大豆ZF-HD转录因子GmZHD1的克隆及表达分析

为了揭示大豆ZF-HD基因的生物学功能,通过PCR的方法,从大豆栽培豆科丰1号中克隆了ZF-HD转录因子Glyma.02g040100,命名为GmZHD1。生物信息学分析表明,该基因的c DNA全长为888 bp,编码295个氨基酸,GmZHD1蛋白分子量约为32.64 k Da,等电点为7.69;序列分析表明,GmZHD1含有ZF-HD家族保守的锌指结构域和同源异形盒结构域,GmZHD1与Ft HB2蛋白序列一致性最高,为44.4%;亚细胞定位结果显示GmZHD1定位于细胞核;荧光定量PCR结果表明,GmZHD1在大豆不同组织中都有表达,其中,花、种子和叶片中表达较高。此外,将GmZHD1基因连接到植物过表达载体p BA002上,为进一步研究大豆GmZHD1基因的功能奠定了基础。     

苦瓜转录因子McEIL2的克隆及其表达分析

本研究从已构建的苦瓜果实均一化文库筛选得到一个EIN3-like同源EST序列,结合RACE技术,克隆得到EIN3基因c DNA全长序列,命名为Mc EIL2(Gen Bank登录号:KF595122)。该基因全长2 122 bp,开放阅读框1 890 bp,编码629个氨基酸,预测该蛋白的分子量为71.58 k D,与黄瓜Cus EIN3、甜瓜Cm EIL1、苜蓿Mt EIL1、绿豆Vr EIL1和番茄Le EIL1的蛋白同源性分别为89.61%、78.37%、71.23%、69.09%和65.66%。Mc EIL2基因的编码蛋白亚细胞定位于细胞核,荧光定量分析表明Mc EIL2基因表达量在幼果期先强后弱,绿熟期最低,破色期表达量大幅增加至最高随后下降,推测该基因参与苦瓜果实成熟软化调控过程。本研究初步明确了Mc EIL2基因在苦瓜成熟过程表达模式,可为今后进一步揭示苦瓜果实成熟软化的分子机制奠定基础。     

甜菜MYB转录因子生信分析及种子萌发期差异表达

本研究旨在了解干旱环境下甜菜MYB基因家族的表达模式。主要研究方法为对利用15%PEG模拟的干旱胁迫处理试验组和蒸馏水对照组萌发期甜菜的转录组进行了高通量测序。结果表明,共获得79个MYB转录因子,其中42个在干旱胁迫下差异表达,氨基酸序列分析表明,甜菜萌发期 MYB 转录因子含有 8个保守元件,8个保守元件的结构域所含有的氨基酸位点数量不一致,推测与相应的DNA分子进行结合和行使功能有关。本研究通过对萌发期甜菜应答干旱胁迫的MYB 基因分析,为甜菜抗干旱胁迫育种提供基因资源和理论基础。     

大豆GmNramp3a基因克隆及表达分析

本研究利用RT-PCR技术从大豆中克隆了一个Nramp基因家族成员GmNramp3a,并对其基因序列和蛋白结构、亚细胞定位以及表达模式进行了详细分析。生物信息学分析结果表明,GmNramp3a基因开放阅读框(open reading frame, ORF)长度为1 557 bp,由4个外显子组成;Gm Nramp3a蛋白包含11个跨膜结构域(trans-membrane domain, TMD);进化树分析的结果显示Gm Nramp3a蛋白和模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)的AtNramp2的同源性较高。通过拟南芥原生质体瞬时表达亚细胞定位分析表明,Gm Nramp3a蛋白主要定位于液泡膜。采用实时荧光定量PCR对GmNramp3a在大豆不同组织部位的表达量进行分析,结果表明GmNramp3a在茎、根、花和叶几个部位都能表达,尤其在茎和花中的表达量较高。本研究结果可为将来深入分析Gm Nramp3a的生物学功能提供理论基础。     

茶树bZIP转录因子基因CsbZIP1的克隆与表达定位

碱性亮氨酸拉链蛋白(bZIP)作为真核生物中分布最广、最保守的一类转录因子,参与多种生物学过程,尤其在植物抵御各种逆境胁迫中有重要作用。采用RACE和RT-PCR技术克隆到茶树bZIP转录因子基因全长cDNA序列,命名为CsbZIP1(GenBank登录号为JX050148.1)。该基因cDNA全长1515 bp,包含813 bp的完整开放阅读框(ORF),编码270个氨基酸,预测分子量29.484 kD;含有bZIP家族典型的BRLZ结构域碱性结构域和亮氨酸拉链,属于B_-zip1家族;系统发育树分析显示CsbZIP1属于bZIP转录因子F亚家族;亚细胞定位结果表明CsbZIP1主要定位于细胞核;qRT-PCR分析表明,4℃低温和NaCl盐胁迫处理均能诱导CsbZIP1的表达,表达量变化趋势都是随着胁迫时间先逐渐升高,到24 h时降低,ABA胁迫处理24 h抑制CsbZIP1的表达。推测CsbZIP1与茶树低温、盐等逆境胁迫密切相关。     

