牛精子蛋白质组的双向电泳和质谱鉴定初步研究

通过建立牛精子双向电泳-质谱鉴定研究平台,为从蛋白质水平研究精子生理机能奠定技术基础;采用改进的热TRIzol法裂解精子细胞制备蛋白,应用双向凝胶电泳(2-DE)分离牛精子蛋白,通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定蛋白质点.得到了重复性较好的牛精子2-DE图谱,质谱鉴定16个蛋白质点.建立牛精子双向电泳-质谱鉴定研究平台,为后续牛精子X、Y差异蛋白点的检测和分析奠定了理论和技术基础.     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测蛋白质分子量的优化研究

【目的】研究采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术检测蛋白质分子量的优化条件。【方法】选择3种不同的基质检测牛血清白蛋白（BSA）的分子量,在选定最佳基质化合物的基础上,通过改变样品蛋白质的浓度,以获得高质量的质谱峰图,确定蛋白质样品的最小和最优检测量。【结果】1 μg蛋白质样品与10 mg/mL含0.1%乙酸（TFA）和50%乙腈（ACN）的芥子酸（SA）基质水溶液混合检测分子量,可产生最高质量的MALDI-TOF-MS峰图,同时蛋白质样品最小检测量应不少于500 ng。【结论】MALDI-TOF-MS技术操作简单、分析快速、灵敏度高,是一种检测蛋白质分子量的可靠方法;研究结果确定了获得最优化质谱峰的最佳组合,这是从高度复杂的蛋白质样品测定准确分子量的必备条件。     

渗透胁迫诱导转Cu/Zn SOD和APX基因甘薯根系差异蛋白质组学研究

【目的】利用蛋白质组学手段,研究短期渗透胁迫条件下,转Cu/Zn SOD和APX基因甘薯(T)及非转基因甘薯(NT)根系蛋白质的表达差异。【方法】以水培转Cu/Zn SOD和APX基因甘薯(T)及非转基因甘薯(NT)根系为材料,用100g/L PEG6000渗透胁迫处理24h,以未胁迫的NT为对照,提取根总蛋白,进行双向电泳分离,考染法凝胶染色,扫描凝胶图像用于软件检测。【结果】在T、NT和对照中分别检测到836,812,881个蛋白点;t测验发现,与对照相比,T和NT有34个蛋白点丰度发生1.5倍以上显著变化(P<0.05,Fold>1.5,Quality>80)。经基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析,34个差异表达蛋白点中23个得到了有效鉴定。在鉴定的23个蛋白中,有10个蛋白在T和NT中共同上调或下调表达,包括ATP合酶F1β亚基、烯醇酶、26S蛋白酶体调节亚基6、ACC合成酶2等;另外13个蛋白在T和NT中表达各异,包括核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶结合蛋白β亚基和蔗糖合成酶等。【结论】10个在T和NT中共同上调或下调表达的蛋白,是甘薯应答渗透胁迫的普遍应答蛋白,反映了T和NT根系对短期渗透胁迫共同的响应机制;另外13个在T和NT中表达各异的蛋白,表明转基因使甘薯根系蛋白质在短期渗透胁迫下表现出特异的响应机制。     

MALDI-TOF MS在不同禽肉动物源性成分检测中的研究

[目的]建立基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)技术检测不同禽肉动物源性成分的方法,构建不同禽肉蛋白质分子指纹图谱标准数据库,对不同禽肉进行鉴别。[方法]样品用磷酸盐缓冲液提取,净化后用MALDI-TOF MS法测定。采用ChemPattern软件对不同禽肉蛋白图谱进行化学计量学分析,建立识别模型。[结果]鸡、鸭、鹅3种不同禽肉之间具有明显差异。首次建立不同禽肉蛋白质分子指纹图谱标准数据库,可一次性对每个样品中鸡、鸭、鹅等肉源性成分进行同时分析。[结论]建立的基于蛋白质组学的鸡、鸭、鹅源性成分鉴定系统具有简便、稳定、准确、重现性好的优点,适用于不同禽肉中鸡鸭鹅动物源性成分的鉴别。     

