罗勒烯信号传导途径各组分突变体高通量活体荧光筛选技术系统的建立

为了高效率地发现罗勒烯信号传导途径上的各信号传递成分,本研究拟采用正向遗传学的策略,即利用EMS诱变与荧光素酶-荧光素活体荧光成像检测技术体系相结合的方法筛选突变体。为此,构建了指示基因启动子PR1pro::Luciferase和PDF1.2pro::Luciferase质粒并转化拟南芥;通过抗性筛选与PCR检测,鉴定获得了T3代转基因纯合子植株。同时,购买了合适的高灵敏CCD相机、暗箱与软件,通过组装调试,成功制造了一台自制的、经济适用的活体荧光检测仪。转基因纯合植株经过茉莉酸、水杨酸或罗勒烯处理和喷施荧光底物后,放到荧光检测仪中,成功观察到了诱导后的转基因植株释放出高亮荧光,说明活体荧光成像检测系统构建成功。这些结果为进一步利用正向遗传学的方法高效筛选罗勒烯信号传导途径中各成分的突变体植株,以及阐明罗勒烯诱导的防御反应的作用机理奠定了良好基础。     

水稻极矮突变体s2-47对赤霉素的响应及基因定位研究

通过EMS诱变日本晴获得1个极端矮化突变体s2-47,其表型为极度矮化、叶色深绿、不能抽穗结实。对水稻胚乳的α-淀粉酶诱导实验表明s2-47突变体与GA的信号传导途径无关,外源活性GA₃对水稻幼苗株高的促进实验显示s2-47应与赤霉素的生物合成有关。利用s2-47和Dular构建F₂群体并精细定位表明,s2-47的表型与水稻OsCPS1基因紧密连锁,其编码的柯巴焦磷酸合成酶是赤霉素生物合成途径的第一个关键酶。序列分析发现,s2-47突变体的OsCPS1基因编码区发生了单个碱基缺失导致移码突变。OsCPS1基因在植株地上部都有表达,在节中表达最高。OsCPS1基因的表达受外源GA₃抑制,但在s2-47突变体中表达上调。     

拟南芥突变体L1.3的表型分析及遗传定位

本研究在转橡胶树Hb CBF1基因的拟南芥后代中,发现了一株矮小突变体。对其进行表型观察,发现突变体叶片颜色为深绿色、叶片椭圆、根系不发达、植株极度矮化、营养生长和生殖生长周期延长。通过基因组重测序技术对该突变体的遗传位点进行了定位,发现Hb CBF1基因的插入破坏了BRI1基因的编码,进而引起突变。通过实时荧光定量PCR对突变体中细胞周期相关基因CDKA、CDKB、CYCB1-1、CYCD3-1的表达量进行分析,发现这些基因的表达量显著低于野生型,推测BRI1基因的突变阻碍了细胞有丝分裂,从而造成矮化等表型。     

荧光素酶作为可视标记整株检测转基因玉米

利用活体成像系统检测转基因玉米中荧光素酶信号整株实时筛选高表达的转基因玉米。结果表明,按照信噪比大于2为高表达转基因阳性植株的标准,获得的T1代66株转pMD35LUC的植株中,11株有荧光信号,其中2株信噪比值大于2;获得的T1代68株转化pMDUBLUC的植株中,30株有荧光信号,6株信噪比值大于2。信噪比值大于2的植株移栽成活7株,经PCR检测均为阳性。2株T1植株的T2代植株无荧光信号值;5株T1植株的T2代植株都有数量不等的植株有荧光信号,其中4株T1株都有信噪比值大于2的T2代植株,经PCR检测均为阳性。本研究跳过一系列大量的操作复杂、耗时、高成本的体外分子检测,直观、准确、实时、低成本地淘汰大量非转基因和表达不强的植株或株系,为玉米转基因植株的筛选提供了有效方法。     

