荧光素酶表达载体yy630的构建及鉴定

使用Promega公司pNL1.1[Nluc]载体的Nluc’基因替换yy621载体中的LUC+基因,构建yy630载体。通过PCR扩增的方法从pNL1.1[Nluc]载体中得到带有BglⅡ和XbaⅠ限制性酶切位点的Nluc’基因片段,经BglⅡ和XbaⅠ消化后的片段插入到载体yy621的BglⅡ和XbaⅠ酶切位点之间,替换原有的LUC+基因。Nluc’基因是通过ATGGCTATGGCT序列替换pNL1.1[Nluc]载体Nluc基因的起始密码子ATG而形成的。经菌落筛选、PCR鉴定和测序验证,阳性菌落中的Nluc’基因序列与载体pNL1.1[Nluc]中的Nluc基因序列完全一致,载体630构建成功。本研究通过比较分析并筛选出适合植物体研究的荧光素酶载体对于研究植物基因调控机理有着重要的意义。     

棉花纤维特异表达GhCesA4启动子的克隆及序列分析

 以新疆陆地棉品种新陆早19的DNA为模板,克隆了棉花纤维特异启动子GhCesA4,GenBank登录号：EU183119 ,将启动子基因序列克隆到pMD19-T载体中,由载体通用引物M13-47、RV-M 经PCR鉴定获得pMD19-T/GhCesA4重组载体。测序和序列分析表明,该启动子序列由1503 bp核苷酸组成,与GenBank中GhCesA4基因启动子序列同源性高达98％。分别用限制性内切酶ClaⅠ和BamⅠ双酶切重组质pMD19-T/GhCesA4和双元植物表达载体pBI121,分别回收pMD19-T/GhCesA4重组质粒中的GhCesA4小片段和pBI121 植物表达载体中缺失CaMV35S组成型启动子的大片段,经连接、转化、酶切及测序鉴定,获得由GhCesA4驱动报告基因GUS的新型植物表达载体,命名为pBI-GhCesA4     

种子特异表达启动子的克隆分析及其植物表达载体的构建

根据GenBank已公布的种子特异性的Oleosin蛋白基因启动子序列设计合成引物,利用PCR技术从油菜总基因组DNA中扩增出Oleosin基因启动子序列(SOP),将该序列克隆到pGM-T载体中,经鉴定获得pGM-T-SOP重组载体。测序和序列分析表明,该启动子序列由899 bp核苷酸组成,其核苷酸序列与GenBank中的Oleosin基因启动子序列同源性高达95.6%。分别用限制性内切酶HindⅢ和BamH I双酶切重组质粒pGMT-SOP和双元植物表达载体pBI121,分别回收pGMT-SOP重组质粒中的SOP小片段和pBI121植物表达载体中去掉CaMV35S组成型启动子的大片段,经连接、转化和鉴定,获得由SOP驱动报告基因GUS的新型植物表达载体pBI121-SOP,为外源基因在油菜种子中的定位表达研究奠定基础。     

木霉双价基因表达载体的构建

利用几丁质酶基因和β-1,4-葡聚糖酶基因构建双价基因表达载体,为木霉转化奠定基础。利用限制性内切酶酶切得到目的基因片段,通过T4 DNA ligase将基因插入表达框中,并采用PCR、酶切和核苷酸序列分析验证双价基因表达载体的正确性。利用启动子CaMV35S和终止子PolyA构建几丁质酶基因chi42的表达框,获得表达载体pC1302-C42;利用启动子CaMV35S和终止子Nos构建β-1,4-葡聚糖酶基因glu14的表达框,获得表达载体pC1300-2-G14;在单基因表达载体的基础上,通过串联构建双价基因表达载体pC1300-2-G14-C42,该表达载体含有潮霉素B抗性基因。经检测证实表达元件35S-chi42- PolyA和35S-glu14-Nos连接成功。得到的双价基因表达载体pC1300-2-G14-C42可直接用于木霉等丝状真菌的遗传转化,为构建木霉广谱高效工程菌株奠定基础。     

葡萄糖氧化酶基因植物表达载体的构建

为进一步开展转基因研究创造条件,用限制性内切酶将葡萄糖氧化酶(GOD)基因从pMD/GO载体上切下,定向连接到植物表达载体pROKⅡ的CaMV35S启动子下游和NOS终止子上游,成功地构建了GOD基因植物表达载体pROK/GO。利用冻融法将此表达载体导入根癌农杆菌LBA4404中,提取转化质粒,经PCR和酶切鉴定表明,GOD基因植物表达双元载体构建成功。     

草莓乙烯受体FaEtr2基因的克隆及其反义表达载体的构建

为了构建草莓乙烯受体FaEtr2基因的反义表达载体,在已报道的FaEtr2基因序列的基础上,设计特异引物,克隆草莓乙烯受体FaEtr2基因部分特异序列,将该片段反向插入植物表达载体pBI121的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,构建了反义表达载体pBI121Etr2。通过双酶切鉴定后,导入农杆菌EHA105中,酶切和PCR鉴定表明质粒已导入到农杆菌中。本研究为后期该反义基因转化草莓品种以改良草莓果实耐贮运性打下基础。     