不同水稻品种OsVDAC3及3个互作蛋白基因OsV3IP1-3表达模式分析

为研究OsVDAC3及互作蛋白基因OsV3IP1-3的表达模式,用生物信息学和定量PCR方法分析了水稻不育系‘粤泰A’(YTA)、保持系‘粤泰B’(YTB)和‘日本晴’(NIP)不同发育时期幼穗,四叶期根、鞘和叶中OsVDAC3和OsV3IP1-3的表达量。生物信息学分析表明在ATG上游含有21个与水稻生长发育及胁迫应答相关的顺式作用元件;RiceXPro和MSU Rice Genome Annotation Project水稻基因表达数据库分析结果表明在NIP中OsV3IP1只在幼苗表达,而OsVDAC3、OsV3IP2和OsV3IP3在整个生活周期都表达,但OsVDAC3在花药表达水平最高,OsV3IP2在生殖器官表达水平最高,OsV3IP3在嫩芽中表达量最高。定量PCR结果表明OsVDAC3和OsV3IP1-3基因在NIP、YTA和YTB 3个水稻品种中表达模式不同。OsVDAC3在YTB的1.5～4.0 cm幼穗表达水平非常高,OsV3IP1在3个品种的四叶期地上部都有非常高的表达,OsV3IP2和OsV3IP3在YTB和NIP中表达模式相似,而与YTA中差异明显。这些基因的表达模式与功能的关系有待进一步研究。     

月季R2R3-MYB转录因子全基因组鉴定与分析

月季是世界著名的观赏植物,具有极高的观赏价值和经济价值.本研究基于月季基因组利用生物信息学对月季R2R3-MYB基因家族进行全面鉴定,并对这些基因的结构、保守域和组织特异表达进行研究,解析月季R2R3-MYB转录因子在月季发育过程中的生物学功能.根据己报道的拟南芥R2R3-MYB基因,利用本地BLAST以及Hmmer工具鉴定月季基因组(Rosa chinensis' Old blush')中的R2R3-MYB基因,共鉴定出120个月季R2R3-MYB家族基因.系统进化树分析表明,月季R2R3-MYB家族基因可被分为34个亚组;其家族成员氨基酸序列N端均含有2个不等重复结构域R2和R3;基因结构分析显示,月季R2R3-MYB家族基因含有1～11个外显子;染色体定位发现120个基因分别定位在月季的7条染色体上,并发生8次串联重复事件;通过对基因组相关性分析共发现16对重复基因的R2R3-MYB基因簇.基因表达模式分析表明,120个基因在月季发育中均有表达,根据表达聚类分析可分为6个亚组,每个亚组之间存在表达差异.     

番茄转录因子基因SlYAB2a的克隆、表达及亚细胞定位分析

为了研究番茄SlYAB2a基因的功能及其在番茄生长发育中的分子机理,以番茄的cDNA为模板,利用RTPCR技术从番茄中克隆到SlYAB2a基因,该基因编码的蛋白质由192个氨基酸残基组成,蛋白质的分子量为21.35k Da,等电点是8.79,平均亲水系数是-0.487。SlYAB2a蛋白质的6~165位氨基酸残基形成Pfam:YABBY结构域,在20~47位有1个C2C2锌指结构域,在122~181位有1个螺旋-环-螺旋结构域。二级结构分析表明SlYAB2a蛋白分子中,α-螺旋占19.79%、β-折叠占14.06%、其余66.15%为不规则卷曲。蛋白多序列比对表明SlYAB2a与马铃薯、林烟草、酿酒葡萄、大豆、拟南芥、甘蓝型油菜、花药野生稻、玉米和小麦YABBY2的一致性分别为98%,78%,71%,65%,64%,64%,58%,57%,57%,说明SlYAB2a蛋白与来源于双子叶植物的YABBY2一致性较高,而与来源于单子叶植物的一致性较低。通过聚类分析发现YABBY2蛋白明显分为单子叶和双子叶2个亚类,SlYAB2a蛋白属于双子叶亚类,与马铃薯、潘那利番茄、绒毛状烟草、林烟草等的YABBY2蛋白序列亲缘关系较近。实时定量RT-PCR分析结果表明,在番茄植物的不同生长发育时期,根、茎、叶、花、果实中,都有SlYAB2a基因表达;并且在花和青熟果实中,SlYAB2a基因表达水平远远高于其他组织。说明SlYAB2a基因在花和果实的发育过程中起着重要作用。洋葱表皮细胞瞬时表达结果表明SlYAB2a蛋白定位于细胞核中。     

