种子分泌物中酚酸对大豆疫霉菌生长发育及游动孢子趋化性的影响

为明确种子分泌物中酚酸是否影响大豆疫霉生长发育及侵染行为,文章采用高效液相色谱(HPLC)技术分析大豆疫霉抗病品种Williams82、感病品种Sloan及非寄主菜豆紫花油豆、玉米绥玉23种子分泌物中酚酸种类及含量,测定外源单一酚酸对大豆疫霉菌丝生长和游动孢子囊形成、游动孢子趋化性及成囊的影响.结果表明,不同作物和品种...     

大豆疫霉对根分泌物中异黄酮、氨基酸和糖的响应

用原位土培法种植大豆疫霉感病品种Sloan、抗病品种Williams82及非寄主菜豆一点红,收集3个品种根分泌物,分别测定根分泌物中异黄酮、氨基酸和可溶性糖种类及含量,从3个方面(游动孢子趋化性、孢子成囊率及孢囊萌发率首次测定单一组分和混合组分在相对原位浓度下对大豆疫霉游动孢子趋化作用。结果表明,寄主大豆与非寄主菜豆根分泌物中均含异黄酮daidzein和genistein,但含量未达到显著性差异。非寄主菜豆根分泌物中含全部供试18种氨基酸、Williams82仅含9种,Sloan为5种,共有氨基酸中,非寄主菜豆根分泌物中浓度均显著高于寄主,抗病品种略高于感病品种。测定6种可溶性糖中,非寄主菜豆根分泌物中含4种,Williams82含5种,Sloan含4种,其中半乳糖(Gal)仅在Williams82中存在,麦芽糖(Mal)在3个品种根分泌物中均不存在。所有单一组分对大豆疫霉游动孢子均具显著促进作用,除少数组分如脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)对孢囊萌发有抑制作用外,其他组分均显著趋化游动孢子成囊及孢囊萌发。异黄酮混合液、氨基酸混合液和可溶性糖混合液对游动孢子3个生理指标影响较各组分作用之和均显著减效,18种氨基酸混合液和6种可溶性糖混合液对大豆疫霉游动孢子萌发由促进作用转为抑制作用。将试验组分按其在3个品种根分泌物中相对原位浓度混合后,对游动孢子3个生理指标表现显著促进或抑制作用,且作用显著低于其SUM值,表明3类物质混合后减效作用显著,减效程度由强到弱依次为非寄主菜豆一点红、抗病品种Williams82和感病品种Sloan。     

大豆种子分泌物中蛋白质鉴定及其对大豆疫霉的趋化作用

研究以大豆抗、感品种接种大豆疫霉前后种子分泌物中蛋白质为研究对象,测定其对大豆疫霉游动孢子趋化性、成囊和萌发的影响,在此基础上采用LC/MS-MS鉴定蛋白质种类。体外活性试验表明,大豆抗病品种种子分泌物中总蛋白质排斥大豆疫霉游动孢子、抑制游动孢子成囊和萌发,且接种后抑制作用更强。大豆感病品种接种前种子分泌物中总蛋白质吸引大豆疫霉游动孢子,接种后转为排斥。大豆抗、感品种接种前种子分泌物中共鉴定得到多聚半乳糖醛酸酶抑制剂、类kiwellin蛋白、Bowman-Birk型蛋白酶抑制剂、类过氧化物酶等17种已报道具有植物防御活性差异蛋白,抗病品种防御蛋白种类多于感病品种;大豆抗病品种接种后诱导表达超氧化物歧化酶、PR-4、β-1, 3-葡聚糖内切酶等9种已报道与植物防御相关差异蛋白,大豆感病品种接种后诱导表达类PR-5、类α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂等8种具有防御活性差异蛋白。除已知具有防御活性的蛋白质外,其余诱导表达的差异蛋白也可能参与防御过程,在种子萌发过程中防御土壤中病原物包括大豆疫霉的侵染。     