两个新的水稻Dwarf18基因强等位突变体的表型分析及分子鉴定

通过EMS诱变日本晴获得了s2-9和s1-146a两个矮秆突变体,其植株矮小,成熟期株高分别为日本晴的26.3%和19.2%;苗期叶片较宽,叶色深绿;穗型仍为散穗但穗长变短,粒型未发生改变。对水稻胚乳的α-淀粉酶诱导实验表明,这两个矮秆突变体与GA的信号传导途径无关,外源活性GA₃对水稻幼苗株高的促进实验显示它们应与赤霉素的生物合成有关。利用突变体与籼稻品种Dular分别杂交构建了F₂群体,精细定位表明这2个突变体的表型与水稻Dwarf18 (D18)基因紧密连锁。序列分析发现这两个矮秆突变体的D18基因均发生了突变：在s2-9突变体中D18基因的内含子3'' 拼接点发生单碱基突变,s1-146a中D18基因编码区的单碱基突变导致提前终止密码子的出现。RT-PCR结果显示,在s1-146a中D18基因表达明显增强,但在s2-9中未检测到D18基因的表达。     

水稻极度分蘖突变体的分离和遗传初步研究

通过EMS诱变处理栽培稻粳灿89(Oryza sative L.indica JX89）种子，从M2代植株中筛选得到一株突变体，其植株形态表现为叶细、色淡、植株矮化和极度分蘖。在将近一年的营养生长过程中，分蘖总数达到2000多个，命名为极度分蘖突变体（Excessive tillering mutant）ext37.ext 37自交所得M3和M4代植株表现同一表型。突变体自交及其与JX89和丰矮占5号（FAZ-5）发杂交F1、F2代结果表明该突变为显性遗传方式，可能涉及两对等位基因。为了观察突变基因对下游基因表达影响的程度，取生长期44天的亲本JX89和突变体ext37的节间分生组织提纯细胞总RNA，进行基因表达谱差异显示分析。结果表明突变体与亲本的基因表达模式有明显的差异，说明可能是处在上游调控基因的突变影响了下游许多基因的表达。目前有关分子生物学的进一步研究正在进行中。     

拟南芥低叶绿素荧光LCF3基因的克隆与功能分析

叶绿素荧光动力学技术在测定叶片光合作用中光系统对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面具有独特的作用。本研究借助叶绿素荧光成像仪, 从拟南芥EMS诱变突变体库中筛选到一株低叶绿素荧光突变体lcf3-1 (lower chlorophyll fluorescence 3-1)。遗传分析表明lcf3-1突变体为单基因隐性突变。突变基因图位克隆结果显示LCF3是PsbW的等位基因。另外, LCF3基因的T-DNA插入突变体及功能回补转基因植物的叶绿素荧光分析结果, 均证明LCF3基因突变导致拟南芥叶绿素荧光F_v/F_m值降低。进一步实验证明LCF3蛋白定位于叶绿体, 且LCF3基因在植株中普遍表达。PsbW蛋白可能细微调整PSII-LHCII超复合体的组装及稳定。     

拟南芥bZIP1转录因子通过与ABRE元件结合调节ABA信号传导

ABA作为一种重要的植物激素和生长调节剂,介导了高等植物在营养生长阶段对各种外界环境的响应和适应。bZIP类转录因子可以通过ABA依赖途径和ABA非依赖途径调节植物的生长发育和对非生物胁迫的耐性。本研究通过AtbZIP1 T-DNA插入突变的拟南芥植株ko-1 (SALK_059343)和ko-2 (SALK_069489C)在ABA处理后的表型实验,验证了AtbZIP1参与ABA依赖的信号传导通路。采用“三引物法”,分别在DNA水平和RNA水平通过PCR和RT-PCR验证了AtbZIP1基因在拟南芥突变体中的沉默效果。定量分析数据表明,在种子萌发阶段,经过0.6 μmol L^–1 ABA和0.8 μmol L^–1 ABA处理后,AtbZIP1缺失突变体拟南芥植株萌发率和叶片展开/绿色率比野生型植株高,在幼苗生长阶段,经过50 μmol L^–1 ABA处理后,AtbZIP1缺失突变体拟南芥植株根长比野生型植株长。为了确定AtbZIP1基因参与ABA信号传导是否依赖于ABRE元件,在大肠杆菌中表达了AtbZIP1 HIS6融合蛋白,并设计了核心序列为CACGTG的ABRE元件。凝胶阻滞电泳结果表明AtbZIP1融合蛋白可以与ABRE元件特异性结合。半定量RT-PCR分析表明,AtbZIP1基因的缺失改变了下游的ABA响应基因的表达。该结果表明AtbZIP1可以通过与ABRE元件结合调节植物对ABA处理的敏感性和下游ABA响应基因的表达,从而参与植物的ABA信号传导通路。     

