拟南芥花组织高表达TCP家族转录因子At1g30210的克隆与转录激活活性鉴定

本文从拟南芥中克隆到基因At1g30210的全长读码框。多序列比对结果表明,在推导的氨基酸水平上,该基因编码的蛋白含有特征性的TCP保守结构域,与已知的玉米、金鱼草和水稻的TCP家族基因中都存在显著性的保守性。另外通过酵母单杂交实验证明该基因编码的蛋白在酵母体内具有转录激活功能。同时RT-PCR实验结果表明,该基因在拟南芥花组织中表达量相对较高,具有明显的组织表达特异性。花器官高表达转录因子的克隆将为研究TCP基因调控植物花发育和花形态建成提供新的物质基础。     

拟南芥花组织高表达TCP家族转录因子Atlg30210的克隆与转录激活活性鉴定

本文从拟南芥中克隆到基因Atlg30210的全长读码框。多序列比对结果表明，在推导的氨基酸水平上，该基因编码的蛋白含有特征性的TCP保守结构域，与已知的玉米、金鱼草和水稻的TCP家族基因中都存在显著性的保守性。另外通过酵母单杂交实验证明该基因编码的蛋白在酵母体内具有转录激活功能。同时RT—PCR实验结果表明，该基因在拟南芥花组织中表达量相对较高，具有明显的组织表达特异性。花器官高表达转录因子的克隆将为研究TCP基因调控植物花发育和花形态建成提供新的物质基础。     

拟南芥TCP家族转录因子At2g31070的转录激活活性鉴定与表达谱分析

TCP家族转录因子是植物所特有的转录因子家族,它主要在分生组织中起作用,与细胞分化和生长有很大联系。我们以哥伦比亚野生型拟南芥为模板得到基因At2g31070的全长ORF,生物信息学分析结果表明它具有TCP家族保守结构域,属于TCP家族的转录因子。以拟南芥成株不同组织的RNA为模板进行RT—PCR实验,结果发现较之其它组织,该基因在花中有比较高的表达量;通过酵母单杂交实验鉴定该基因具有转录激活活性。综合以上结果,我们认为At2g31070基因在拟南芥花形成发育的过程中发挥转录因子的作用,在一定程度上调控和影响了这个过程。     

芥菜锌指蛋白转录因子基因Bj26的克隆与鉴定

锌指蛋白是一类重要的转录因子家族,参与植物基因转录调节、发育及胁迫反应等生理过程。我们前期研究发现芥菜诱导型启动子BjC-P的W-box-like-4为其真菌诱导的核心元件,本研究通过酵母单杂交技术从芥菜cDNA文库中筛选到与W-box-like-4序列特异互作的转录因子基因Bj26。生物信息学分析表明,Bj26含735 bp的开放阅读框,编码一个新的C2H2型锌指蛋白,包括2个典型的C2H2型锌指结构及2个植物特有的QALGGH氨基酸保守序列,等电点pI为9.2,分子量为26.6 kD。亚细胞定位显示该蛋白位于细胞核。本氏烟瞬时表达分析表明Bj26蛋白通过与BjC-P的真菌诱导核心元件序列特异互作,激活启动子BjC-P。实时荧光定量PCR结果显示Bj26在真菌诱导下表达量明显增高。Bj26的CDS序列与拟南芥和水稻中的C2H2型锌指蛋白序列比对及进化树分析表明,Bj26与拟南芥的C2H2型蛋白同源性高于水稻。以上结果揭示Bj26蛋白可能介导BjC-P真菌诱导响应并参与植物抗真菌病原菌的调控过程。     

棉花纤维特异转录因子GhMADS9的克隆及功能初步分析

从快速伸长的纤维细胞中克隆到了一个转录因子,通过序列比对发现其具有典型的MADS-box结构域,命名为GhMADS9。进化树分析表明GhMADS9属于典型的MIKC类MADS转录因子,与在拟南芥胚中高表达的转录因子AGL15亲缘关系最近。RT-PCR和原位杂交试验表明GhMADS9在纤维细胞中特异表达。酵母单杂交试验证明GhMADS9具有转录因子激活活性。继续研究GhMADS9对下游基因的调节机制有利于更加深入地了解棉纤维发育机制。     