大豆GmWRKY148的克隆与功能分析

【目的】WRKY转录因子与植物的生物和非生物胁迫应答密切相关。通过对大豆WRKY转录因子基因GmWRKY148的克隆及在大豆发状根中过表达后对疫霉根腐病抗性的分析,探究大豆与大豆疫霉菌互作的作用机理。【方法】以拟南芥的AtWRKY44序列为探针,利用同源克隆的方法在大豆Williams 82的根部组织中得到其同源基因Glyma.14G199800,命名为GmWRKY148。对GmWRKY148蛋白进行系统进化树分析;利用qRT-PCR方法分析该基因在大豆的根、茎、叶、子叶和接种大豆疫霉菌不同时间点的转录水平;利用双酶切的方法将GmWRKY148完整的CDS序列连接到植物过表达载体p Bin GFP2中,利用基因枪法将重组质粒转化到洋葱表皮细胞中,进行亚细胞定位分析。利用发根农杆菌K599介导的遗传转化体系,经过GFP荧光筛选和qRT-PCR检测,获得大豆过表达GmWRKY148的阳性发状根(OE-GmWRKY148)和转入p Bin GFP2空载体(EV)的阴性对照发状根。对过表达GmWRKY148发状根和阴性对照发状根接种大豆疫霉菌,统计病斑长度、疫霉积累量和卵孢子萌发情况。【结果】GmWRKY148的CDS序列全长为999 bp,编码332个氨基酸,等电点为7.61。系统进化分析发现,GmWRKY148与菜豆(Phaseolus vulgaris)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的WRKY转录因子亲缘关系十分相近,且与菜豆的亲缘关系最近。亚细胞定位结果显示,GmWRKY148定位在细胞核中。组织表达分析显示,GmWRKY148在根中的表达量最高,在茎和叶中次之,在子叶中最低。荧光定量PCR结果表明,接种大豆疫霉菌P6497后,在感病品种Williams和抗病品种Williams 82(含有Rps1k)中,GmWRKY148受诱导逐渐上调表达,在侵染24 h后表达水平均达到最高,但在Williams 82中的上调倍数更高。对过表达GmWRKY148和转空载体的大豆阳性发状根分别接种大豆疫霉菌P6497的菌丝块,比较接种24 h后的病斑长度和疫霉积累量,结果显示,与对照EV相比,过表达GmWRKY148大豆阳性发状根的病斑长度显著变短,疫霉积累量显著降低。对过表达GmWRKY148和EV的大豆阳性发状根分别接种疫霉菌P6497的游动孢子,并在接种后24、36和48 h用显微镜观察菌丝的侵染及卵孢子萌发数量,统计结果显示,过表达GmWRKY148的大豆阳性发状根与对照EV相比,菌丝的侵染率及卵孢子萌发率均显著降低。【结论】GmWRKY148参与调控大豆与大豆疫霉的互作,能够增强大豆对大豆疫霉菌的抗性。     

大豆疫霉菌对大豆幼苗致病性的遗传变异研究

【目的】研究黑龙江省大豆疫霉菌的致病性特性及其遗传变异特点,为进一步探讨大豆疫霉菌致病力的遗传变异机制奠定基础。【方法】用国际标准鉴别寄主和黑龙江省部分主栽大豆品种测定黑龙江省大豆疫霉菌株的致病性,以大豆疫霉野生型菌株的单游动孢子分离物为亲本,建立连续2代单游动孢子无性后代和1代单卵孢后代,测定大豆疫霉菌致病力的遗传变异特性。【结果】黑龙江省大豆疫霉菌株对黑龙江省大豆主栽品种表现出不同的致病性,但对国际标准鉴别寄主不致病。控制大豆疫霉菌致病力的某些致病基因在连续2代单游动孢子后代和1代单卵孢后代中发生变异,而其他致病基因遗传稳定。【结论】黑龙江省大豆疫霉菌株和大豆品种具有美国大豆疫霉菌株和大豆品种所不具有的更为复杂的遗传多样性,用国际标准鉴别寄主鉴别黑龙江省大豆疫霉菌株的致病性存在明显的局限性。控制大豆疫霉菌的致病基因分布在不同位点,有的遗传稳定,由纯合的核基因控制;有的遗传不稳定,由杂合核基因或细胞质基因控制,其有性和无性后代均发生变异。     

