鸡痘病毒282E4株Bam HI部分片段的重组载体质粒构建与序列分析

在中国鸡痘病毒２８２Ｅ４弱毒株基因组部分ＢａｍＨＩ片段的质粒ｐＵＢ、ｐＵＣ、ｐＵＤ、ｐＵＤ２、ｐＵＥ和ｐＵＦ酶切分析的基础上,对ｐＵＦ进行了亚克隆获得ｐＵＦ－Ｅ和ｐＫＳ－Ｘ,对最可能存在非必需区的ｐＵＥ质粒进行了序列分析,改造了含Ｐ１１Ｐ７．５－ＬａｃＺ报告基因盒,并在上述质粒的相应单一酶切位点插入Ｐ１１Ｐ７．５－ＬａｃＺ报告基因盒,构建成ｐＵＢ１、ｐＵＦＣ１、ｐＵＦＥ１、ｐＵＦ－Ｅ１和ｐＫＳＦ－Ｘ１５个重组载体质粒。体内重组等工作正在进行中。     

鸡痘病毒282E4株Bam HI Fa,Fb,Fc片段非必需区筛选与序列分析

将亚克隆获得的分别含有鸡痘病毒（ Ｆ Ｐ Ｖ） Ｂａｍ Ｈ Ｉ相应片段的 ｐ Ｕ Ｆａ、ｐ Ｕ Ｆｃ 和 ｐ Ｕ Ｆｄ ３ 个质粒的单酶切位点,插入 Ｐ１１ Ｐ７．５ Ｌａｃ Ｚ报告基因盒,构建成 ｐ Ｕ Ｆａ１、ｐ Ｕ Ｆｃ１ 和 ｐ Ｕ Ｆｄ１ ３ 个重组载体质粒,在脂质体存在条件下,同 Ｆ Ｐ Ｖ 共同转染鸡胚成纤维细胞（ Ｃ Ｅ Ｆ）,９６ ｈ 后在 Ｘｇａ１ 存在条件下挑选蓝色重组病毒空斑,经３ 次空斑纯化和传代,获得 １ 株可稳定表达 β半乳糖苷酶的重组病毒,并对该重组用质粒作了序列分析。     

鸡痘病毒282E4株基因组3.6kb Bam HI片段序列测定与分析

本实验将我国FPV282E4 株基因组3 .6kb BamHID片段利用DNA测序仪进行了序列测定。经DNASISV3.0 分析,该片段A T含量为60.77 % ,内含有8 个主要的ORFS。用Goldkey V3.0 软件比较了VVP7.5 早期启动子,FPV4b 晚期启动子、L2R早/晚期启动子和一个早/ 晚期双向启动子与各个ORF上游100bp 区域的同源性,没有发现有意义的同源序列;该片段的核苷酸序列和每个ORF所编码的氨基酸序列在EMBL核酸序列库和蛋白质序列库(Swiss_PROT) 中没有找到有意义的同源序列。初步认为该片段可能是基因组中一段非必需区或非编码区     

鸡痘病毒282E4株基因组2.9 kb Bam HI片段的序列测定与分析

对我国鸡痘病毒（ＦＰＶ）２８２Ｅ４株基因组２．９ｋｂ Ｂａｍ ＨＩ片段进行了序列测定与分析。结果表明,该片段全长２９２３ｂｐ,Ａ＋Ｔ含量为７２．０８％,含６个完整的开放读码框架（ＯＲＦ）和２个不完整的ＯＲＦ,最大的ＯＲＦ所编码多肽的相对分子质量为２４６００。在２个ＯＲＦ在上游存在痘苗病毒晚毒启动子的保守序列ＴＡＡＡＴ,在６个ＯＲＦ的下游和２个ＯＲＦ的编码区内存在痘苗病毒早期转录终止信号Ｔ５ＮＴ。把     

鸡痘病毒282E_4株TK基因重组载体质粒的构建

应用已克隆的鸡痘病毒（ＦＰＶ）２８２Ｅ＿４株基因组ＴＫ基因，在ＮｃｏⅠ部位引入痘苗病毒Ｐ７．５启动子和Ｐ１１启动子控制下的大肠杆菌ＬａｃＺ基因，经酶切鉴定，成功地构建了用于ＦＰＶ重组的载体质粒。与亲本毒株在鸡胚成纤维细胞内共转染，产生了表达ＬａｃＺ基因的重组鸡痘病毒。经传代筛选、纯化，重组病毒较稳定。实验结果表明，以ＴＫ基因构建的重组载体质粒可用于外源基因的重组表达研究。     

