CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物基因工程育种中的应用

作为传统基因工程育种技术,转基因技术在植物分子育种工作中的应用受到技术本身缺陷及其他风险因素的限制。CRISPR/Cas9基因编辑技术是近几年新发展起来的一种基因组定向编辑技术。本研究介绍了CRISPR/Cas9基因编辑技术的基本原理和研究进展,分别比较分析了CRISPR/Cas9系统与前两代基因编辑技术(ZFNs和TALENs)和传统转基因技术之间的差异。至今为止,CRISPR/Cas9基因编辑技术已经在多种植物中实现了定点突变诱导(插入,缺失或修饰等)。由于成本低廉、操作简易和突变诱导率高等特点,CRISPR/Cas9系统作为一项高效植物遗传改良和育种研究的分子操作技术手段,应用前景十分广阔。     

利用CRISPR/Cas9技术创制烟草NtabMYC2基因的定点突变

本研究利用CRSIPR/Cas9基因编辑技术,创制了NtabMYC2的不同的定点突变材料。针对NtabMYC2基因3个敲除靶位点,设计并成功构建了相应的载体。结果表明:3个载体转化烟草后,通过测序验证NtabMYC2基因被成功敲除了,统计3个载体的敲除成功率分别是24%、2%、10%;T0突变植株经过自交重组产生T1代植株,通过测序分析T1代植株存在4种纯合的NtabMYC2基因突变类型,其分别是多一个A、T、C插入突变和一个缺失4个碱基缺失突变。为进一步研究NtabMYC2基因在烟草中的功能提供了一定的参考价值。     

基于正交试验法的铁皮石斛原球茎生长和多糖合成研究

以无菌铁皮石斛原球茎为材料,采用液体悬浮培养的方式,以正交设计方法研究不同的pH、摇床转速、接种量、植物生长调节剂对铁皮石斛原球茎生长和多糖合成的影响,以确定适合铁皮石斛原球茎生长和多糖合成的不同植物生长调节剂配比最佳组合和不同的pH、摇床转速、接种量最佳组合.结果表明:以干重和多糖产量为指标,促进原球茎干物质形成的不同植物生长调节剂配比最优水平的组合为NAA O.6mg/L+BA0.5mg/L+ KT 1.5mg/L,促进原球茎多糖合成的植物生长调节剂配比最佳组合为NAA 0.4mg/L+BA 0mg/L+KT 1.5mg/L;摇床转速120r/min、初始pH6.0、接种量90g/L是有利于铁皮石斛原球茎的干物质形成和多糖合成的最佳组合.     

不同铁皮石斛品种石斛多糖与纤维素关系及聚类分析

测定了不同铁皮石斛品种和同一铁皮石斛品种在不同海拔的石斛多糖和纤维素含量。用硫酸-苯酚比色法测定石斛多糖含量,烘干法测定纤维素含量。结果表明,不同铁皮石斛品种石斛多糖和纤维素含量存在显著差异,石斛多糖的变异系数小于纤维素,而多态性信息含量(polymorphism information content,PIC)则大于纤维素;石斛多糖与纤维素含量间呈负相关;随着海拔高度的增加,石斛多糖含量增加,纤维素含量降低。9个铁皮石斛品种聚成两大类,一类与桂平广南种相似,另一类与容县都峤山种相似。     