EMS诱导小麦TcLr19感叶锈病突变体的筛选

为了利用小麦感叶锈病突变体进行抗病基因功能和机制研究,用EMS处理小麦抗叶锈病近等基因系Tc Lr19的种子,对获得的M2、M3植株进行农艺性状观察和田间抗叶锈性鉴定。结果显示,不同浓度的EMS溶液处理种子共获得367个M1单株,处理浓度为1.0%时,接近半致死剂量,且M2表型突变频率最高,适宜突变筛选。在2 359个M2突变群体中,共筛选到表型突变体38个,表型突变频率1.61%;筛选出感叶锈病突变体53个,感病突变频率2.25%。在459个M3感病突变群体中,共鉴定出146个感病突变体,其中M36-2、M333-8、M333-9、M333-11、M344-4、M396-8这6个M3感病突变材料,遗传稳定率较高,达70%以上。为保证结果的可靠性,试验中还利用Lr19的分子标记对突变体进行分子辅助筛选。结果表明,EMS诱变是获得小麦感叶锈病突变体的有效手段,不仅为小麦抗叶锈基因的克隆和功能研究提供了重要的基础材料,还为小麦育种提供了新的种质。     

水稻类病斑早衰突变体lmps1的表型鉴定与基因定位

经甲基磺酸乙酯(EMS)诱变优良籼型水稻恢复系缙恢10号,获得一个稳定遗传的水稻类病斑早衰突变体lmps1(lesion mimic and premature senescence 1)。该突变体苗期表型正常,分蘖早期出现褐色类病斑,且斑点数目随植株生长而增多,孕穗期叶片开始萎黄衰老。与野生型相比,突变体lmps1的每穗总粒数下降8%(P0.05),株高、穗长、有效穗数、每穗实粒数、结实率以及千粒重分别下降14.3%、24.3%、27.2%、50%、45.7%与14.5%,差异均达极显著水平(P0.01)。遮光处理表明,突变体lmps1的类病斑性状受光照诱导。孕穗期叶片光合色素含量下降且光合效率降低, H2O2含量增加,抗氧化酶SOD和CAT的活性显著降低。透射电镜观察结果显示,突变体lmps1叶肉细胞中叶绿体数目减少,叶绿体的类囊体片层结构损伤降解。qRT-PCR结果显示,突变体lmps1中防卫反应相关基因除POX22.3表达量降低外,POC1、PAL、PBZ1、PR1、NPR1、PR5表达量均极显著高于野生型。遗传分析表明突变体lmps1的类病斑早衰性状受1对隐性核基因控制,利用西农1A与突变体lmps1杂交所得F2群体中的突变株,将目标基因定位于第7染色体长臂端粒附近约167.3 kb的物理区段内。     

