检测了该基因在不同发育阶段和不同组织的表达特征.结果表明,克隆到的卵黄原蛋白基因的cDNA长度为1501 bp,编码501个氨基酸,其预测的蛋白...     

基于地理信息系统的全国主要粮食作物病虫害实时监测预警系统的研制

为提高病虫害防治的准确性和科学性，依据植保知识、专家经验，采用人工智能、自行开发的具地理信息系统基本功能及决策支持系统（DSS）的相关技术，研制了基于Internet网络传输的全国主要粮食作物病虫害实时监测预警系统。本系统能够对小麦、玉米、水稻、马铃薯、高粱和谷子6种主要粮食作物的60余种病虫害进行实时监测、预警、诊断、提供植保知识，能够对年度间同期病情、虫情做出图形比较，可将抽象的预警数据转化成清晰简明的点图式电子地图，直观明了地显示病虫害发生点数及地域分布，可根据品种的抗病虫性、病虫害发生基数和未来天气预报等信息对小麦白粉病、赤霉病、纹枯病、稻瘟病、稻曲病、马铃薯晚疫病、麦蚜、小麦吸浆虫和玉米螟9种重要病虫害做出短期防治决策，系统的运行有助于提高人们对主要粮食作物病虫害管理的科学水平。     

香蕉褐缘灰斑病菌检测技术研究进展

香蕉褐缘灰斑病严重影响香蕉产量和品质,是香蕉生产上的重要生物灾害之一.香蕉褐缘灰斑病的早期诊断、检疫及防治的重要基础与前提是建立快速、灵敏的检测技术,从而准确及时鉴定出病原菌种类.本文介绍了香蕉褐缘灰斑病菌的种类和分类,概述了国内外香蕉褐缘灰斑病菌检测方法的研究进展,总结和归纳了传统、血清学、DNA指纹图谱、常规PCR...     

木霉REMI转化体耐热机理的初步研究

本文利用蛋白质电泳、基因克隆和荧光定量PCR等技术对耐高温木霉REMI转化体的抗逆机理进行了初步研究。结果表明,耐高温木霉REMI转化体的蛋白质谱带明显多于出发菌株T21,且差异主要集中在Rf值大于0.593的区域,该区域主要是小分子的热休克蛋白,说明影响耐高温木霉REMI转化体对温度耐受性的蛋白主要以小分子量蛋白质为主。对其中一种热休克蛋白HSP24的基因进行克隆、测序,结果表明不同木霉REMI转化体和出发菌株T21间该基因序列没有差异,但经荧光定量PCR对HSP24基因转录检测表明,耐高温木霉REMI转化体的热激蛋白HSP24的表达量有所增加,从而表明REMI插入提高了该基因的转录水平。     

李光博院士在迁飞性害虫监测预警中的学术贡献——纪念李光博院士诞辰100周年

我国重大害虫多具有迁飞性,对其进行有效的监测预警在害虫防治中极为重要,本文回顾了李光博院士在重大迁飞性害虫监测预警领域中做出的重要贡献,主要包括：20世纪60年代,在揭示黏虫远距离迁飞规律的基础上创造性地提出黏虫“异地”测报技术,被农业农村部批准列入全国统一测报办法推广应用并传承至今,成为迁飞性害虫预测预报的经典理论;20世纪80年代,李光博院士又领导研究团队将人工智能技术应用到黏虫“异地”测报中,成功研制出黏虫测报专家系统,进一步提高了黏虫的预测预报理论和技术水平。同时也在迁飞性害虫预测预报信息化方面做出新的探索,研发了昆虫飞行数据微机采集分析系统,为昆虫迁飞行为和机理研究提供了有力的技术手段,也为我国迁飞性害虫的监测和治理奠定了坚实的基础。本文还介绍了研究团队在后续研究中,继承和发展李光博院士的学术思想,在昆虫雷达数据采集分析系统的开发研制方面做出新的突破,对未来迁飞性害虫监测预警研究做了展望。     

我国蔬菜害虫生物防治研究进展

我国是蔬菜生产、消费和出口大国,蔬菜害虫是影响蔬菜产量和品质,制约蔬菜产业发展的重要因素。传统化学农药的长期大量使用,不仅造成生态环境污染、影响食品安全,还导致害虫抗药性逐渐增强,因此,生物防治成为害虫综合治理的重要措施。我国生物防治技术经过几十年的发展,在天敌昆虫资源的发掘、应用、技术研发和配套措施等方面取得了显著的进步。本文综述了我国蔬菜害虫生物防治的研究和应用进展,并分析了当前存在的问题和发展趋势,以期为今后的害虫研究和防治提供思路。