基于Cas9-Free的拟南芥ALB3基因编辑载体构建及验证

建立一种高效安全的基因定点编辑体系,为研究植物的光合作用途径以及生理代谢过程提供理想材料。针对拟南芥靶基因ALB3设计2个sgRNA,引导Cas9蛋白识别PAM位点,从而实现ALB3基因的大片段敲除;将荧光筛选标记基因mCherry组装到CRISPR/Cas9载体中,构建一种带有荧光筛选标记的CRISPR/Cas9载体;利用农杆菌转化法转化拟南芥,对其后代进行筛选验证,在倒置荧光显微镜下挑选便可获得Cas9-Free的纯合突变种子。测序结果表明,含有可视化筛选标记基因的拟南芥ALB3基因编辑载体序列与预期一致,由此证明载体构建成功;通过倒置荧光显微镜观察,发现阳性转化拟南芥T_0种子含有红色荧光标记,表观观测以及分子鉴定表明T_1植株得到纯合突变后代,条带大小小于野生型,白化突变性状明显。挑选T_1不含荧光的种子进行培育得到的T_2植株,经分子鉴定发现已成功实现Cas9-Free且植株白化。本研究成功构建了一种带有荧光筛选标记且可实现拟南芥ALB3基因敲除的CRISPR/Cas9载体,并获得Cas9-Free的纯合突变植株,为拟南芥基因高效编辑载体的构建以及Cas9-Free基因编辑后代的获得提供了借鉴与参考。     

利用基因编辑技术培育糯性水稻

为建立糯稻品种培育新体系,本试验研究了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对Waxy(Wx)基因定向突变进而培育糯稻的效果。在Wx基因的第2、第7、第8、第10、第11和12外显子区域设计6个靶位点,构建CRISPR/Cas9基因编辑表达载体,采用农杆菌介导法将基因编辑载体转入粳稻品种哈勃601,获得11~88株转基因再生植株。突变分析表明,转基因株突变率总体偏低(0%~30.77%),仅在第2、第7和第11外显子上发生突变,以1~2 bp的插入缺失为主,都为纯合或双等位突变。5份纯合T2突变体的稻米呈蜡质状,直链淀粉含量为由亲本的15.5%降至2.0%~2.6%,接近或达到糯稻水平,其RVA谱与糯稻对照相仿,淀粉粘滞性较亲本哈勃601显著下降。上述结果表明,通过利用CRISPR/Cas9可对Wx基因进行定向突变从而获得糯性材料,但在利用该技术培育新品种时,需要选择适当的靶位点并培育较多的突变体,才能从中选到符合国家标准的糯稻品种。本研究对利用基因编辑技术培育水稻新品种提供了科学依据。     

利用CRISPR/Cas9技术获得水稻恢复系Bsr-d1基因突变体

为研究水稻抗稻瘟病基因Bsr-d1在杂交水稻恢复系中的功能,我们利用CRISPR/Cas9定点基因编辑方法,设计2个敲除靶标位点,构建了Bsr-d1基因编辑载体,并通过农杆菌介导的方法转化水稻恢复系品种‘GH998’,成功获得了转基因植株,并在T1代筛选到4个无转基因成分的纯合突变株系。纯合突变株系有4种突变类型,包括第199号碱基处缺失17个碱基、第212号碱基处缺失4个碱基、第216号碱基处插入1个碱基、第216号碱基处插入2个碱基突变类型。通过蛋白序列分析,发现纯合突变株系都存在移码现象导致氨基酸变化并提前终止翻译。本研究成功利用CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除水稻恢复系‘GH998’中Bsr-d1基因,获得无转基因成分的纯合突变株系,为进一步研究Bsr-d1基因在杂交水稻上的功能提供了理论依据和品种资源。     

利用可视化CRISPR/Cas9系统获得拟南芥Cas9-free突变体

CRISPR/Cas9是实现基因精准突变的有效工具而被广泛应用到功能基因组学研究中。通常需要在已编辑后代的基因组中剔除此编辑体系,以防Cas9进一步编辑导致复杂的脱靶效应。本研究利用可视化的CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除拟南芥AtPAE4基因,测序结果显示AtPAE4在第一个外显子的第478号碱基前面插入了一个碱基A,导致氨基酸的移码突变而提前终止。利用种皮特异启动子控制表达的m Cherry荧光蛋白,可以在T_1代纯合突变体种子群体中分别鉴定出发荧光和不发荧光的种子家系,抗性筛选及分子检测发现不发荧光家系为Cas9-free的AtPAE4突变家系。对AtPAE4突变体的根、茎、叶进行qPCR分析发现AtPAE4在根、茎、叶上的转录水平均显著下调。这些结果表明可视化CRISPR/Cas9系统在基因编辑后代中可快速鉴定到Cas9-free突变体植株,这有助于为进一步研究靶基因功能而获得背景清晰的编辑材料。     

