大分子拥挤环境中溶菌酶的去折叠过程

【目的】研究不同大分子拥挤体系对盐酸胍诱导的溶菌酶去折叠过程的影响。【方法】以葡聚糖70(Dextran 70)、菲可70(Ficoll 70)、聚乙二醇2000(PEG 2000)作为大分子拥挤试剂,模拟体内高度拥挤的环境,用荧光相图法研究不同大分子拥挤试剂中,有无还原剂2-巯基乙醇存在时,盐酸胍诱导溶菌酶去折叠过程的变化及其特点,探讨大分子拥挤环境对蛋白质去折叠的影响。【结果】Dextran 70、Ficoll 70和PEG 2000 3种大分子拥挤试剂对溶菌酶活性几乎没有影响。无大分子拥挤试剂条件下,溶菌酶从天然态转变为去折叠态的过程中(盐酸胍浓度为0~6.0mol/L),当无还原剂2-巯基乙醇时,溶菌酶的去折叠过程符合"三态模型",有1个中间态;当存在还原剂2-巯基乙醇时,该变性过程则符合"二态模型",不存在任何中间态,溶菌酶可直接从天然态转变为去折叠态。溶菌酶在大分子拥挤体系中变性时,当不存在还原剂2-巯基乙醇,变性过程符合"四态模型",存在2个中间态;而当存在还原剂2-巯基乙醇时,变性过程则符合"三态模型",有1个中间态。【结论】通过添加大分子拥挤试剂,增加了溶菌酶变性过程的中间态,改变了蛋白由天然态到完全去折叠态的变性过程。     

用荧光相图法研究胃蛋白酶的去折叠过程

蛋白质折叠机理的研究是基因重组蛋白质高效生产的前提条件,对于工业化生产重组蛋白以及治疗与蛋白集聚密切相关的疾病都有重要意义。为了探索一个统一的蛋白质折叠机理,用荧光相图法分别对脲和盐酸胍诱导的胃蛋白酶的去折叠过程进行了研究。结果表明,无论变性体系中有无还原剂2-巯基乙醇存在,当脲浓度为0~8.0 mol/L时,脲诱导胃蛋白酶的变性过程都符合"二态模型";而无论变性体系中有无还原剂2-巯基乙醇存在,当盐酸胍浓度为0~6.0 mol/L时,该蛋白的变性过程均符合"三态模型"。     

荧光相图法研究溶菌酶在盐酸胍溶液中的变性

采用荧光相图法分析盐酸胍诱导溶菌酶变性的荧光数据,建立溶菌酶在盐酸胍溶液中失活的变性模型。结果表明,盐酸胍浓度从0.5mol/L变化至3.0mol/L时,溶菌酶从天然态转变为部分折叠中间态,盐酸胍浓度从3.0mol/L变化至6.0mol/L时,溶菌酶从中间态转变为去折叠态。说明盐酸胍诱导溶菌酶变性的过程符合典型的＂三态模型＂。     

大肠杆菌表达重组牛IL-2复性技术的研究

研究了重组牛白介素2复性条件,如pH,蛋白浓度,DTT浓度,氧化剂(GSSG)和还原剂(GSH)的比例,Cu2 及L-Arg,低浓度的盐酸胍的添加,复性方法等。结果表明,复性液中添加20 mmol/mL DTT可以提高rBoIL-2的复性效率;利用尿浓度梯度复性法3.5 mg/mL的rBoIL-2蛋白溶液复性率可达50%以上,测定活性效价达9.6×104IU/mL。     

鸡传染性法式囊病毒VP2原核表达蛋白的纯化和复性

[目的]探讨鸡传染性法式囊病毒(IBDV)VP2原核表达蛋白的纯化和复性。[方法]对原核表达的IBDVVP2蛋白进行可溶性与不可溶性分析,并利用溶菌酶、Triton-100、尿素等试剂进行纯化和复性,对复性前后的蛋白分别与特异性多抗进行Dot-ELISA。[结果]可溶性与不可溶性分析的结果表明,蛋白主要以包涵体形式存在。Dot-ELISA表明,复性后蛋白的反应活性增强了10倍,对复性后的蛋白与IBDV16株单抗进行Dot-ELISA,其中有11株与其发生特异性反应。[结论]复性后的蛋白与鸡传染性法式囊病毒单克隆抗体的反应性明显提高。     