草莓乙烯受体FaEtr2基因植物表达载体构建

为通过转基因技术改善草莓的贮运性能,以全明星草莓为试材,克隆了与草莓成熟有关的FaEtr2基因的2个片段,并构建了该基因的反义和正义植物表达载体。根据已克隆的草莓乙烯受体FaEtr2基因序列及表达载体pBI221上的酶切位点设计2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增到2个全明星草莓FaEtr2基因片段。两片段经双酶切消化后分别以正、反两个方向插入到植物表达载体pBI221的35 S启动子和NOS终止子之间,分别构建成All Star-FaEtr2基因的正、反义植物表达载体。     

玉米醇溶蛋白γ-zein基因载体构建及亚细胞定位

用PCR方法从pROK.TG1LK扩增得到γ-zein基因的全长,克隆到中间载体pMD18-T,获得了重组质粒pMD18-γ-zein,分别用Nco Ⅰ和Bgl Ⅱ 2种限制性内切酶酶切重组质粒和经过改良的pCAMBIAI 1302载体,经回收、连接、转化、鉴定后,构建了由35S驱动的绿色荧光蛋白(GFP)融合的植物表...     

抗旱、耐盐基因P5CS植物表达双元载体的构建

以含有P5CS的重组质粒pBIP5CS—F129A为模板,通过PCR的方法获得了目的基因P5CS（1905bp）并将其克隆到pBS—T载体上。利用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ将P5CS基因从克隆载体上消化下来,定向插入到无GUS基因植物表达载体pCHF3的CaMV35S启动子和NOS终止子之间。通过冻融法将此表达载体导入农杆菌LBA4404中,经PCR鉴定表明,P5CS基因植物表达双元载体构建成功。     

上西早生柿ETR5基因RNAi植物表达载体构建及遗传转化研究

据已测序的上西早生柿ETR5基因序列,设计了2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增到2个ETR5-Uenishiwase基因片段。2个片段经单酶切消化后连接成反向互补的大片断。连接片断经双酶切消化后,定向连接到植物表达载体pSMAK321的35S启动子和NOS终止子之间,构建成Uenishiwase-ETR5基因的RNA干扰植物表达载体。载体质粒经酶切鉴定正确后通过冻融法转入根癌农杆菌EHA101中。以上西柿组培苗叶片为外植体,优化遗传转化体系,结果表明:农杆菌重悬液和共培养基中均添加200μmol/L的AS及Spc梯度筛选能有效提高转化率。转化植株经PCR检测得到7株阳性植株。     

FaGST基因改良菊苣新种质创制

谷胱甘肽转移酶(glutathione transferases,GSTs)在植物抵御逆境胁迫中具有非常重要的作用.从高羊茅叶片中克隆获得FaGST基因,对其进行酶切位点分析,设计酶切引物,通过Bam HI和PstⅠ双酶切将目的基因片段连接在真核表达载体pCAMBIA 1300-35 S上,成功构建pCAMBIA 13...     

乙醇酸氧化酶基因植物表达载体构建及转化苹果的研究

为了研究GO基因在植物中的功能,获得转基因植株,用限制性内切酶将乙醇酸氧化酶(GO)基因从克隆载体pBSSP5上切下,连接到植物双元表达载体pBin117的CaMV 35S启动子和NOS 终止子之间,成功构建了GO基因植物表达载体pBinGO.在此基础上以嘎拉苹果叶片为受体,通过根癌农杆菌介导法将GO基因导入苹果,获得了2个抗性芽,PCR检测初步表明GO基因已整合到嘎拉苹果基因组中.     

甜菜BvWRKY23基因的RNAi载体构建

WRKY转录因子家族成员在调控植物生长发育、应答生物与非生物胁迫等方面具有重要的生物学功能。以抗旱甜菜（Beta vulgaris L.）幼苗为材料,提取叶片总RNA并反转录为cDNA,通过RT-PCR方法扩增获得甜菜WRKY转录因子家族成员BvWRKY23基因的RNAi靶片段,以中间载体PBSK-RTM作为媒介,利用传统的“酶切-连接”法构建了含有CaMV 35S启动子、BvWRKY23基因片段反向重复序列的RNAi（RNA interference）植物表达载体pCambia2301ky-BvWRKY23-RNAi。     

