油茶SnRK2基因家族的克隆及表达分析

以油茶(Camellia oleifera)主栽品种‘华硕’为试验材料,通过RT-RCR的方法克隆出油茶蔗糖非酵解相关蛋白激酶(sucrose non-fermenting-1-related protein kinase 2, SnRK2)基因家族,命名为CoSnRK2.5,CoSnRK2.8。利用不同的在线网站对CoSnRK2基因家族进行生物信息学分析,通过实时荧光定量PCR对CoSnRK2基因家族的表达模式进行研究分析。结果表明,CoSnRK2基因家族的CDS长度为1 035～1 092 bp,编码344～363个氨基酸,具有SnRK2基因家族2个特有的结构域:相对保守的N端结构域和特异性明显的C端结构域。实时荧光定量PCR结果表明,CoSnRK2.5基因在异交(‘华硕’ב华鑫’) 72 h花柱中的表达量明显高于自交,自交12 h子房中的表达量远高于异交;CoSnRK2.8基因在自交24 h花柱中的表达量远高于异交,异交72 h花柱中的表达量远高于自交;异交84 h子房中的表达量远高于自交。本研究对进一步挖掘该基因家族在油茶后期自交不亲和过程中发挥的作用提供研究依据,对油茶自交不亲和分子机制解析具有重要的意义。     

海南钻喙兰B类MADS-box基因的克隆与表达分析

为了更多的了解B类MADS-box基因对兰花花器官发育的调控机理,本研究通过设计简并引物,利用RT-PCR结合RACE技术从海南钻喙兰(Rhynchostylis gigantea)中分离得到两个B类MADS-box基因。序列分析表明,两基因分别属于B类MADS-box基因的AP3和PI家族,命名为RgAP3和RgPI。RgAP3基因含有一个675bp的开放阅读框(ORF),编码225个氨基酸,RgPI基因含有一个633bp的开放阅读框,编码211个氨基酸。表达分析显示,两基因仅在生殖器官中表达,而在营养器官中没有表达,其中RgPI在花器官的各个部分均有表达,而RgAP3仅在花瓣、萼片中有表达,而在花梗和子房中没有表达。     

自交亲和与自交不亲和日本梨中S4基因的研究进展

综述了近20年日本梨中与自交亲和和自交不亲和有关的S4基因的研究进展。这些结果包括：“二十世纪”(基因型为S2S4)为自交不亲和品种,其突变品种“奥嗄二十世纪”(基因型 为S2S4SM,SM=stylar part mutant;花柱部分突变)为自交亲和型。“奥嗄二十世纪”自交亲和的原因有三点：(1)S4SM基因被删除或者是低水平表达。(2)S4SM基因仅在柱头表达。(3)S4SM基因表达较迟。这主要是由于“二十世纪”S基因座上的S4等位基因发生了高度突变成为S4SM基因或者S4等位基因被删除,导致其基因产物花柱中的S4-RNase受到高度抑制或缺乏的缘故。S4基因由997bp组成,其中85~768bp为684bp的阅读框,925~931bp和943~950bp为多聚腺苷酸信号。S4基因的表达产物为S4蛋白,S4蛋白由228个氨基酸残基组成,其中N端的27个氨基酸残基为信号肽,成熟的S4蛋白由201个氨基酸残基组成。S4蛋白的生理功能是抑制花粉的萌发和花粉管的伸长。     

红鳍东方鲀SREBP-1和SREBP-2基因克隆及表达分析

为了研究红鳍东方鲀SREBP-1和SREBP-2基因的功能及在脂肪代谢中的分子机制,从红鳍东方鲀脂肪组织提取总RNA,反转录获得c DNA模板,利用设计的引物PCR扩增获得SREBP-1和SREBP-2开放阅读框(ORF),SREBP-1基因ORF区的c DNA序列长度为3 330 bp,编码1 109个氨基酸,SREBP-2基因ORF区的c DNA序列为3 444 bp,编码1 147个氨基酸。实时荧光定量PCR检测SREBP-1基因在红鳍东方鲀不同组织中的表达特征,结果表明,SREBP-1在脑组织中表达丰度最高,其次为眼、脂肪组织、肠、鳃、脾脏、心脏及肝脏,在肌肉中表达丰度最低。将SREBP-1连接到原核表达载体p ET32a上,利用IPTG对重组质粒p ET32a-SREBP-1在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达,SDS-PAGE电泳显示在141 k Da处有特异性的条带出现。     