乌拉尔甘草转录因子GlMYB84的克隆及其过表达分析

为了探析转录因子GlMYB84在调控甘草黄酮类化合物合成过程中的作用,克隆并对其表达情况与甘草黄酮合成之间的关系进行分析。根据前期转录组测序结果,用PCR方法扩增获得GlMYB84基因的全长cDNA序列并进行生物信息学分析,亚细胞定位确定其编码蛋白在细胞中的位置。采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测GlMYB84基因在各个组织中及不同生长阶段的表达量,过表达后检测甘草黄酮的含量。结果首次在甘草中克隆到GlMYB84基因,其cDNA序列包含1个1 167 bp的ORF,共编码341个氨基酸,在细胞核中发现编码的蛋白质。GlMYB84的表达水平在甘草根中较高,且随着植株的生长而增高。黄酮的含量与基因的表达量呈正相关。本研究为植物细胞培养技术工业化生产甘草黄酮类化合物提供了参考理论依据。     

柑橘R2R3-MYB类转录因子CitMYB20的克隆与表达分析

为解析柑橘R2R3-MYB转录因子家族成员CitMYB20基因的分子生物学特征及受柑橘黄龙病病菌和溃疡病病菌的诱导表达情况。本研究同源克隆了不同柑橘品种中CitMYB20基因的开放阅读框序列,利用生物信息学方法预测其生物学功能并分析比较该基因在不同品种间的序列差异。在洋葱表皮细胞中瞬时表达观察CitMYB20的亚细胞定位。利用qRT-PCR技术分析黄龙病病菌胁迫和溃疡病病菌胁迫时CitMYB20的表达量变化。研究结果显示柑橘CitMYB20基因在晚锦橙、酸柚、纽荷尔脐橙和四季橘中的相似度达到99.01%,高度保守。晚锦橙中该基因含有3个外显子和2个内含子,其开放阅读框为804 bp,编码267个氨基酸残基。CitMYB20蛋白的N端高度保守,具有两个R结构域,属于典型的R2R3类型的MYB转录因子家族的成员。洋葱表皮细胞亚细胞定位分析结果表明该基因定位于细胞核中。CitMYB20基因受黄龙病病菌胁迫时,在黄龙病敏感品种晚锦橙和耐性品种酸柚中均显著上调表达,其中在耐病品种酸柚中上调表达24倍,在感病品种晚锦橙中上调表达34倍;而在溃疡病病菌胁迫时,CitMYB20基因仅在溃疡病抗性品种四季橘中显著差异表达,感病后上调表达3倍。推测该基因对黄龙病和溃疡病的应答差异可能是因为不同的调控机制造成的,构建CitMYB20基因过表达载体拟对不同病原的应答情况进行深入研究。     

橡胶草Tk-bZIP11转录因子基因的克隆及其表达模式分析

橡胶草(Taraxacum kok-saghyz)种植过程中经常受干旱等胁迫影响，提高品种的抗逆性具有重要意义。为了研究bZIP转录因子在橡胶草逆境响应中的功能，本研究从橡胶草中克隆了Tk-bZIP11基因，其ORF全长468 bp，编码156个氨基酸。蛋白结构分析结果表明，Tk-bZIP11蛋白具有bZIP转录因子特有的保守结构域，同时具有核定位信号。在进化关系上，Tk-bZIP11与莴苣(Lactuca sativa) Ls-bZIP11亲缘关系最近，并具有相同的保守基序。亚细胞定位结果表明，Tk-bZIP11定位在细胞核中。实时荧光定量PCR (RT-qPCR)分析结果表明，Tk-bZIP11在橡胶草的不同组织均有表达，其在叶片中表达量最高，是花梗中表达量的3.28倍。在经甘露醇诱导的渗透压胁迫下，Tk-bZIP11在处理后呈现显著下调表达。在NaCl和PEG-4000模拟的胁迫处理下，Tk-bZIP11在处理后12 h内均呈现上调表达，24 h后呈现下调的规律。在植物激素茉莉酸甲酯、乙烯利和脱落酸处理下，Tk-bZIP11表达量也是在处理的前12 h显著上调表达，之后下调表达。...     