矮杆和半矮杆大豆突变体植株生长对外源GA3的响应

矮杆和半矮杆突变体是研究植物基因功能和培育高产作物新品种的重要材料。本研究以矮杆和半矮杆大豆突变体与各自野生型品种为材料, 利用外源赤霉素(GA₃)处理不同发育时期植株, 研究植株生长速率和成熟期株高性状发育对外源GA₃的响应及主茎纵向细胞的形态学变化, 分析两类突变体与各自野生型之间的内源赤霉素含量差异。结果表明, 外源GA₃(40 mg L^-1)对半矮杆和矮杆突变体的作用效果明显不同, GA₃处理后半矮杆突变体植株在不同测定时段的平均生长速率达到2.76 cm d^-1, 而矮杆突变体的平均生长速率仅为0.92 cm d^-1, 而且成熟期半矮杆突变体植株的平均高度、主茎平均节间长度与节间纵向细胞长度均显著超过对照, 外源GA₃能够恢复其正常的野生型株高表型; 而矮杆突变体较对照的上述3项增幅均明显小于半矮杆型, 外源GA₃不能恢复其正常的野生型株高表型。说明半矮杆突变体的植株生长对外源GA₃有明显响应, 为GA₃敏感型突变体; 而矮杆突变体仅在生育前期对外源GA₃有一定程度响应, 为GA₃钝感型突变体。半矮杆和矮杆突变体成熟期植株的内源GA₃₊₁含量均显著低于各自野生型品种, 这可能是二者表型矮化的生理原因。     

玉米ZmBRI1基因的克隆、表达及功能分析

油菜素内酯(BRs)是一种重要的甾族类激素,在植物的生长过程中起着重要的作用。本研究利用同源克隆的方法,从玉米B73自交系中获得了一个新的油菜素内酯受体蛋白编码基因ZmBRI1,该基因全长为3369 bp,编码1122个氨基酸。亚细胞定位分析表明,ZmBRI1蛋白定位于细胞膜上,而且ZmBRI1在各个玉米的各个组织器官中都有表达,其中在幼嫩的组织中表达最高。利用转基因技术将ZmBRI1导入BR不敏感突变体bri1-5中,获得的转基因植株修复了其表型,特别是植株高度、叶片形态和果荚大小。与突变体bri1-5比较,油菜素内酯(brassinolide,BL)处理显著抑制转基因株系根系生长;丙环唑(propiconazole,Pcz)处理显著抑制了下胚轴生长;同时转基因株系DWF4和CPD基因的表达量下降。此外,在野生型(Ws)中过表达ZmBRI1,显著提高了拟南芥在ABA抑制条件下的种子萌发率和植株生长,下调了ABA响应基因RD29A、RD29B、ABI5和RAB18的表达。因此,ZmBRI1不仅参与了植物的形态建成和BR的信号传导,而且参与调控了植物对ABA信号的响应。     

矮杆和半矮杆大豆突变体植株生长对外源GA3的响应

矮杆和半矮杆突变体是研究植物基因功能和培育高产作物新品种的重要材料。本研究以矮杆和半矮杆大豆突变体与各自野生型品种为材料, 利用外源赤霉素(GA₃)处理不同发育时期植株, 研究植株生长速率和成熟期株高性状发育对外源GA₃的响应及主茎纵向细胞的形态学变化, 分析两类突变体与各自野生型之间的内源赤霉素含量差异。结果表明, 外源GA₃(40 mg L^-1)对半矮杆和矮杆突变体的作用效果明显不同, GA₃处理后半矮杆突变体植株在不同测定时段的平均生长速率达到2.76 cm d^-1, 而矮杆突变体的平均生长速率仅为0.92 cm d^-1, 而且成熟期半矮杆突变体植株的平均高度、主茎平均节间长度与节间纵向细胞长度均显著超过对照, 外源GA₃能够恢复其正常的野生型株高表型; 而矮杆突变体较对照的上述3项增幅均明显小于半矮杆型, 外源GA₃不能恢复其正常的野生型株高表型。说明半矮杆突变体的植株生长对外源GA₃有明显响应, 为GA₃敏感型突变体; 而矮杆突变体仅在生育前期对外源GA₃有一定程度响应, 为GA₃钝感型突变体。半矮杆和矮杆突变体成熟期植株的内源GA₃₊₁含量均显著低于各自野生型品种, 这可能是二者表型矮化的生理原因。     