红鳍东方 SREBP-1和 SREBP-2基因克隆及表达分析

为了研究红鳍东方 SREBP-1和 SREBP-2基因的功能及在脂肪代谢中的分子机制，从红鳍东方脂肪组织提取总 RNA，反转录获得 cDNA 模板，利用设计的引物 PCR 扩增获得 SREBP-1和 SREBP-2开放阅读框（ORF）， SREBP-1基因 ORF 区的 cDNA 序列长度为3330 bp，编码1109个氨基酸，SREBP-2基因 ORF 区的 cDNA 序列为3444 bp，编码1147个氨基酸。实时荧光定量 PCR 检测 SREBP-1基因在红鳍东方不同组织中的表达特征，结果表明， SREBP-1在脑组织中表达丰度最高，其次为眼、脂肪组织、肠、鳃、脾脏、心脏及肝脏，在肌肉中表达丰度最低。将SREBP-1连接到原核表达载体 pET32a 上，利用 IPTG 对重组质粒 pET32a-SREBP-1在大肠杆菌 Rosetta（DE3）进行诱导表达，SDS-PAGE 电泳显示在141 kDa 处有特异性的条带出现。     

菊花CgF3’H基因克隆及表达特性分析

根据菊花花器官表达序列标签序列设计引物,采用PCR和5’-RACE技术对类黄酮3'-羟化酶(F3’H)基因进行全长cDNA克隆.克隆获得F3'H cDNA全长为1 760 bp,其开放阅读框(ORF)为1 524 bp,编码一条包含508个氨基酸残基的多肽,GenBank登录号为AB523844.预测该基因编码的蛋白分...     

芸芥中DnaJ同源基因的克隆与表达分析

为研究芸芥自交亲和机理,采用mRNA差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)分析技术,从芸芥自交亲和系开花前柱头中获得1条差异片段。测序及DNA序列的生物信息学分析表明,该差异片段与拟南芥DnaJ蛋白同源基因At J3有较高同源性,暂命名为esAtJ3基因。该序列含有一个长度为297 bp的完整开放阅读框,编码98个氨基酸残基,含有一个DnaJ-C保守结构域,属于植物DnaJ超家族。esAtJ3基因编码的蛋白无信号肽,是一个亲水性蛋白,该蛋白主要由不规则卷曲和α螺旋组成。实时荧光定量PCR分析表明,esAtJ3基因在芸芥SC系开花前柱头中表达量较高,初步推测该基因可能参与芸芥亲和性调控。     

小报春类钙调素蛋白基因PfCML41的克隆及序列分析

CMLs是一类钙离子传感器,能与Ca~(2+)结合,对促进花粉萌发和花粉管生长发挥重要作用。为了探究CMLs对小报春(Primula forbesii)异型自交不亲和系统的影响,在小报春以长花柱做母本时的亲和授粉与不亲和授粉的转录组数据中发现了一个差异表达基因PfCML41,并对其进行了CDS序列全长克隆和基因序列分析。结果表明,PfCML41基因的CDS序列全长为555 bp,编码184个氨基酸。编码的蛋白无信号肽和跨膜区域,属于亲水性蛋白。PfCML41含有EF-hand结构,能与Ca~(2+)结合。通过系统进化树分析,PfCML41与茶(Camellia sinensis)的CsCML41亲缘性更近。实时荧光定量PCR结果表明PfCML41在不亲和授粉组合中的相对表达量高于亲和授粉组合,且差异显著。本研究为小报春PfCML41的表达分析与功能验证提供了理论依据。     

花生mtACP3基因的克隆与表达分析

旨在探究酰基载体蛋白在植物脂肪酸合成途径中的作用机制,本研究采用传统PCR方法从花生中克隆得到了一个线粒体型基因,命名为AhmtACP3。并采用荧光定量PCR技术分析了基因的表达特性。该基因全长为859 bp,开放阅读框ORF为390 bp,开放阅读框对应的基因组序列为543 bp,由2个外显子和1个内含子组成,该基因编码129个氨基酸,理论分子量为14.5345 k D,理论等电点为5.22,可能定位于线粒体上。系统发育分析表明,花生线粒体型ACP蛋白分成2个分支:AhmtACP1和AhmtACP2有较近的亲缘关系,与AhmtACP3亲缘关系较远。荧光定量PCR结果显示,AhmtACP3基因在花中的表达量明显高于其他组织,其次是子叶和根。AhmtACP3基因在种子发育过程中的表达量呈现下降趋势。     