家蚕抗菌肽attacin基因植物表达载体的构建

抗菌肽是昆虫抵御外界微生物侵染的主要物质。本文利用双酶切将pBI121载体上的植物启动子CaMV35S克隆到植物表达载体pCAMBIA2300上,构建重组表达载体pCAMBIA2300-CaMV35S。PCR扩增家蚕抗菌肽attacin基因编码区全长并利用T载体成功克隆（GenBank登陆号：GU244351）,然后利用双酶切将attacin 基因亚克隆到pCAMBIA2300-CaMV35S上,通过PCR鉴定,成功构建了attacin基因的植物表达载体pCAMBIA2300-CaMV35S-attacin。为研究attacin基因在植物抗病性方面的应用奠定基础。     

pBI121载体酶切位点添加及拟南芥Na+/H+逆向转运蛋白基因表达载体的构建

对pBI121载体GUS基因后的终止子序列（Sac Ⅰ-EcoR Ⅰ）通过PCR扩增法进行了酶切位点的添加，即在SacⅠ后添加了XhoⅠ、在EcoRⅠ前添加了KpnⅠ。序列分析发现，两个酶切位点的添加是成功的，但扩增的终止子序列与原序列的同源性间有差异，即有4个碱基发生了变异，特别是第17个碱基位点出现了缺失。利用绿色荧光蛋白（GFP）对添加酶切位点载体进行了终止子活性的检测，结果发现，它与携带GFP的pBI121载体一样，GFP基因能正常表达，说明pBI121载体终止子序列酶切位点的添加是成功的。利用改造后的载体（pBI121-GZ）构建了CaMV35S启动子驱动AtNHX1基因的植物表达载体。     

pBⅠ121载体酶切位点添加及拟南芥Na~+/H~+逆向转运蛋白基因表达载体的构建

对pBI121载体GUS基因后的终止子序列(SacⅠ-EcoRⅠ)通过PCR扩增法进行了酶切位点的添加,即在SacⅠ后添加了XhoⅠ、在EcoRⅠ前添加了KpnⅠ。序列分析发现,两个酶切位点的添加是成功的,但扩增的终止子序列与原序列的同源性间有差异,即有4个碱基发生了变异,特别是第17个碱基位点出现了缺失。利用绿色荧光蛋白(GFP)对添加酶切位点载体进行了终止子活性的检测,结果发现,它与携带GFP的pBI121载体一样,GFP基因能正常表达,说明pBI121载体终止子序列酶切位点的添加是成功的。利用改造后的载体(pBI121-GZ)构建了CaMV35S启动子驱动AtNHX1基因的植物表达载体。     

甜菜NAC转录因子家族BvNAC46基因的RNAi载体构建

NAC转录因子家族成员在调控植物生长发育、参与植物生物和非生物胁迫等方面发挥着重要作用。本研究以抗旱甜菜(Beta vulgaris L.)幼苗叶片为材料,提取叶片总RNA并反转录cDNA,通过PCR方法扩增获得甜菜NAC转录因子家族成员BvNAC46基因的RNAi靶片段,利用中间载体pBSK作为媒介,采用传统的"酶切-连接"法构建了含有CaMV 35S启动子、BvNAC46基因片段反向重复序列的RNAi (RNA interference)植物表达载体pCambia2301ky-BvNAC46-RNAi,为进一步鉴定BvNAC46基因在甜菜抗旱中的功能及其作用机制奠定基础。     

大豆硬脂酸-ACP脱饱和酶基因启动子的克隆及其表达活性分析

以吉豆2号基因组为模板,通过TAIL PCR方法,扩增得到大豆硬脂酸-ACP脱饱和酶基因启动子片段SACPD-Cp。PLACE在线启动子预测分析表明, 该序列中含有多种典型的种子特异性表达序列元件。将SACPD-Cp片段取代pCAMBIA1301质粒中的CaMV35S启动子,构建表达载体pCAM-SACPD-Cp,通过农杆菌介导法在大豆组织中进行瞬时表达,GUS组织化学染色和荧光定量研究其表达特性。结果表明, SACPD-Cp驱动GUS基因在种子中的表达活性是CaMV35S启动子的93.01%;SACPD-Cp启动子与现已知启动子无同源性,仅在大豆种子中检测到GUS活性,而在根、茎和叶组织中均未检测到GUS活性,证实 SACPD-Cp是一个新的种子特异性启动子。     

蓖麻耐盐基因HKT的克隆及表达载体构建

为挖掘蓖麻耐盐相关基因,以盐生植物蓖麻(Ricinus communis L.)叶片为材料。设计特异性引物,克隆高亲和性钾离子转运蛋白(high-affinity K+transporter,HKT)耐盐基因,并对其序列进行生物信息学分析。结果表明,该基因全长1 596 bp,编码531个氨基酸,推测分子量为59.74 kD,等电点(pI)为9.32。多重序列比对和系统发育树分析表明该蛋白与木薯和橡胶树的同源性最高,分别为69.13%和67.03%,且与HKT1蛋白家族成员同源性较高,为S-G-G-G类型蛋白,推测该蛋白为HKT1类蛋白。二级结构预测蓖麻HKT蛋白有9个跨膜结构域,主要定位于内质网上,是典型的跨膜蛋白。根据蓖麻HKT基因序列设计带有Bam HⅠ和PstⅠ酶切位点的引物扩增出全长基因,用限制性内切酶Bam HⅠ和PstⅠ进行双酶切后与表达载体pCHF-3300连接。本研究成功构建了蓖麻HKT基因的表达载体,为进一步研究该基因的转化及功能验证提供参考。