体外重折叠核糖核酸酶A及其荧光结构表征

核糖核酸酶A(RNase A)作为蛋白质体外重折叠研究的模型蛋白,考察了稀释复性过程中脲浓度、稀释倍数、氧化还原环境(GSH浓度和GSH/GSSG比例)、pH值、温度以及聚集抑制剂的添加对该酶活性回收率的影响.在变性蛋白浓度为100 μg·mL-1,复性液含有2 mol·L-1脲,GSH浓度2 mmol·L-1,GSH/GSSG比为4:1,pH8.0,并添加终浓0.1%的PEG,转速为150 r·min-1,温度37℃的条件下复性,RNase A的活力回收率可达70%以上.利用荧光分析法对RNase A复性过程的结构变化进行了表征,在此基础上对RNase A体外重折叠过程蛋白质分子的构象变化以及活性中心的形成过程进行了阐述.     

猪γ干扰素的基因克隆、改造、表达及活性测定

提取经ConA诱导培养的猪外周血白细胞总RNA ,RT -PCR扩增出猪IFN -γ基因并克隆到pGEM -T -easy载体 ,测序结果表明扩增片段是含有信号肽的猪IFN -γ的完整基因。设计 1对引物亚克隆猪IFN -γ成熟蛋白基因并对其5′端前 2个稀有密码子进行大肠杆菌偏嗜性改造。经测序鉴定后插入原核表达载体pRLC ,并实现在大肠杆菌中的高效表达。表达产物以包涵体形式存在 ,经 7mol·L-1盐酸胍的变性液溶解及 0 5mol·L-1盐酸胍复性液复性处理 ,表达产物进行脱盐、凝胶层析纯化。细胞病变抑制法测定结果表明 ,重组猪IFN -γ具有较高的干扰素活性 ,约为 4 5× 10 6U·mg-1。     

等转化率法分析溶菌酶在变性剂影响下的变性过程

利用差示扫描量热法(DSC)研究了溶菌酶在变性剂(乙醇、二甲基亚砜)影响下的变性过程,并用等转化率法对该过程进行了分析。结果表明:在有、无变性剂存在情况下,随着扫描速率的增加,溶菌酶的变性温度都缓慢增加;变性剂可加速溶菌酶的变性过程,降低溶菌酶的热稳定性;其中,乙醇对溶菌酶热稳定性的影响大于DMSO。等转化率法分析表明:溶菌酶在有、无变性剂的条件下,其表观活化能在不同的转化率下未保持不变,而是随转化率增大而减小;溶菌酶的变性过程并不是标准两态可逆过程,而是一个涉及多种蛋白质状态的复杂过程。等转化率法为蛋白质单步或是多步变性过程的研究提供了一种新思路。     

苦荞过敏原TBa和TBb基因的共表达及其包涵体复性的研究

[研究目的]利用大肠杆菌共表达苦荞过敏蛋白的两个亚基,并对表达产物进行包涵体复性研究和免疫学活性分析;[方法]用已构建的表达质pET-28a-TBa和pET-32m-TBb,共转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,利用双抗生素筛选法,获得稳定遗传的双质粒转化子,经IPTG诱导,两个基因在同一宿主菌中共表达,在共表达产物复性过程中,两个亚基互为分子伴侣,相互促进了蛋白质的重新正确折叠;[结果]表迭蛋白以包涵体的形式存在,ELISA检测表明:复性后的蛋白免疫学活性得到了提高;[结论]由此获得了有活性的蛋白质,并且建立了不相容双质粒共表达外源基因和包涵体复性的方法.     

蚕蛹溶菌酶和过氧化物酶活力的研究

[目的]为蚕蛹开发中利用溶菌酶和过氧化物酶提供参考。[方法]以鲜茧为原料,探索了蚕蛹溶菌酶和过氧化物酶2种酶活力的测定方法,并分析了激活对溶菌酶和过氧化物酶活力的影响。[结果]当溶壁微球菌溶液与蚕蛹提取液的比率为2.45:0.15时,测得的溶菌酶活力误差较小;当过氧化氢与蚕蛹提取液的比率为1.0:0.5时,测得的过氧化物酶活力最高,且误差小。对2种酶激活处理前后的活力比较研究发现,在45℃条件下处理30min,常温下放置24h后,蚕蛹溶菌酶活力提高了83.39倍,而过氧化物酶活力变化不大。对高温杀蛹后2种酶的活力测定发现,高温处理后溶菌酶无活力,而过氧化物酶在高温处理的一定时间内仍有活力。[结论]为从蚕蛹中开发利用这2种酶提供了科学数据。     