利用酵母单杂交筛选拟南芥AtSTK基因表达调控蛋白的研究

拟南芥丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因AtSTK的过量表达可以明显提高拟南芥的耐盐性。为进一步研究AtSTK基因表达的调控机制,以拟南芥基因组DNA为模板设计引物,扩增获得AtSTK基因的启动子序列,并构建到报告载体pAbAi,将重组报告载体质粒pAbAi-HYT利用BstbⅠ进行单酶切线性化,转化酵母菌株Y1H Gold,线性化的pAbAi-HYT整合到基因组中。然后,将纯化的拟南芥双链cDNA、pGADT7-Rec载体共转化含有报告载体pAbAi-HYT的酵母菌,将菌液涂布到含有100 ng/m L Ab A的SD/-Leu培养基上进行阳性克隆的酵母单杂交筛选。通过回复鉴定、序列测定,最终筛选获得了可能参与AtSTK基因表达调控的4个拟南芥基因。测序结果表明,酵母单杂交筛选获得的拟南芥基因AT3G32090含有WRKY转录因子保守结构域,为WRKY类转录因子的一员。因此,AtSTK基因的表达很可能接受MAPK信号传导途径中AT3G32090基因编码的WRKY类转录因子的调控,从而影响拟南芥植株的耐盐性。     

苦荞麦FtWRKY6基因的克隆及其在低磷与激素诱导下根中的表达分析

WRKY转录因子是植物非生物胁迫反应中的重要调节子。荞麦耐贫瘠，磷利用率较高。为了探究WRKY基因在荞麦磷饥饿反应中可能的调节作用，以苦荞麦为材料，采用逆转录PCR方法，从低磷处理的根RNA样品中获得了FtWRKY6基因的编码序列。FtWRKY6 cDNA长1 572 bp,编码524个氨基酸，含有2个典型的WRKY保守结构域，锌指类型为C₂H₂,归属于第Ⅰ类WRKY,与绿茶CsWRKY24在氨基酸水平上的同一性较高(55.5%)。拟南芥原生质体瞬时表达分析表明，FtWRKY6定位于细胞核中；酵母单杂交试验表明，FtWRKY6具有转录激活活性。实时荧光定量PCR分析表明，在根中FtWRKY6的表达受低磷和3种重要的低磷反应相关激素—吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA)和细胞分裂素(CTK)显著诱导。上述结果提示，FtWRKY6具有转录因子的基本结构与生化特征，在根中可能通过IAA、GA、CTK信号通路的交互作用介导苦荞麦在低磷条件下的响应过程。     

苹果MdPIF4基因克隆、表达与功能验证

温度是影响植物生长发育重要的环境因子之一,光敏色素互作因子PIF4是植物响应温和高温的核心基因,明确MdPIF4在苹果温度响应中的作用具有重要意义。本研究克隆了MdPIF4的编码区和启动子序列,分析了MdPIF4的表达情况,对MdPIF4转录激活活性进行了分析和互作蛋白筛选,并在野生型拟南芥中异源过表达了MdPIF4。结果显示:MdPIF4基因编码区包含1 656 bp的核苷酸,编码551个氨基酸,预测其蛋白质分子质量为60 670.87 Da,等电点为6.63。MdPIF4在苹果叶片中的表达量最高,其次为根、茎、花,在果实中的表达量最低。MdPIF4启动子中含有光响应元件、ABA(脱落酸)响应元件ABRE、SA (水杨酸)响应元件TCA-element、厌氧调节响应元件ARE、干旱响应元件MBS等。MdPIF4受温和高温诱导表达。不同物种间bHLH结构域的蛋白序列保守性较强,MdPIF4序列全长在酵母中具有转录自激活活性,bHLH结构域在酵母中没有自激活活性,其余片段均具有自激活活性。以bHLH结构域为诱饵蛋白,酵母双杂交筛库获得3个互作蛋白,分别为Md WRKY70、MdHAT5和MdRab11D。在野生型拟南芥中过表达MdPIF4促进了拟南芥幼苗下胚轴的生长。上述研究表明MdPIF4参与苹果温和高温响应。     