拟南芥SB10基因在耐盐中的功能研究

为了研究拟南芥SB10基因在耐盐中的功能,我们利用CRISPR/Cas9技术构建载体敲除SB10基因,对转基因植株进行筛选成功获得SB10基因沉默的突变体材料。本研究通过观察突变体根长及萌发率等表型,测定突变体植株脯氨酸含量相关的抗逆生理指标,研究拟南芥SB10基因在耐盐中的功能。结果显示:NaCl胁迫下,sb10突变体的根长和萌发率明显高于野生型拟南芥,sb10突变体拟南芥植物体内脯氨酸含量明显高于野生型拟南芥。说明SB10基因功能的缺失可提高拟南芥植株的耐盐能力。该研究为SB10基因参与拟南芥植株耐盐中的分子作用途径及分析提供线索。     

利用CRISPR/Cas9敲除NbLFY基因延迟本氏烟开花时间

开花是植物从营养生长转向生殖生长的重要标志,过早开花会造成植物早衰,严重影响以营养体为产品器官的经济作物的产量和品质,因此研究植物开花基因并对其进行编辑以延迟开花时间具有重要的理论意义和应用价值。LFY基因可抑制叶原基生长并促进花分生组织及花器官形成,是调控植物开花的关键“分子开关”。为利用LFY基因延迟易早花植物的开花时间,本研究以本氏烟为试验材料,构建了NbLFY基因的CRISPR/Cas9敲除载体,利用农杆菌介导法转化叶盘并对编辑植株的表型进行了观察分析。结果表明,通过抗性筛选和PCR检测共获得了10株T₀代植株,靶位点测序分析发现其中有2株NbLFY基因发生了突变,编辑效率为20%,突变类型均为缺失了一个碱基(T)而造成了移码突变。对T₁代基因编辑植株进行表型性状观察发现,与野生型相比,基因编辑植株株高显著降低,现蕾期延迟20 d,第一花序节位也明显提高,表明NbLFY基因的突变导致本氏烟开花时间延后,生殖生长进程延迟。本研究结果证实了NbLFY基因可促进本氏烟开花,敲除该基因可以推迟开花时间。上述研究结果为其他经济作物利用LFY基因...     

利用CRISPR/Cas9技术创建OsIPCS家族基因突变体

肌醇磷酸神经酰胺合酶(inositol phosphoryl ceramide synthase,IPCS)是植物鞘脂合成途径中的一种关键酶,在植物生长发育和逆境适应中具有重要作用。本研究在OsIPCS基因外显子区域设计带有PAM序列的靶位点,利用PCR扩增获得OsIPCS基因sg RNA表达盒,并成功构建CRISPR/Cas9敲除载体;采用根癌农杆菌介导的遗传转化获得3个OsIPCS基因的T0代CRISPR转基因植株;通过PCR扩增和测序确定突变类型,其中2株不同突变类型的OsIPCS1突变单株,27株不同突变类型的OsIPCS2突变单株,9株不同突变类型的OsIPCS3突变单株,为进一步开展OsIPCS基因功能的研究提供科学依据。     

CRISPR/Cas9介导靶向敲除拟南芥MS2基因突变体的鉴定

CRISPR/Cas9(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat/Cas9)基因编辑技术在生命科学领域掀起了一场重大的技术革命,它比锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)技术更易于操作,而且更高效。CRISPR/Cas9系统已经被广泛应用到植物科学研究领域中。本实验选取拟南芥MS2为目的基因,构建植物基因编辑系统的表达载体,并通过农杆菌介导的方法转化拟南芥,从而利用CRISPR/Cas9系统靶向敲除拟南芥MS2基因。对转基因后代的MS2测序结果分析表明,在获得的12个阳性转化植株中,发现了5个阳性植株存在基因序列上的新碱基插入,由此形成CRISPR/Cas9介导的拟南芥MS2突变体。这一工作为后续分析其他物种中MS2同源基因的功能研究提供参考依据。     