水稻OsZ314基因克隆及转录激活验证

穗是水稻(Oryza sativa L.)重要的生殖器官,其生长发育直接影响水稻的产量和品质。前期研究中,我们对水稻生殖生长时期穗发育各阶段的转录组、蛋白组数据进行联合分析,筛选到一个MYB基因家族的转录因子OsZ314基因。生物学信息分析表明,该基因位于1号染色体上,拥有典型的R2R3-MYB型转录因子结构域,且在水稻幼穗时期表达量最高;亚细胞定位结果显示,OsZ314基因定位于细胞核中;转录激活试验表明,OsZ314基因具有转录激活功能。本研究为深入探索OsZ314基因在水稻穗发育时期的分子生物学功能奠定了良好的基础。     

萝卜开花基因RsFLC3的克隆与表达分析

植物开花春化途径中关键抑制因子FLC基因属于MADS-box基因家族,为探索萝卜开花抑制基因FLC3的功能,以抽薹开花差异较大的萝卜品种YZH(易抽薹)和XHT(耐抽薹)为研究材料,对萝卜开花基因进行生物信息学分析,克隆了萝卜RsFLC3基因,并进行亚细胞定位和两个萝卜品种不同时期的qRT-PCR分析。结果表明,共鉴定出萝卜开花相关基因638个,亚细胞定位显示该基因编码的蛋白定位于细胞核,RsFLC3基因在萝卜抽薹开花过程中表达量整体呈下降趋势,但不同品种间大部分时期的表达量差异较大。     

芒果赤霉素氧化酶基因GA3ox的克隆、表达及亚细胞定位分析

赤霉素3-氧化酶(gibberellin 3-oxidases, GA3ox)是赤霉素(gibberellic acid, GA)生物合成途径中的关键限速酶之一。芒果中GA3ox基因的功能及其表达模式未见报道。本研究利用RACE技术克隆了一个芒果GA3-氧化酶基因(GA3ox),该基因全长cDNA序列为1 680 bp,编码氨基酸381个,开放阅读框(open reading frame, ORF)为1 146 bp,蛋白分子量为42.6 kD,等电点为5.13,不含信号肽,不含跨膜结构域。系统发育树分析发现,该基因编码的蛋白主要与开心果亲缘关系较近,其次为克莱门柚、甜橙、麻疯树等植物。通过拟南芥原生质体亚细胞定位分析发现,该基因主要定位在细胞质中。通过对乔化、矮化芒果品种不同发育时期的叶片的实时荧光定量PCR分析发现,该基因主要在矮化品种中表达量较高,在乔化品种各个时期表达量较低,且差异不大。矮化品种中主要在开花期表达量最高,坐果期7～8周含量最低,但都高于乔化品种的任何取样时期。该基因的克隆和表达分析为下一步功能的研究及其在芒果株形调控分子机制提供理论依据。     

大豆14-3-3蛋白与转录因子蛋白GmMYB173的互作

14-3-3蛋白家族在真核生物中普遍存在,可与其他蛋白相互作用,调控多种生理生化过程。MYB基因家族作为植物中最大的一类转录因子,广泛参与了植物的生长发育和代谢调控。本研究通过分析1个从自贡冬豆中克隆的MYB转录因子GmMYB173的亚细胞定位情况,发现GmMYB173在细胞核中特异表达;序列分析发现GmMYB173与GmMYB176相似,具有1个14-3-3蛋白的潜在结合结构域,即pST结合结构域。通过重叠延伸PCR (SOE-PCR)删除了GmMYB173序列中pST结合结构域编码序列,发现GmMYB173细胞核表达特异性消失。酵母双杂交互作分析表明,大豆基因组中所有具有表达的16个14-3-3蛋白GmSGF14a~GmSGF14p均能与GmMYB173互作。β-半乳糖苷酶活性分析发现,与GmMYB173互作最强的是GmSGF14n,GmSGF14k、GmSGF14e和GmSGF14o其次。这些结果说明14-3-3蛋白不仅与GmMYB173互作,且可能调控其在细胞内的定位,有助于研究14-3-3蛋白与GmMYB173的互作关系及其在大豆生长发育中的作用。     