快中子辐射星油藤突变体库的构建及其突变体筛选

星油藤(Plukenetia volubilis L.)是大戟科(Euphorbiaceae)多年生木质藤本油料植物,其种子油富含多不饱和脂肪酸,其中α-亚麻酸含量高达44.2%～50.8%,被认为是开发高营养价值保健食用油的理想原料之一。但星油藤易感染由尖孢镰刀菌引起的致死性根茎基腐病,严重限制了其推广种植。且因中国星油藤品种资源单一,无法采用传统的杂交育种方法获得抗病高产的新品种。因此,星油藤研究中的当务之急是创制新的种质资源。本研究采用快中子辐射诱变星油藤种子进行新种质创制。首先探索了不同快中子辐射剂量对星油藤成苗率的影响,以确定半致死剂量。然后采用半致死剂量快中子辐射星油藤种子构建突变体库,对M1代植株的生物学及其农艺性状进行观测分析。结果表明:(1)星油藤种子的快中子辐射半致死剂量约为47.6 Gy;(2)快中子辐射抑制了星油藤M1代幼苗生长;(3)快中子辐射的星油藤植株表型变异类型丰富,具有肉眼可见表型变异的植株占M1代存活株的9.2%,其中诱变株3A423果实显著增大,种子单粒重是野生型的1.8倍;(4)采用随机扩增多态性DNA技术(Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)鉴定了5株具有扩增产物多态性的突变株。本研究获得的突变体材料将有助于星油藤遗传育种和功能基因组学的进一步研究。     

LAZY1通过BR途径调控水稻叶夹角的发育

叶夹角的大小直接影响水稻叶面积指数,进而调控群体光合作用,是水稻株型育种中重要的指标,研究其发育机制对水稻株型育种具有重要的意义。利用EMS诱变籼型水稻保持系西大1B,获得一个植株散生且叶夹角变大的突变体s524。田间种植条件下,苗期s524的叶夹角极显著大于野生型;分蘖期s524的分蘖角极显著增大,株型松散;成熟期s524整个植株呈匍匐状生长。而野生型株型在整个生育期均保持相对紧凑,叶夹角较小。石蜡切片分析显示,s524叶夹角增大是由叶枕近轴面细胞变大造成的。s524的主要农艺性状与野生型相比无明显变化。遗传分析表明该性状受1对隐性核基因控制,利用SSR标记进行基因定位,最终将S524定位在第11染色体标记RM4746和RM26742之间324 kb的物理范围内,包含散生基因LAZY1。测序结果显示s524突变体在LAZY1第3外显子上发生了一个T到C的碱基替换,导致第143位氨基酸由野生型的缬氨酸突变为丙氨酸,表明s524是一个新的LAZY1等位突变体。s524对外源油菜素内酯(BR)的敏感性降低,BR信号传导途径关键基因BU1在s524中的表达上调了近10倍,早期研究表明BU1基因的过表达可导致叶夹角变大。推测LAZY1/S524可能通过BR信号传导途径调控水稻叶夹角的发育。     

LAZY1通过油菜素内酯途径调控水稻叶夹角的发育

叶夹角的大小直接影响水稻叶面积指数,进而调控群体光合作用,是水稻株型育种中重要的指标,研究其发育机制对水稻株型育种具有重要的意义。利用EMS诱变籼型水稻保持系西大1B,获得一个植株散生且叶夹角变大的突变体s524。田间种植条件下,苗期s524的叶夹角极显著大于野生型;分蘖期s524的分蘖角极显著增大,株型松散;成熟期s524整个植株呈匍匐状生长。而野生型株型在整个生育期均保持相对紧凑,叶夹角较小。石蜡切片分析显示,s524叶夹角增大是由叶枕近轴面细胞变大造成的。s524的主要农艺性状与野生型相比无明显变化。遗传分析表明该性状受1对隐性核基因控制,利用SSR标记进行基因定位,最终将S524定位在第11染色体标记RM4746和RM26742之间324 kb的物理范围内,包含散生基因LAZY1。测序结果显示s524突变体在LAZY1第3外显子上发生了一个T到C的碱基替换,导致第143位氨基酸由野生型的缬氨酸突变为丙氨酸,表明s524是一个新的LAZY1等位突变体。s524对外源油菜素内酯(BR)的敏感性降低,BR信号传导途径关键基因BU1在s524中的表达上调了近10倍,早期研究表明BU1基因的过表达可导致叶夹角变大。推测LAZY1/S524可能通过BR信号传导途径调控水稻叶夹角的发育。     