大豆质核互作雄性不育系NJCMS1A及其保持系的花药差异蛋白质组学研究

 【目的】对大豆质核互作雄性不育系NJCMS1A及其同型保持系NJCMS1B的二胞花粉期花药进行差异蛋白质组学研究，探讨大豆质核互作雄性不育的分子机制。【方法】采用双向凝胶电泳技术对其蛋白质进行分离，凝胶用考马斯亮蓝染色，使用PDQuest软件分析蛋白质图谱，利用基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术对差异表达蛋白进行质谱分析，获得肽质量指纹图谱，用Profound和Mascot软件搜索NCBInr数据库，初步鉴定差异表达蛋白并分析其功能。【结果】 在分子量18.4～116.0 kD、等电点4～7线性范围内，检测到约212个蛋白点，差异表达蛋白点24个。其中10个在NJCMS1A 中出现而在NJCMS1B中缺失，12个在NJCMS1A中缺失而在NJCMS1B中出现，2个表达量在NJCMS1B中比在NJCMS1A中明显增强。鉴定出11个差异表达蛋白，其中7个在NJCMS1A中出现而在NJCMS1B中缺失，4个在NJCMS1A中缺失而在NJCMS1B中出现。【结论】对主要差异表达蛋白如ACC氧化酶、半胱氨酸蛋白酶、V型H+-ATP酶A亚基、MADS盒蛋白、淀粉分枝酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶等进行功能分析，推测不育系NJCMS1A雄性不育性可能与能量代谢紊乱、细胞程序化死亡（PCD）、乙烯过度合成、淀粉合成受抑制和花器官发育调节基因作用失控等有关。     

基于MALDI-TOF/TOF技术的单增李斯特菌四种血清型的快速鉴别

单增李斯特菌是一种重要的人畜共患病致病菌,其传统血清型鉴定方法具有耗时长、操作繁琐等缺点,现行的多重PCR方法无法精确判定其血清型。基于基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF）的快速、准确、高通量等特点,应用该技术建立了单增李斯特菌4种血清型的鉴别方法,以实现食品样品中单增李斯特菌4种血清型的高通量快速甄别。采用优化的MALDI-TOF/TOF条件对4种血清型的单增李斯特菌标准菌株和分离菌株进行检测,发现单增李斯特菌4种血清型的质谱特征峰。选取最优的支持向量机算法,建立基于1/2a、1/2b、1/2c和4b血清型差异的判别模型,运用该模型鉴别4种血清型的单增李斯特菌。初步建立了单增李斯特菌4种血清型的MALDI-TOF/TOF快速鉴别方法。以4种血清型的单增李斯特菌标准菌株为阳性对照、144株食品分离株为检测对象,运用该方法对单增李斯特菌1/2a、1/2b、1/2c、4b四种血清型鉴定符合率分别达到92.7%、90.3%、100%、100%,多重PCR方法的符合率为71.4%、87.0%、96.2%、95.0%。可见,建立的MALDI-TOF/TOF方法可对4种血清型的单增李斯特菌快速鉴别。与多重PCR方法相比,该方法具有快速、高通量、重现性好等特点,可用于食品中单增李斯特菌血清型的快速鉴定。     

脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证蛋白质组学 比较研究

目的建立脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证血清双向凝胶电泳图谱,初步分析其差异蛋白质表达情况。 方法双向凝胶电泳(2-DE)分离脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证血清标本,考马斯亮兰染色,PD-QUEST 图像分析系 统分析,从凝胶中选取分离较好的蛋白质点,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析获取肽质 量指纹图谱（PMF）,Mascot 软件搜索SWISS-PROT 数据库鉴定蛋白质,对差异蛋白质进行组间对比。结果获得了分 辨率较好的脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证双向凝胶电泳图谱,质谱分析了29 个差异蛋白质点,获取了87 张肽质 量指纹图谱,通过查询数据库鉴定了29 个蛋白质,其中部分蛋白质与肝阳化风证及阴虚风动证发生发展有关。结论 建立了脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证血清双向凝胶电泳图谱,并应用质谱技术鉴定了部分差异蛋白质点,为脑梗 死肝阳上亢证与阴虚风动证与正常组血清双向凝胶电泳图谱血清蛋白质组数据库的建立提供了有意义的数据,并认 为蛋白质组学能在脑梗死不同证型具有代表意义。     