玉米ERD基因的表达模式及ZmERD6基因的抗旱性分析

为了进一步了解玉米ZmERD基因,基于旱胁迫转录组数据,筛选出5个ZmERD基因。将这些基因编码的蛋白质与拟南芥16个ERD蛋白进行进化分析发现,GRMZM2G181206和GRMZM2G128641基因编码的蛋白质分别与AT4G02900和AT1G32090基因编码的蛋白质同源性较高。时空表达分析发现,GRMZM2G109201、GRMZM2G181206和GRMZM2G12864基因属于组成型表达,GRMZM2G134192基因属于特异型表达,只在花药中高表达。属于ERD6亚家族的GRMZM2G109201基因在旱敏感型(B73)和抗旱型(郑58)自交系中均表达,且郑58中表达量显著高于B73;随着旱胁迫时间的延长,GRMZM2G109201基因在B73中表达量差异不显著,但在郑58中表达量升高幅度达到显著水平。亚细胞定位显示,GRMZM2G109201基因编码的ZmERD6蛋白定位于质膜。推测GRMZM2G109201基因参与旱胁迫,且被正向诱导。     

水稻WRKY转录因子OsWRKY76 RNA干扰载体的构建及表达分析

为研究水稻WRKY蛋白在应对各种生物以及非生物胁迫中发挥的作用,探明OsWRKY76是否参与调控水稻系统获得抗性,明确OsWRKY在植物抗病及耐逆反应过程中的作用机理,对OsWRKY76进行了氨基酸序列分析,发现OsWRKY76具有典型的WRKY结构域,属于WRKY-GCM1锌指WRKY超家族。克隆了OsWRKY76中300 bp的cDNA片段OsWRKY76-300,并扩增GUS基因中500 bp的片段作为连接物,通过片段末端人为增加的酶切位点将上述片段与Gateway系统的入门载体pENTR L16连接,形成中间由GUS 500连接、两端是OsWRKY76-300反向重复的发夹结构的载体,利用LR反应将dsWRKY76 pENTR L16中发夹结构的插入片段分别重组到诱导型双元载体GVG-TA7002和组成型双元载体Ubi-C1300中,获得RNA干扰载体。利用农杆菌介导的转化方法将诱导型双元表达载体转化水稻,获得7个转化株系。利用实时定量RT-qPCR检测转化株系中OsWRKY76的表达量,获得了2个沉默株系。     

水稻转录因子bHLH家族基因响应环境胁迫表达谱分析

植物转录因子在植物的生长发育及其对外界环境的反应中起着重要的作用。bHLH转录因子是植物转录因子最大的家族之一。本研究以水稻日本晴为材料,在苗期进行PEG模拟干旱胁迫和ABA（abscisicacid）处理,采用荧光定量PCR方法,比较分析干旱胁迫差异表达的22个候选bHLH家族基因在PEG和ABA处理下的不同时间梯度的表达谱。结果表明大部分候选基因的PEG胁迫表达谱与干旱胁迫表达谱一致,验证了芯片结果的可靠性;而在ABA处理下的大部分bHLH基因表现为抑制表达,部分基因的表达谱与干旱或PEG胁迫表达谱明显不同,推测这些bHLH基因参与PEG和ABA胁迫应答的具有相同或不同的分子路径或模式。研究结果对进一步克隆这些基因及分析其在植物生长发育过程中的分子调控模式打下了基础。     

野生二粒小麦YABBY转录因子家族的鉴定与表达分析

YABBY基因是植物所特有的一类转录因子家族,在植物器官形成、生长发育、信号转导以及胁迫响应等生物学过程发挥着重要调控作用。野生二粒小麦(Triticum dicoccoides)作为普通小麦的四倍体祖先种,一直是小麦遗传改良的重要种质和基因库,但目前有关野生二粒小麦的YABBY基因还未见报道。为了挖掘野生二粒小麦的YABBY基因,本研究利用生物信息学方法对野生二粒小麦YABBY转录因子家族进行了全基因组鉴定和分析,结果在野生二粒小麦基因组中共鉴定到了12个YABBY基因,归属于6个同源基因对且位于5个同源染色体组上。系统进化分析将它们分成YAB1/3、YAB5和CRC 3个亚家族,而且同一亚家族成员间具有相似的结构特征。基于RNA-seq数据的表达特性分析发现,YABBY在野生二粒小麦不同组织中具有特异性表达;同时,还鉴定发现了3个YAB5亚族成员在盐胁迫下发生了差异表达,进一步的qPCR分析验证了它们的表达特性,表明它们可能是盐胁迫响应相关的YABBY转录因子。