耐热木聚糖酶xynB_(64)和红色荧光蛋白Dsred2的融合表达及其应用

[目的]耐热木聚糖酶xynB64的表达研究,探讨利用红色荧光蛋白Dsred2标签简便快捷地检测包涵体复性的效率。[方法]构建重组质粒pET42a-xynB64和pET42a-xynB64-Dsred2,利用宿主菌Rosetta(DE3)进行表达,DNS法测定酶活,并检测其荧光强度和尿素复性的包涵体。[结果]红色荧光蛋白Dsred2促进了目的蛋白可溶性表达,重溶包涵体经激发后发射光波长在583 nm,光强度与可溶性大致成正比。[结论]研究表明红色荧光蛋白Dsred2在包涵体复性中可作为报告蛋白,该结果为工业化复性包涵体提供了检测依据。     

菊苣根采后生理及贮藏技术研究

[目的]研究菊苣根在贮藏期间的生理变化,得出菊苣根最佳的贮藏条件,为芽球菊苣的周年供应提供条件。[方法]采用分阶段随机法取样,采用直接滴定法进行总糖和还原糖的测定;参照Bradford的测定方法,以牛血清白蛋白作标准曲线测定可溶性蛋白;统计法计数腐烂率。[结果]在0和-2℃的贮藏条件下,菊苣根中的非还原糖和还原糖含量不尽相同,但总糖的含量(干重)几乎是一样的;两个温度下,菊苣根中可溶性蛋白含量在整个贮藏阶段差异较小;随着贮藏时间的延长,0℃下的菊苣根的腐烂指数越来越大于-2℃下的菊苣根。[结论]-2℃的贮藏条件适于菊苣根更长期的贮藏。     

水稻核黄素合酶基因的克隆、表达及多克隆抗体的制备

核黄素在生物体内发挥着重要的作用,核黄素合酶(RS)是核黄素合成过程中的一个关键酶。本研究克隆了水稻核黄素合酶基因(OsRS),并将其在Escherichia coli中高效表达。表达产物(包涵体),先用6 mol/L盐酸胍将其溶解,再用8 mol/L尿素透析,将获得的蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体。并将抗体与原核表达的OsRS和提取的水稻叶组织总蛋白进行Western blot分析,确定所制备的多克隆抗体具有较好的免疫反应性,为深入解析水稻中核黄素合酶的催化活性和功能奠定了基础。     

尿素缓释剂对茎瘤芥产量和硝酸盐的影响

[目的]探明尿素缓释剂配方的最佳浓度。[方法]选用混合尿素缓释剂2％、3％、4％3个浓度,与肥料混合一次性施入,以常规性2次施肥和1次施肥而不加缓释剂为时照,研究3种浓度的混合尿素缓释剂对茎瘤芥产量和硝酸盐的影响。[结果]混合尿素缓释剂能明显减缓尿素分解,延长供氮期。[结论]一次性施3％混合尿素缓释剂,能明显提高产量,降低硝酸盐含量,增加经济效益。     

胞壁质酶的性质研究

[目的]以提取的胞壁质酶为材料,研究胞壁质酶的性质。[方法]通过测定胞壁质酶在595nm处光吸收值的增量,测定该酶活力和蛋白质浓度。通过测定米氏常数Km,研究酶促反应的速度及影响速度的因素。在不同pH值缓冲液中测定胞壁质酶活力,同时测定该酶的最适pH值。酶促反应的速度在酶的最适温度时达到最大。利用SDS-PAGE电泳法,测定胞壁质酶的分子量及纯度。[结果]胞壁质酶在219.00g/L光吸收下降最快,活力最高。Km为0.57。脲对胞壁质酶为抑制作用,其抑制类型为竞争性抑制。胞壁质酶在pH值为8.0时酶活力最高,属于弱碱性,在40℃时酶活力最高,其Kd为13。[结论]该研究可为今后采用生物工程技术对胞壁质酶进行克隆、提取以及制取提供参考。     

溶菌酶快速诱导蜡样芽孢杆菌L型的研究

[目的]研究溶菌酶诱导蜡样芽孢杆菌L型的技术条件。[方法]利用溶菌酶诱导蜡样芽孢杆菌L型,观察其形成、形态、生长及其对渗透压的敏感性等特性。[结果]在培养基中加入2 mg/ml的溶菌酶能够较好地诱导蜡样芽孢杆菌L型的产生,通过连续的培养获得了稳定的L型蜡样芽孢杆菌。L型蜡样芽孢杆菌呈球状,革兰氏染色阴性,对渗透压敏感。[结论]确定了蜡样芽孢杆菌溶菌酶法诱导L型的最佳浓度。