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法鉴定检疫性病菌炭蛆菌

基于基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS),对样品处理过程中的各条件进行优化,建立了基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱快速鉴定炭疽菌的方法。炭疽病菌菌丝采用70%甲酸:100%乙腈(1∶1)进行提取、50μL70%甲酸∶100%乙腈(1∶1)重悬后再超声提取,然后以HCCA为基质,乙腈∶三氟乙酸∶无菌去离子水(50%∶2.5%∶47.5%)为基质溶剂,运用改进的干滴法点样,进行MALDI-TOF-MS分析。应用此方法获得了咖啡浆果炭疽病菌特有的9个蛋白图谱峰,建立12种炭疽菌的蛋白指纹图谱库,从而建立MALDITOFMS分析炭疽菌的标准方法。     

犊牛卵泡液多肽信息分析

[目的]了解成年牛和犊牛卵泡液中多肽的信息表达差异,为完善犊牛卵泡液基础研究及犊牛卵母细胞体外培养体系奠定基础.[方法]采用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF-MS）对超排成年牛和超排犊牛卵泡液中的肽段进行分析,根据多肽的信号峰信息,通过MASCOT数据库进行蛋白检索.[结果]从成功构建的成年牛与犊牛卵泡液质谱多肽信号峰模型图谱可知,超排犊牛卵泡液多肽表达图谱中有60～80个信号峰,而超排成年牛的有30～40个信号峰;其中成年牛卵泡液有两个特有信号峰,质荷比为1218.58和1509.77 m/z,犊牛有1个特有信号峰,质荷比为953.54 m/z.利用MASCOT数据库对获得的卵泡液多肽信息进行蛋白检索,发现成年牛卵泡液中有18种蛋白,犊牛卵泡液中有11种蛋白.[结论]犊牛卵泡液中蛋白多肽信息峰数量多于成年牛,但卵泡液中总蛋白数量少于成年牛,这种差异可能是导致犊牛卵母细胞发育能力低于成年牛的重要原因之一.     

鸡蛋黄中提取卵磷脂的最佳工艺条件

采用3因素正交试验从鸡蛋黄中提取卵磷脂,结果表明,提取卵磷脂的最佳工艺为:用分析纯丙酮,丙酮用量与蛋黄之比(mL/g)为3 : 1,静置15 min,得到滤渣丙酮粉,再用浓度99.7 % 的乙醇溶解丙酮粉,温度40 ℃,用量为每克丙酮粉用9.5 mL乙醇。     

卵黄抗体三种提取工艺的比较

The experiment mainly compares three different methods of extracting antibodies: octanoic acid method, water dilution method and poloxamol method,by observing the physical properties of the antibody, detecting the protein content of the extract, and using the hemagglutination test and the hemagglutination inhibition test to detect the antibody titer, select the best process of the yolk antibody.The results showed that the protein content of the three different extraction methods was the highest by poloxamol method and the lowest by octylic acid method;The contents of Newcastle disease and avian influenza were the highest by water dilution method and the lowest by octanoic acid method;The volume of antibody solution was the highest by water dilution method and the lowest by poloxamu method.Comprehensive comparison of experimental results finally determined that water dilution method is the best effect, using this method to extract yolk antibody titer is the highest, easy to operate, can achieve large-scale production workshop.     