水稻葡聚糖内切酶新基因OsGLU16的克隆及特性研究

β-1,4-葡聚糖内切酶(endo-β-1,4-glucanase,EGase)在植物的组织生长、开花、果实成熟、器官脱落等方面都具有非常重要的作用。本研究克隆了一个新的水稻β-1,4-葡聚糖内切酶家族基因Os GLU16。序列分析表明该基因位于水稻第8号染色体,c DNA全长1 827 bp,包含一个1 572 bp的开放阅读框,编码523个氨基酸残基。蛋白质同源性分析表明,Os GLU16基因编码的蛋白在第54~第516个氨基酸残基区域具有高度保守的GH9催化结构域。本研究成功构建了Os GLU16基因过表达载体p Ca MV35S-Os GLU16-EGFP,并获得了转基因水稻植株。植株表型分析表明,与野生型相比,过表达株系表现为株高和穗长显著下降。本研究初步探明了Os GLU16基因过表达转基因水稻植株的表型特征,这为进一步丰富β-1,4-葡聚糖内切酶基因家族在水稻生长发育过程中的作用提供理论基础。     

EMS诱变甘蓝型油菜获得高油酸突变体

用0.4％ EMS诱变甘蓝型油菜NJ7982种子,从M2代筛选得到1个油酸含量76.15％的突变株(M2-2080),M3代该突变体的油酸含量也达到了75.0％ (M3-2080-1).对高油酸突变体M3-2080-1和野生型BnFA D2基因进行克隆,分析突变体油酸含量高的原因.序列表明,高油酸突变体中,BnFA D...     

水稻早衰突变体esl-H5的表型鉴定与基因定位

在甲基磺酸乙酯(EMS)诱变粳稻淮稻5号的突变体库中,筛选到一个稳定遗传的叶片黄化早衰突变体esl-H5(early senescence leaf H5)。该突变体幼苗期表型正常,播种后50 d开始出现下部叶片黄化早衰表型。与野生型相比,esl-H5突变体抽穗期延迟,株高、穗长、穗粒数、有效分蘖数、千粒重等均显著降低,叶绿素含量显著减少。遗传分析表明该突变受一对隐性基因调控。分子标记定位结果显示,该突变基因定位于1号染色体。通过MutMap分析发现编码胼胝质合成酶基因Os01g0533000的最后一个外显子内有一个碱基G变成了A,这导致翻译提前终止。进化树分析结果显示, ESL-H5与拟南芥AtGSL7 (Glucan Synthase-Like 7)同源性最高。糖含量测定表明esl-H5突变体中可溶性糖和淀粉含量增高,推测ESL-H5功能缺失后影响了光合产物的转运,导致叶片中糖含量显著增高,进而引起叶片衰老。qRT-PCR结果显示, esl-H5突变体中抗病相关基因PR1a、PR1b、PR2、PR4、PR5和PR10表达量均高于野生型,这与突变体的白叶枯病抗性明显提高一致。上述研究...     

无毛黄瓜抗蚜性与挥发性物质的关系

蚜虫是黄瓜主要害虫之一,严重危害黄瓜生产。叶片挥发性物质种类和数量影响害虫的侵染,是抗虫性的一个重要方面。以普通有毛黄瓜及其突变体无毛黄瓜、少毛黄瓜为试材,研究黄瓜叶片挥发性物质与抗蚜虫特性的关系。结果表明,无毛黄瓜抗性最强,少毛黄瓜次之,普通的有毛黄瓜不抗蚜虫;无毛黄瓜受蚜虫侵染或外部刺激后,挥发性物质种类及数量发生变化,产生了对害虫具驱避作用的罗勒烯,而对害虫有吸引作用的1-己醇及3-己烯醛则消失;外部喷施罗勒烯能增强3种试材抗蚜虫能力,验证了罗勒烯对蚜虫具驱避作用。