鸡痘病毒282F4弱毒株基因组BamHI片段的克隆与分析

采用鸟枪法克隆鸡痘病毒基因组ＢａｍＨＩ部分片段，用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－ｄＵＴＰ标记的ＦＰＶ２８２Ｆ４弱毒株ＢａｍＨＩ片段探针点杂交，证实２２个克隆插入了ＦＰＶ２８２Ｅ４弱株ＤＮＡ的ＢａｍＨＩ片段，选取具代表性的大小不同的６个质粒ｐＵＡ、ＰｕＢ、ｐＵＣ、ｐＵＤ、ｐＵＥ、ｐＵＦ。     

鸡痘病毒282E4株TK基因且载体质粒的构建

应用已克隆的鸡痘病毒２８２Ｅ４株基因组ＴＫ基因，在ＮｃｏＩ部位引入痘苗病毒Ｐ７．５启动子和Ｐ１１启动子控制下的大肠杆菌ＬａｃＺ基因，经酶切鉴定，成功地构建了用于ＦＰＶ重组的载体粒。     

鸡痘病毒282E_4株基因组2.9kbBamHI片段的序列测定与分析

对我国鸡痘病毒 ( FPV) 2 82 E4株基因组 2 .9kb Bam HI片段进行了序列测定与分析。结果表明 ,该片段全长 2 92 3 bp,A T含量为 72 .0 8%,含 6个完整的开放读码框架 ( ORF)和 2个不完整的 ORF,最大的ORF所编码多肽的相对分子质量为 2 4 60 0。在 2个 ORF的上游存在痘苗病毒晚期启动子的保守序列TAAAT,在 6个 ORF的下游和 2个 ORF的编码区内存在痘苗病毒早期转录终止信号 T5NT。把该片段的核苷酸序列和每个 ORF所编码的氨基酸序列分别对 EMBL核酸序列库和 SWISS-PROT蛋白质序列库进行了同源性搜索 ,未发现同源性片段     

鸡痘病毒282E4弱毒株TK基因限制性酶切图谱分析

以限制性内切酶ＢａｍＨＩ、Ｘｂａｌ、Ｃｌａｌ、Ｈ１ｎｄⅢ、Ｎｃａｌ对含有鸡痘病毒（ＦＰＶ）２８２Ｅ４弱毒株３．７ｋｂＨｉｎｄⅢＴＫ基因片段的重组质粒ｐＳＬ１进行单酶和它们之间双酶酶切。结果表明：３．７ｋｂＨｉｎｄⅢＴＫ基因片段上有２个Ｃｌａｌ切点，２个Ｘｂａｌ切点，１个Ｎｃａｌ切点，没有ＢａｍＨＩ切点。随后，用澳大利亚ＦＰＶ２．２ｋｂＨｉｎｄⅢ＋ＣｌａｌＴＫ基因作探针，对各种酶切片段进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，进一步确定ＴＫ基因位于２．２ｋｂＨｉｎｄⅢ＋Ｃｌａｌ片段中。杂交结果与限制性酶切图谱分析结果相一致。该基因的限制性酶切图谱与澳大利亚ＦＰＶ疫苗株的基本相同。     

鸡痘病毒282E4株2.2kbTK基因序列分析

将鸡痘病毒２８２Ｅ４弱毒株基因组中的３．７ｋｂＨｉｎｄⅢ片段克隆到ＫＳ（－）质粒中，亚克隆后，获得含ＴＫ基因正反方向插入的２．２ｋｂＨｉｎｄⅢ－ＣｌａＩ片段的质粒ｐＫＦＡ和ｐＫＦＢ，进而构建出正反方向的系列嵌套缺失质粒。用Ｔ７、Ｔ３引物所做的核苷酸序列分析表明，２．２ｋｂＨｉｎｄⅢ－ＣｌａＩ ＴＫ基因序列长为２１５９ｂｐ，含有两个完整的读码框架（ＯＲＥ）Ｘ和ＴＫ，并确证了ＴＫ基因内存在单一酶切点Ｎ     

鸡传染性支气管炎病毒国内分离株核蛋白基因的克隆与序列分析

本研究参考已发表的鸡传染性支气管炎病毒核蛋白基因序列，设计了一对核蛋白基因的特异性引物NP5、6，经RT-PCR扩增得到了IBV国内分离株DB株、XJ株、DC株、HD株的1199bp的核蛋白基因片段，并进行了克隆和序列测定。将4个国内分离株核蛋白基因的序列与国外发表的参考毒株的核蛋白基因序列进行了比较和分析，结果显示这4个毒株与澳大利亚群的参考毒株亲缘关系最为密切，核苷酸序列同源性86%-91%。其中DC株发生了较大程度的变异。国内分离株核蛋白基因核苷酸的变异引起了蛋白质二级结构的部分改变。     