利用CRISPR/Cas9技术创建OsGPRP家族基因突变体

本研究利用CRISPR/Cas9技术对水稻OsGPRP家族基因进行敲除,在3个水稻OsGPRP基因的第一个外显子PAM序列区域各设计一个靶位点,并将3个靶位点的sg RNA进行串连,成功构建了3个OsGPRP基因同时敲除的CRISPR/Cas9载体;采用根癌农杆菌介导的遗传转化获得了60株T0代CRISPR转基因植株;通过PCR扩增和测序分析,我们获得了2种不同类型的OsGPRP3单基因突变材料;6种不同类型的OsGPRP2/OsGPRP3两基因突变植株;1种类型的OsGPRP1/OsGPRP3两基因纯合突变植株和4种不同类型的OsGPRP1/OsGPRP2/OsGPRP3三基因突变材料,为进一步研究OsGPRP家族基因的生物学功能及其相互关系提供遗传材料。     

铁皮石斛咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)密码子偏好模式分析

咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)是木质素合成过程的关键酶,参与苯丙烷代谢。了解铁皮石斛COMT(Caffeic acid-O-methyltransferase)基因密码子的偏好性可为其功能和分子进化研究提供科学依据。采用Codon W、EMBOSS、SPSS、Origin等分析铁皮石斛COMT的密码子偏好参数,并通过ENC绘图、中性绘图和PR2-plot分析探讨COMT基因密码子偏好性形成的可能因素,同时使用SPSS19.0和MEGA6.0进行聚类分析。结果显示,铁皮石斛COMT基因ENC值、GC含量以及GC3分别为49、0.452和0.396,表明其密码子偏好性较弱,偏好使用A或T结尾的密码子;ENC、中性绘图分析显示突变压力是COMT密码子偏好性形成的主要作用力;铁皮石斛COMT基因和同为兰科植物的香味蝴蝶兰(Phalaenopsis bellina)的亲缘关系最近,两者的GC1s、GC2s、GC3s、GC、CAI和ENC也较为相近,表明物种进化关系上越相近其密码子偏好性也较为相似,但有些物种仍存在一些差异。此外,从密码子使用频率分析得出酵母菌真核表达系统适合铁皮石斛COMT基因的异源表达,模式植物烟草、番茄可以作为其遗传转化受体。本研究为COMT基因功能进一步研究提供参考。     

CRISPR/Cas9介导靶向敲除拟南芥REVOLUTA基因突变体的鉴定

CRISPR/Cas9系统可对植物的内源基因进行定点编辑,为获得基因缺失突变体提供了新的工具。HD-ZipⅢ家族成员REVOLUTA(REV)是植物发育过程中的关键转录因子。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对拟南芥REV进行特异性定点编辑,构建REV基因编辑表达载体,并利用农杆菌介导的花序浸染法将其转入拟南芥。经潮霉素抗性平板筛选和PCR扩增及测序鉴定,获得7棵转基因株系。对转基因植株REV基因的测序结果显示,有3株均成功在靶点1处产生编辑,且其中1株在靶点2处也成功编辑。该基因编辑突变体的获得为后续深入研究REV基因在拟南芥形态发育过程中的作用提供了新的遗传材料。     