春兰AGAMOUS同源基因的克隆及表达分析

为深入探索春兰(Cymbidium goeringii)中C类MADS-box基因参与春兰花器官发育调控的分子机理,用同源克隆的方法从春兰花芽中分离出两个C类MADS-box基因CygoAG1与CygoAG2。在分析其序列结构的基础上,分别检测2者在春兰不同花器官中的表达差异。序列结构分析表明:CygoAG1序列全长为831bp,包含702 bp完整开放阅读框(open reading frame, ORF),编码233个氨基酸和1个终止密码子;CygoAG2基因cDNA序列全长996 bp,包含705 bp完整开放阅读框,编码234个氨基酸和1个终止密码子,2个基因编码的转录因子均包含保守的MADS、K-box结构域和AG基序。分子系统发生与进化树重建结果显示:春兰CygoAG1与CygoAG2与拟南芥MADS-box基因家族中AG (AGAMOUS)基因的同源性最高。实时荧光定量分析结果表明,春兰CygoAG1基因只在花粉团、合蕊柱和子房中表达,在其它花器官及营养器官叶片中不表达,其在子房中的表达量最高。CygoAG2基因在春兰的花器官如萼片、花瓣、唇瓣、花粉团、合蕊柱和子房中均有表达,但在营养器官叶片中不表达,其在合蕊柱(雌雄蕊合生结构)中的表达量最高。CygoAG1和CygoAG2基因在春兰花器官中的表达模式呈现一定的差异。     

油茶花青素还原酶基因克隆和体外功能研究

花青素还原酶(ANR)是催化花青素还原形成单体儿茶素的关键酶。油茶(Camellia oleifera Abel.)属于山茶科山茶属植物,其花青素还原酶基因尚未被克隆和功能分析。本研究采用RT-PCR技术,克隆获得了两条油茶花青素还原酶基因的全长序列,CoANR1基因全长1441bp,开放阅读框(ORF)长度为1047bp,编码348个氨基酸残基,与茶树ANR1基因的蛋白序列同源性为97%;CoANR2基因全长1413bp,ORF框长度为1014bp,编码337个氨基酸残基,与茶树ANR2基因的蛋白序列同源性为99%。采用大肠杆菌表达方法获得CoANR1和CoANR2重组蛋白,纯化蛋白经体外酶活检测能够催化矢车菊色素合成儿茶素(C)和表儿茶素(EC),催化飞燕草色素合成没食子儿茶素(GC)和没食子表儿茶素(EGC)。本研究为进一步研究油茶儿茶素合成的分子机制提供了重要的研究基础和理论依据。     

新疆野扁桃自交不亲和基因SSK1的克隆及生物信息学分析

为了获得新疆野扁桃居群中自交不亲和花粉特异性表达的SSK1基因全长,以新疆野扁桃植物叶片及花粉为试验材料通过rt-PCR技术以及生物测序等技术,克隆得到了一个新的SSK1基因全长c DNA,Pet SSK1。Pet SSK1全长为602 bp,开放阅读框为534 bp,共编码了177个氨基酸,经生物信息学分析,Pet SSK1蛋白的分子式为C910H1421N233O295S6,相对分子质量为20538.0,理论推导半衰期为30 h,等电点为4.52,不稳定指数为41.48,平均疏水指数为-0.567,Pet SSK1蛋白属于水溶性不稳定蛋白。首次从新疆野扁桃植株中克隆得到了SSK1基因全长。通过对该基因的克隆及序列分析,为今后的表达分析以及有效利用该基因获得自交亲和植株奠定了基础。     