鸡传染性支气管炎病毒广西株N基因的克隆与序列分析

参照Gen Bank中鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的核酸序列设计了1对引物,利用RT-PCR扩增了1个广西分离株的N基因cDNA片段,并将其克隆到p MDl8-T载体中。序列分析结果表明,N基因序列全长为1 230 bp,编码1条409个氨基酸组成的多肽;分离株与国内外IBV参考毒株相比,核苷酸同源性为83.8%~99.9%,氨基酸同源性为88.4%~99.6%;分离株与LX4株、BJ株关系较近,与疫苗株处于不同的进化分支,亲缘关系较远,是新的IBV变异株。     

鸡传染性支气管炎病毒广西株M基因的克隆与序列分析

参照GenBank中鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的核苷酸序列设计1对引物,利用 PCR 扩增IBV广西株的M基因片段,将其克隆到pMD18-T载体中.序列分析结果表明,M基因全长为678 bp,编码225个氨基酸,近N端含有2个潜在的N-糖基化位点,3个跨膜区位于23—98肽段区,亲水区较疏水区更易变异.IBV广西株与国内外IBV参考毒株相比,核苷酸序列同源性为83.6%~92.5%,氨基酸序列同源性为82.7%~95.1%.系统进化分析结果显示IBV广西株与SAIB20和LX4两参考株位于同一个分支上,它们的亲缘关系较近,而与其他参考株属于不同的分支,亲缘关系较远.结果表明IBV广西株是1株新的IBV变异株.     

禽流感病毒A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)NA基因的克隆及其重组禽痘病毒转移载体的构建

采用RT－PCR技术扩增了禽流感病毒A／Guangdong/3/96(H5N1)[GD3/96]神经氨酸酶（NA）基因，并将其克隆到pUC18质粒中进行测序。核苷酸序列测定结果为：NA基因全长为1410bp，共编码469个氨基酸，从pUCNA中切下NA基因片段，将其亚克隆到质粒pSY538的EcoR I位点，将带有痘苗病毒启动子P11的LacZ基因平端克隆到该质粒的Sma I位点，然后切下同位含有NA及LacZ基因的片段，再亚克隆到禽痘病毒载体pSY681的Not I位点，经限制性内切酶分析，PCR鉴定等，证明含有禽流感病毒NA基因的重组禽痘病毒转移载体已构建成功，从而为进一步筛选表达NA蛋白的重组禽痘病毒及探讨该蛋白的免疫原性鉴定了实验基础。     

鸡传染性喉气管炎病毒王岗株gE基因的克隆及序列分析

根据鸡传染性喉气管炎病毒（AILTV）美国农业部（USDA）标准毒株的基因序列，在ALITV gE基因起始密码子上游和终止密码子下游设计了1对引物pAL1和pAL2。以AILTV王岗株DNA为模板，进行PCR扩增，得到约1.5kb的片段，经酶切鉴定为AILTV gE基因。将此PCR产物与pUC19质粒载体用限制性内切酶Pst I消化、连接，转化JM83大肠埃希氏菌感受态细胞，用限制性内切酶酶切和PCR方法鉴定阳性重组质粒pRHE。对其进行测序后，与AILTV USDA标准攻毒株的gE基因序列进行比较，发现其核苷酸同源性为99．5％，所编码氨基酸的同源性为99．2％。     

鸡痘 病毒282Ｅ4株基因组3.6kb BamHI片段序列测定与分析

本实验将我国ＦＰＶ２８２Ｅ４株片段利用ＤＮＡ测序仪进行了序列测定。经ＤＮＡＳＩＳＶ３．０分析,该片段Ａ＋Ｔ含量为６０．７７％,内含有８个主要的ＯＲＦs。用ＧoldkeyＶ３．０软件比较了ＶＶＰ７．５早期４启动子,ＦＰＶ４b晚期启动子．Ｌ２Ｒ早/晚期启动子和一个早/晚期启动子与各个ＯＲＦ上游１００bp区域的同源性,没有发现有意义的 同源序列;该片段的核苷酸序列和每个ＯＲＦ所编码的氨基酸序列在ＥＭＢＬ核酸序列库和