陆地棉基因GhWRKY40-1的克隆及表达分析

【目的】WRKY转录因子通过激活下游一系列抗逆应答基因的表达而提高植株的综合抗性。本研究旨在研究WRKY转录因子在陆地棉中的功能。【方法】通过基因芯片筛选鉴定出1个逆境诱导的陆地棉WRKY转录因子基因,由于此基因编码蛋白含有1个典型的WRKY结构域,且与拟南芥At WRKY40具有较高相似性,故命名为GhWRKY40-1。采用电子克隆及反转录-聚合酶链反应技术获得GhWRKY40-1基因c DNA全长,并对其进行序列分析及结构与功能预测。【结果】GhWRKY40-1的开放阅读框为981 bp,编码326个氨基酸,预测蛋白相对分子质量为35.78×103,等电点为8.39。GhWRKY40-1在拟南芥原生质体中瞬时表达定位于细胞核,且具有转录激活活性。RT-PCR结果表明,GhWRKY40-1受甘露醇诱导上调表达。【结论】推测GhWYKY40-1可能参与干旱胁迫应答反应,并且在植物逆境胁迫中发挥重要作用。上述分析为进一步从分子水平上验证其抗逆生物学功能以及揭示棉花非生物胁迫抗逆机制奠定了基础。     

野生大豆转录因子GsNAC20基因的分离及胁迫耐性分析

NAC (NAM, ATAF1/2, CUC2)转录因子作为一类新型转录因子已成为非生物胁迫基因工程领域的研究热点。本研究以野生大豆(Glycine soja)为材料,利用酵母单杂交的方法筛选到一个能够与MYB1AT元件(核心序列为AAACCA)结合的转录因子基因,该基因与大豆NAC20 (EU440353.1)基因具有99%的相似性,命名为GsNAC20。GsNAC20蛋白含有典型的NAC结构域和转录激活区。酵母试验表明,GsNAC20转录因子能够与耐逆相关顺式元件MYB1AT特异结合,但不具有自激活功能。细胞定位分析证明该基因位于细胞核中,符合转录因子的特征。GsNAC20能够响应高盐、干旱和低温胁迫,并且在根和叶中具有不同的表达模式。超量表达GsNAC20基因的拟南芥对盐胁迫的敏感性提高。以上结果表明GsNAC20参与植物非生物胁迫反应过程,该基因在非生物胁迫基因工程研究领域具有良好的理论研究和实际应用价值。     

酵母表面展示系统的改进及其在筛选烟草PMT基因启动子结合蛋白中的应用

筛选DNA结合蛋白常用的酵母单杂交系统在应用中有时会因内源干扰而影响筛选结果。与之相比,酵母表面展示系统(yeast surface display system)将外源蛋白展示在细胞表面,可通过接近体外实验的方法筛选DNA结合蛋白,能在一定程度上避免酵母内源干扰,但是,该系统在DNA结合蛋白筛选研究中的应用还很有限。本研究对酵母表面展示系统常用载体pYD1进行改造,使其与Clontech公司的Smart cDNA文库构建系统相匹配,提高了cDNA酵母表面展示文库的构建效率,并通过比较试验建立了一个以酵母表面展示系统筛选DNA结合蛋白的试验体系。在以酵母单杂交筛选烟草腐胺甲基转移酶基因PMT (putrescine N-methyltransferase)启动子结合蛋白的研究中,其茉莉素信号应答元件GAG片段是一段筛选效率极低的DNA片段。本研究利用改进的酵母表面展示系统对GAG片段的DNA结合蛋白进行了筛选,并获得若干烟草蛋白基因,其中包括2个可能结合GAG片段的ERF (ethylene responsive factor)转录因子。进一步研究发现,这2个ERF转录因子可与GAG片段在体外结合,但不能在酵母单杂交系统中激活由GAG片段操纵的报告基因表达。本研究也证明酵母表面展示系统可有效克服酵母内源干扰,弥补酵母单杂交系统在筛选易受酵母内源干扰DNA结合蛋白方面的不足。     