蒙药植物蓝盆花的授粉亲和性

利用显微镜观察花粉和柱头形态,采用离体萌发法对花粉活力进行测定,采用压片法对自交授粉后花粉管生长动态进行观察,以探明蓝盆花自交是否存在授粉障碍,为今后蓝盆花人工栽培和杂交育种工作提供理论依据。结果表明:蓝盆花花粉饱满,具有1~3个萌发孔,二裂柱头,花柱细长通直,培养10 h花粉萌发率达86.06%,花粉活力高。授粉后4 h多数花粉萌发后花粉管进入花柱;授粉后10 h花粉管进入花柱中上部;授粉后12 h多条花粉管进入花柱并到达中部;授粉后48 h花粉管到达花柱基部进入子房,但通过观察发现花柱顶端有胼胝质及花柱内的花粉管交叉缠绕停止生长的异常现象,从而花粉管不能进入子房完成受精过程,这可能是导致果实空瘪的一个原因。由此推测,蓝盆花自交授粉存在受精前障碍,属于配子体自交不亲和类型。     

夜来香LIS基因的克隆与表达分析

为了研究夜来香生物钟和花香代谢机制,本研究以夜来香花瓣为材料,利用PCR技术,从中获得了夜来香LIS基因的全长cDNA,并命名为CnLIS。生物信息学分析结果表明:该cDNA序列全长为1 800 bp,编码560个氨基酸,其中ORF为1 683 bp,5'UTR为56 bp,3'UTR为61 bp;该序列编码的氨基酸序列与软枣猕猴桃、温州蜜柑LIS基因的同源性分别为55%、50%,属于类异戊二烯合成C1超级家族。实时荧光定量PCR分析结果表明,0~12 h CnLIS表达水平较低,16 h后表达量明显上调,20 h表达量达最大,随后表达量急剧下降,其表达量随花瓣开放与闭合呈节律性变化。推测CnLIS可能参与夜来香香气形成,调控花香形成过程,同时,该基因的表达可能受生物钟基因所调控。     

棉花GhSRO04/GhSRO08基因的克隆及表达分析

SRO转录因子在植物响应盐、旱和病菌等生物和非生物胁迫中具有重要的调节作用。本研究从抗枯萎病耐黄萎病的棉花品种鲁研棉32号中克隆获得2个基因:命名为GhSRO04和GhSRO08(Gen Bank登录号为KR534896和KR534895)。结果显示:GhSRO04包含一个最大开放阅读框1830 bp(ORF),推测编码609个氨基酸;GhSRO08包含一个最大开放阅读框1 842 bp(ORF),推测编码编码613个氨基酸。比对分析表明GhSRO04和GhSRO08基因均含有RCD1-SRO-TAF4结构域(RST)。系统进化树分析表明,GhSRO04和GhSRO08编码产物与拟南芥RCD1和SRO1亲缘关系最近,属于同一进化分支。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析基因表达显示,GhSRO04和GhSRO08基因均受黄萎病菌侵染、干旱和高盐诱导表达,表明GhSRO04和GhSRO08在棉花应对盐、旱和病菌胁迫中可能起着重要的调节作用,对棉花种质的抗逆性遗传改良具有潜在利用价值。本研究首次从棉花中分离鉴定出SRO类转录因子,并进行了初步功能分析,为棉花遗传改良储备了基因资源。     

茶树叶绿素合成相关基因克隆及在白叶1号不同白化阶段的表达

高等植物叶绿素的生物合成对其正常光合作用起关键作用。本文根据前期芯片杂交结果, 采用RT-PCR和RACE技术克隆了3个茶树叶绿素合成相关基因, 分别为谷氨酸-tRNA还原酶(CsGluTR)、叶绿素合酶(CsChlS)、叶绿素酸醋氧化酶(CsCAO), 对应的GenBank的登录号为HQ660371、HQ660370、HQ660369。序列分析表明, CsGluTR基因全长2165 bp, 开放阅读框长1665 bp, 编码554个氨基酸, 推测的蛋白分子量约为60.6 kD, 理论等电点为8.78;CsChlS基因全长1463 bp, 其中开放阅读框长1125 bp, 编码374个氨基酸, 推测的蛋白分子量约为40.5 kD, 理论等电点为8.58;CsCAO基因全长2146 bp, 其中开放阅读框长1611 bp, 编码536个氨基酸, 推测的蛋白分子量约为60.8 kD, 理论等电点为8.03。比对分析表明, 3个基因编码的氨基酸序列与其他植物中同源基因的相似性均在70%以上。利用荧光定量PCR技术检测3个基因在不同白化阶段的表达,表明, CsChlS和CsCAO基因具有明显的表达协同性, 它们在叶片中的表达量与叶片的颜色变化高度同步;而CsGluTR在白化叶片和正常叶片中的表达差异相对较小, 同时在新生芽叶转绿过程中最先恢复正常表达水平。说明在白化叶片中, 叶绿素的合成机制受到较大影响, 叶绿素合成受阻导致的叶片内色素类物质含量降低或消失是叶片白化的直接原因。     