应用CRISPR/Cas9系统编辑水稻SBE3基因获得高抗性淀粉水稻新品系

SBE3是位于水稻第2号染色体上的水稻淀粉分支酶基因,该基因表达量的降低引起水稻抗性淀粉(resistant starch,RS)含量的提高。本研究应用CRISPR/Cas9系统对SBE3基因进行编辑,根据基因编码区序列(CDS)在第8外显子区域设计长度为20 bp的引导序列,化学合成引导序列并构建成sgRNA,将其插入到Cas9质粒骨架载体中,转化农杆菌。通过农杆菌介导的遗传转化方法将构建好的p CAMBIA1300:SBE3sgRNA:Cas9表达载体转入水稻受体材料沪LPR18中。使用PCR扩增转基因阳性植株中含有CRISPR/Cas9靶点的片段并测序验证,确定12个突变单株,其中2个是纯合型,通过后代分离,得到没有潮霉素基因筛选标记的SBE3纯合突变单株,测定其抗性淀粉含量高达10%以上。以上结果表明,本研究已经通过CRIPR/Cas9技术获得稳定的高抗性淀粉水稻纯合突变体材料,为高抗性淀粉育种提供了新的种质资源和创建方法。     

利用CRISPR/Cas9技术敲除OsEIL1和OsEIL2基因改良水稻耐盐性

为了培育耐盐水稻品种,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在水稻品种东农427的耐盐负调控基因OsEIL1和OsEIL2设计1个敲除靶点对其进行同时敲除。通过PCR和测序的方法,在T_0共检测出了5个突变单株,其中有1株为双基因同时突变的植株。在该植株的T_1株系中,获得了4株双基因纯合突变且不含T-DNA元件插入的植株。在T_2进行苗期耐盐性鉴定,成熟期考察农艺性状指标。结果表明,在苗期200 mmol/L NaCl溶液处理5 d后,突变体植株的鲜质量和干质量显著高于野生型植株,地上部及地下部钠离子含量均显著低于野生型植株,钾离子含量与野生型植株无明显差异。恢复7 d后,突变体植株幼苗存活率(75.0%)显著高于野生型植株(8.3%)。在成熟期,突变体的主要农艺性状未发生明显变化。综上,利用CRISPR/Cas9技术对水稻品种东农427进行了耐盐改良,为耐盐水稻品种的培育提供了理论和材料基础。     

利用CRISPR/Cas9技术对水稻香味品质进行遗传改良

为了获得经济价值更高的香稻品种,利用成熟的CRISPR/Cas9技术,在水稻Badh2基因上设计sgRNA-E2和sgRNA-E3 2个靶位点,对超级稻品种龙粳31的香味品质进行改良,其中靶位点sgRNA-E2跨第2个内含子和第2个外显子,靶位点sgRNA-E3位于第3外显子区。经检测共获得有碱基突变的转基因植株6株,其中2个单株为纯合突变,4个单株为双等位突变。突变类型包括碱基缺失、插入及碱基变异,其中突变单株Badh2-E2-13有大片段缺失,为双等位突变,分别缺失64,108 bp。在转录水平上发现6个突变株系的Badh2基因表达量均比野生型显著降低(P0.05)。通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术检测T_0突变体种子的香味物质2AP含量,发现5个突变单株的2AP含量相对野生型显著提高(P0.05),2个突变单株达到阳性对照(信香粳1号)水平,其中1个相比阳性对照显著提高。通过对6个突变株系的T_1主要农艺性状的调查发现,3个株系在香味物质含量提高的同时主要农艺性状和野生型没有显著差异。进一步对T_1植株进行筛选,共获得了无转基因序列的突变单株10个。综上,利用CRISPR/Cas9技术成功对超级稻品种龙粳31的香味品质进行了遗传改良,实现了香味物质含量的显著提高,为香稻和超级稻的育种提供了基础材料。     

兰科植物花香成分研究进展

从兰科植物花香成分及其合成调控等方面进行综述,重点总结了常见兰花的主要花香成分、影响检测花香成分时的主要因素,以及花香生物合成途径中相关分子调控机制。分析表明,萜烯类化合物是兰花最主要花香成分,采样时期、部位、环境和检测技术等都会导致花香成分变化,萜类合成酶基因(TPS)和MYB类转录因子是花香物质代谢途径中主要调控基因。发现兰科植物相关花香成分完整代谢途径及分子调控机制的研究缺乏,是兰科植物花香性状研究现状存在的主要问题,深入挖掘与利用兰花香花基因、完善相关代谢途径将会是兰科植物花香性状未来的研究重点。