中间锦鸡儿CibHLH93基因克隆及表达分析

b HLH属于转录调控因子中的一个大家族,广泛存在于真核生物界,因具有保守性较高的b HLH结构域而得名。b HLH以二聚体形式特异性结合于DNA靶位点,调控多样化的生物过程,对真核生物的生长发育和次生代谢必不可少。植物中,b HLH转录因子通过与其他转录因子互作激活胁迫基因的表达,从而使植物免受非生物胁迫带来的伤害。本研究从实验室干旱转录组数据库中,得到一条中间锦鸡儿b HLH基因全长序列。序列分析显示该基因的开放阅读框为999 bp,编码332个氨基酸。比对分析结果发现其推导的氨基酸序列具有b HLH保守结构域,与拟南芥b HLH93蛋白一致性为68%,将其命名为Cib HLH93。实时荧光定量PCR结果显示,Cib HLH93受到Na Cl、冷、热和脱水的诱导,表达量随处理时间延长呈下降趋势,推测该基因在响应非生物胁迫过程中是一个下调基因。拟南芥叶肉原生质体瞬时表达实验表明,Cib HLH93主要定位于细胞核。以上结果,为进一步揭示Cib HLH93功能的研究提供了基础。     

植物的化学诱导表达系统

利用植物内源性化学诱导启动子或其它生物的化学诱导响应元件都可以在植物中构建化学诱导表达系统.化学诱导表达系统可以分为去抑制、失活、激活三种,三种方式的原理相似,需要两个转录单位组成,第一个转录单位由一个组成型启动子(如CaMV 35S)转录一个对化学诱导剂敏感的转录因子,第二个转录单位含有多个能结合转录因子的位点与一个基本植物启动子(如截短的CaMV 35S)组成的嵌合型启动子调控目的基因的表达.构建双元调控系统可以克服单元系统的不足.文章叙述了一些已构建的化学诱导系统的特征和局限性,阐明了理想化学诱导表达系统的要求和理想化学诱导剂的条件.指出化学诱导系统的应用是很有前途的.     

GbTCP5与GbGL3启动子中TCP顺式作用元件的结合特性分析

TCP转录因子是参与植物生长发育的特异性家族蛋白,但是棉花TCP转录因子家族中的大多数成员功能尚不清楚。为了定位GbTCP5转录因子调控的靶基因,本研究通过Plant CARE在线网站分析棉花纤维发育基因GbGL3上游3 000 bp启动子中的顺式作用元件,构建含有TCP顺式作用元件的载体PHISII-GbGL3和酵母表达载体p GADT7-GbTCP5,通过酵母单杂交分析GbTCP5与GbGL3启动子中TCP顺式作用元件的结合特性。结果表明：GbGL3上游3 000 bp启动子中包含TCP顺式用作元件和功能各异的顺式作用元件,酵母单杂交实验结果表明GbTCP5能够与GbGL3启动子中含有的TCP顺式用作元件结合。本研究为进一步了解GbTCP5转录因子的功能提供依据。     

橡胶树原生质体的分离及红色荧光蛋白的瞬时表达研究

目的：分离巴西橡胶树松散愈伤组织原生质体,建立目标基因在橡胶原生质体的瞬时表达系统。方法：以巴西橡胶树松散愈伤组织为材料,酶解分离原生质体,通过电击介导的转化方法,将编码红色荧光蛋白（RFP）的植物表达载体转入原生质体中,用激光扫描共聚焦显微镜检测原生质体中RFP的表达情况。结果：分离出大量高纯度的橡胶原生质体,成功获得转基因原生质体细胞,RFP在原生质体中得到成功表达。初步建立了橡胶原生质体瞬时表达系统。     