高效液相色谱法测定蛋清和蛋黄中五种磺胺类药物残留

建立了一种高效液相色谱法测定蛋清和蛋黄中5种磺胺类药物(磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧达嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑)残留的分析方法。蛋清和蛋黄样品经乙腈提取后,上清液氮气吹干,用流动相溶解残渣,蛋黄用正己烷去脂净化后,用HPLC测定,蛋清提取液浓缩定容后,用HPLC测定。测定条件为,色谱柱:20RBAX SB-C185μm,250 mm×4.6 mm(i.d);流动相:甲醇/1%冰乙酸(蛋清:28/72,V/V;蛋黄:23/77,V/V);检测器:紫外检测器;检测波长270 nm。在0.02-5.0μg/ml范围内,标准曲线呈线性关系。在0.5,0.1,0.05 mg/kg 3个添加水平,该方法在蛋清中的回收率为84.3%-100.4%,变异系数为1.1%-7.0%;蛋黄中的回收率为80.0%-91.8%,变异系数为1.1%-11.5%;蛋清中的检测限为0.01 mg/kg,蛋黄中的检测限为0.03 mg/kg。     

稀释液中卵黄浓度对猪精液冷冻保存效果的影响

为探索卵黄在猪精液冷冻中的应用效果,筛选出猪精液冷冻稀释液中卵黄的最佳浓度,分别在猪精液冷冻稀释液中添加不同比例（20%、25%、30%）的卵黄,并以精子活率、活力、路径速率（VAP）、轨迹速率（VCL）、直线运动速率（VSL）等为指标,对猪精液稀释后、平衡后和冷冻后3个阶段的精液质量进行比较分析。结果表明,将猪精液冷冻稀释液中卵黄的添加量提高5～10个百分点,其稀释后、平衡后及解冻后3个阶段精子的5个运动参数与常规添加量相比均无显著差异（P〉0.05）。可见,提高猪精液冷冻稀释液中卵黄浓度未能显著改善猪精液冷冻后的质量,综合考虑,猪精液冷冻稀释液中卵黄浓度仍以20%（v/v）为宜。     

二十二碳六烯酸强化蛋黄粉的制备及其贮藏稳定性

以二十二碳六烯酸(DHA)营养强化鸡蛋为原料制备DHA强化蛋黄粉,通过测定pH值、色差值、DHA含量和过氧化值等指标,探讨烘箱加速氧化25 d,及不同温度(4、25、37℃)、光照(照光/避光)和氧气(有氧/无氧)条件下DHA强化蛋黄粉的稳定性。结果表明:冷冻干燥相较于喷雾干燥能更好地保留DHA,制得的DHA强化蛋黄粉中DHA含量为17.1 g·kg^-1。高温氧化使DHA强化蛋黄粉的pH值降低,红度值增加,亮度值下降。37℃贮藏7周时,DHA强化蛋黄粉中DHA的保存率为93.1%。25℃贮藏60 d时,无氧避光条件下DHA强化蛋黄粉中DHA的保存率为95.2%,有氧避光条件下为93.6%;无氧照光条件下DHA强化蛋黄粉中DHA的保存率为94.2%,有氧照光条件下为91.7%,且有氧照光组的过氧化值为有氧避光条件下的3.7倍。综上,温度对DHA强化蛋黄粉中DHA保存率的影响具有主导作用,氧气和光照对DHA强化蛋黄粉的氧化变质具有促进作用。DHA强化蛋黄粉应优先考虑低温、避光、密封存放。     

抗鸡念珠菌卵黄抗体的研制及应用

本试验以龙岩某肉鸡场发病鸡嗉囔中分离得到的念珠菌作为免疫抗原,免疫25周龄产蛋鸡.经效力检验合格后,试制成抗鸡念珠菌卵黄抗体液.抑菌活性试验表明:效价为5 log2以上的高免卵黄表现出明显的抑菌活性,完全抑制了念珠菌的生长和繁殖.用抗鸡念珠菌卵黄抗体液分别喂服20日龄肉鸡和100日龄孔雀.结果表明:试验组鸡群嗉囔和咽喉念珠菌检出率较对照组显著降低(P<0.05);平均日采食量和日增重较对照组分别提高了80%和400%,死亡率则下降了7%.对孔雀的治疗效果与常规药物CuSO4相当.     