毛白杨形成层中4种MADS-box基因的克隆和序列分析

MADS-box基因家族是一类具有特异性序列的转录因子,并在植物体发育过程中起着重要作用。本研究以毛白杨形成层为材料,利用RACE技术克隆得到4个MADS-box基因,命名为Pt MADS1、Pt MADS2、Pt MADS3和Pt MADS5。Pt MADS1全长1 067 bp,开放阅读框(ORF)长度678 bp,编码含有225个氨基酸;Pt MADS2全长912 bp,ORF长度609 bp,编码含有202个氨基酸;Pt MADS3全长909 bp,ORF长度654 bp,编码含有217个氨基酸;Pt MADS5全长1 029 bp,ORF长度663 bp,编码220个氨基酸。系统进化树分析表明Pt MADS1与SVP同源性较高,属于STMADS11亚族;Pt MADS2与AGL12基因同源性较高,属于AGL12亚族;Pt MADS3和Pt MADS5分别与AGL14和SOC1同源性较高,同属于SOC1亚族。     

石蒜LrCMO基因的克隆及表达分析

以石蒜(Lycoris radiata)为试材,采用同源克隆和RACE的试验方法,克隆得到LrCMO基因全长cDNA,并对其进行了基因表达分析。结果表明:LrCMO基因全长1 472 bp,其中开放阅读框(ORF)为1 281 bp,编码427个氨基酸残基,预测编码蛋白质的分子量为47.92 kD,理论等电点为5.72;LrCMO是一个稳定的疏水蛋白,不具有跨膜结构,含有叶绿体导肽;LrCMO基因编码的氨基酸与植物其他CMO蛋白具有较高的一致性,且与海枣PdCMO、香蕉MaCMO及油棕EgCMO亲缘关系最高,聚为一类。实时荧光定量PCR分析表明,LrCMO在根、鳞茎和叶片中有表达,且在鳞茎中的表达量最高;LrCMO受聚乙二醇(PEG)处理的诱导表达,其基因相对表达量在处理后12 h达到最高。随着处理时间的延长,LrCMO基因相对表达量逐渐下调至对照水平。     

春兰AGL6基因的克隆及实时定量表达分析

本研究采用RT-PCR结合RACE技术从春兰(Cymbidium goeringii)中分离到一个AGL6基因。序列分析表明,该基因含有一个729bp长的开放阅读框(ORF),共编码242个氨基酸。系统进化树分析显示,该基因属于MADS-box基因家族AP1/AGL9组的AGL6同源基因,其编码的蛋白与其它植物AGL6类蛋白具有较高的同源性,命名为CgAGL6(基因登录号为HM208533)。实时荧光定量表达分析表明,CgAGL6基因春兰不同组织中均有表达,其中在唇瓣、花芽和子房中的表达量较高,在花瓣和萼片中的表达量次之,在根、叶和蕊柱中的表达量最低,显示了CgAGL6基因可能在春兰成花转变和花器官的形成过程中起着重要作用。     

甜瓜PGIP基因的克隆及表达初步分析

以甜瓜叶片基因组DNA为模板,PGIP基因保守序列设计引物,PCR扩增到1条全长978 bp的目的片段。该基因包含有1个完整的开放阅读框,没有内含子,编码326个氨基酸,其编码的氨基酸序列中含有一段典型的亮氨酸重复序列。序列比对表明:该基因编码的氨基酸序列与GenBank中的PGIP基因氨基酸序列(AAP41199)同源性为100%;RT-PCR表达分析表明,该基因在甜瓜叶、茎、根、果实中表达,在花中不表达。为植物分子抗病育种提供了1条基因资源。