植物的化学诱导表达系统

利用植物内源性化学诱导启动子或其它生物的化学诱导响应元件都可以在植物中构建化学诱导表达系统。化学诱导表达系统可以分为去抑制、失活、激活三种，三种方式的原理相似，需要两个转录单位组成，第一个转录单位由一个组成型启动子(如CaMV 35S)转录一个对化学诱导剂敏感的转录因子，第二个转录单位含有多个能结合转录因子的位点与一个基本植物启动子(如截短的CaMV 35S)组成的嵌合型启动子调控目的基因的表达。构建双元调控系统可以克服单元系统的不足。文章叙述了一些已构建的化学诱导系统的特征和局限性，阐明了理想化学诱导表达系统的要求和理想化学诱导剂的条件。指出化学诱导系统的应用是很有前途的。     

利用Gateway克隆技术大规模克隆拟南芥转录因子

随着越来越多基因组全序列的测定完成,基因组的研究进入了功能研究阶段。功能基因组的研究需要把大量基因连入不同载体,传统的酶切连接构建载体的方法不能满足这种大规模克隆的需要。Gateway技术是一种高效的大规模克隆系统,而且对载体和宿主没有依赖性。本文利用Gateway大规模克隆技术将16个拟南芥转录因子的ORF克隆入植物表达载pPTV和酵母表达载体pYTV中,酵母融合表达实验和Westem-blot检测证明了该克隆途径的可行性,并且得到的His-Tag融合蛋白,为拟南芥转录因子的大规模蛋白质组学研究奠定了良好的基础,同时基因序列的聚类分析为将来进一步的功能研究提供了有利信息。     

利用酵母表达质粒检测甜菜黄化病毒蛋白质间相互作用的遗传学研究

利用酵母双杂合体系统,检测与植物线状病毒组中热休克蛋白ＨＳＰ７０相结合的其它相关的ＢＹＶ蛋白。在体外构建两种编码融合蛋白的酵母表达质粒：一组为将编码转录激活区域的基因与ＨＳＰ７０ｒ基因融合并克隆到ｐＡＣＴ质粒中,它编码转录激活区域与ＨＳＰ７０蛋白的融合蛋白;另一组为将编码ＤＮＡ结合区域的基因分别与甜菜黄化病毒基因组其它７个基因融合并克隆到ｐＡＳ质粒中,分别编码７个融合蛋白。经两质粒共转化酵母细胞后     

拟南芥长链脂肪醇氧化酶(AtFAO3)在抗病防卫反应中的作用分析

长链脂肪醇氧化物酶(FAO)基因编码一个与膜结合,包含黄素,产生H_2O_2的长链脂肪醇氧化酶.在拟南芥基因组中包含4个FAO同源基因.然而,拟南芥FAO在响应非生物和生物环境胁迫中起何种作用还不得而知.本研究中,我们分析了拟南芥AtFAO3在植物防卫病原细菌Pseudomonas syringae pathovar(pv.)tomato strain DC3000(Pst DC3000)中的作用.拟南芥原生质体细胞瞬时表达AtFAO3偶联GFP融合蛋白表明,AtFAO3定位于细胞膜.与野生型植株相比,拟南芥AtFAO3基因T-DNA插入突变体Atfao3在正常条件叶片中H_2O_2含量下降,在氧胁迫或生物胁迫下积累活性氧含量减少.接种病原细菌Pst DC3000后,与野生型植株相比,Atfao3突变体体内细菌繁殖数量增加,叶片病害症状加重,防卫相关基因PR1、PR2和PAL表达减弱.我们基于以上T-DNA突变体分析结果表明,AtFAO3在植物对病原细菌防卫中起重要作用.