直接皂化-比色法测定鸡蛋黄中胆固醇含量

采用正交实验优化各项技术参数,建立了直接皂化-比色法测定鸡蛋黄中胆固醇含量的分析方法。结果表明,鸡蛋蛋黄中胆固醇提取的最优工艺条件为:料液比为1:10(W:V),提取时间为1 h,提取温度为35℃,挥干温度为65℃,测得每100 g鸡蛋蛋黄的胆固醇含量为1 609 mg;回收率为95.41%,RSD为3.77%。此方法操作简单、快速、准确。     

电子束辐照对蛋黄粉品质及微生物的影响

【目的】研究电子束辐照对蛋黄粉品质和微生物生长的影响,为蛋黄粉杀菌方法的确定提供参考。【方法】以蛋黄粉为原料,分别用0,1,2,3,4,6和8kGy电子束进行辐照处理,比较不同剂量电子束辐照对蛋黄粉乳化性能、脂质氧化性能、色泽的影响,并分析辐照后贮藏30d蛋黄粉中微生物的变化,综合不同辐照剂量对蛋黄粉品质及微生物变化的影响,确定蛋黄粉电子束辐照处理的适宜加工工艺。【结果】蛋黄粉在辐照剂量为1~4kGy时,其乳化能力、乳化稳定性及脂质过氧化值分别为392.4~351.4mL/g,27.8~24.7min和1.80~1.98mmol/kg,与CK组(0kGy)乳化能力(40.6 mL/g)、乳化稳定性(28.3 min)和脂质过氧化值(1.80 mmol/kg)相比无显著差异(P0.05);辐照剂量为6kGy时,其酸价(0.14mg/g)和色泽L*与CK组比较无显著变化;3~4kGy的辐照剂量可以有效控制蛋黄粉中微生物的变化,并可有效防止产品贮藏过程中微生物的生长与繁殖。【结论】电子束辐照剂量控制在4kGy内,对蛋黄粉理化及感官品质影响不大,并能有效杀灭产品中的微生物,4kGy是蛋黄粉适宜的电子束辐照剂量。     

水稻地方品种月亮谷与LTH叶片蛋白质的双向电泳分析

 为了研究水稻地方抗病品种月亮谷与感病品种丽江新团黑谷（LTH）在未接种稻瘟菌前蛋白质间的差异,利用双向电泳技术对月亮谷与LTH叶片的蛋白质组分进行研究。试验选用pH 4～7,17cm的IPG胶条,利用双向电泳技术分离上述两个水稻品种的稻苗叶片的蛋白质,分析其蛋白质点表达量的差异,同时选取差异显著的蛋白质点进行质谱分析。利用Gene ontology软件对这些蛋白质进行了功能分类。月亮谷与LTH叶片蛋白的双向电泳图谱得到34个差异蛋白点,对其中20个蛋白点进行质谱测定,鉴定到13个差异蛋白,包括1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基,3-磷酸甘油醛脱氢酶,ATP合酶,UDP-葡萄糖焦磷酸化酶,铁氧蛋白-NADP-还原酶,叶绿素a/b结合蛋白等。因此认为月亮谷与LTH叶片中主要是参与生长代谢和防御相关的蛋白质存在差异。这些蛋白在水稻与稻瘟病菌互作中的表达模式和对抗病性的贡献值得下一步深入研究。     

水稻蛋白质双向电泳分析新方法

通过研究，建立了适合于水稻根蛋白质双向电泳分析用的磷酸缓冲液抽提、ＴＣＡ沉淀法浓缩蛋白质的新方法．本法用于水稻胚、叶片的蛋白质样品制备，也能获得稳定、清晰的双向电泳图谱．经考马斯亮蓝Ｒ２５０染色，根、叶和胚的清晰可分辨的蛋白质斑点数分别约为３５０、３５０和４００个，用银染色，斑点数分别为６００、６００和７００个．三者蛋白质的等电点总在３．０～９．０之间，大多在５．０～８．０之间，分子量在１５～１７０ｋＤ之间，大多在２５～９０ｋＤ之间