南美斑潜蝇对不同菜豆品种的偏好性与寄主化学物质含量的关系

 【目的】明确南美斑潜蝇对不同菜豆品种的偏好性及其与寄主植物化学成分的关系。【方法】采用非自由选择法测定南美斑潜蝇对不同菜豆品种的偏好性;采用丙酮法、蒽酮比色法、考马斯亮蓝法、磷钼酸－磷钨酸比色法及索氏回流法分别测定了叶片叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白、单宁酸及黄酮含量。【结果】南美斑潜蝇对不同菜豆品种的偏好性存在显著差异,聚类分析可以将其分为3类,最喜好的菜豆品种有双丰二号、富田一号架豆、精品架豆、紫花油豆、大诚地豆、日本无筋绿、双丰架豆、世纪豇豆、泰国架豆王、太空青眉、五常大油豆;其次为九寸莲、天马95-33、精选73-8、天马地豆、泰丰架豆王、富田二号架豆、满架莲、泰国架豆95-33、绿龙架豆、秋紫豆、青岛架豆;最次为骏马地豆、华豇八号、天马架龙王、诚牌精龙王、新选九粒白。化学成分分析表明, 不同菜豆品种间的叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白、单宁酸及黄酮含量存在显著差异。相关分析表明,南美斑潜蝇对不同菜豆品种的寄主偏好性与叶绿素、可溶性糖及可溶性蛋白含量无相关关系,而与叶片的单宁酸及黄酮含量呈显著负相关关系。【结论】单宁酸和黄酮对南美斑潜蝇的寄主偏好性具有重要影响,其含量越高越不利于南美斑潜蝇的取食或产卵。     

非洲菊根腐病品种抗病性鉴定及病原菌的致病性分化*

 用隐地疫霉（Phytophthora cryptogea）游动孢子浸根接种法对 13 个非洲菊主栽品种进行了品种抗病性鉴定。结果表明,玲珑表现为高抗品种,年华、金太阳、靓粉为抗病品种,红日、寒王为中抗品种,绿心粉为中感品种,大臣、爱神、红地毯、大雪桔、热带草原为感病品种,白马王子为高感品种;对分离自云南非洲菊主产区的 6 个隐地疫霉菌株进行了致病性分化测定。结果表明,6个隐地疫霉菌株存在着较明显的致病性分化,菌株的致病性强弱与分离的不同寄主品种关系较大,不同地理来源的菌株致病性强弱差异不明显。     

非洲菊根腐病品种抗病性鉴定及病原菌的致病性分化

用隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)游动孢子浸根接种法对13个非洲菊主栽品种进行了品种抗病性鉴定。结果表明,玲珑表现为高抗品种,年华、金太阳、靓粉为抗病品种,红日、寒王为中抗品种,绿心粉为中感品种,大臣、爱神、红地毯、大雪桔、热带草原为感病品种,白马王子为高感品种;对分离自云南非洲菊主产区的6个隐地疫霉菌株进行了致病性分化测定。结果表明,6个隐地疫霉菌株存在着较明显的致病性分化,菌株的致病性强弱与分离的不同寄主品种关系较大,不同地理来源的菌株致病性强弱差异不明显。     

果胶乙酰酯酶基因 AtPae7参与拟南芥对大豆疫霉菌的非寄主抗病性

利用反向遗传学方法,鉴定拟南芥(Arabidopsis thaliana)对大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)非寄主抗病性相关的基因。通过分子生物学和生物信息学方法,鉴定和分析T-DNA插入拟南芥突变体离体叶片对大豆疫霉菌的非寄主抗病性。结果表明:4个果胶乙酰酯酶基因AtPae7(pectin acetyl esterase 7)突变体株系中的3个对大豆疫霉菌的抗性减弱,表现为感病;qRT-PCR检测表明突变体中AtPae7的转录水平下降;生物信息学预测PAE7蛋白的N端有23个氨基酸信号肽序列,确定其为胞外分泌蛋白。说明果胶乙酰酯酶基因AtPae7参与拟南芥对大豆疫霉菌的非寄主抗病性。     

西瓜和水稻根系分泌物中糖和氨基酸对西瓜枯萎病病原菌生长的影响

以不同抗性西瓜品种以及化感水稻品种为试验对象,对其根系分泌物中可溶性糖和游离氨基酸的含量和组成进行分析,并研究了氨基酸对西瓜专化型尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)生长的影响。结果表明:西瓜根系分泌物中的可溶性糖含量及游离氨基酸的含量和种类显著多于水稻根系分泌物中的,而感病西瓜品种根系分泌物中的又显著多于抗病品种根系分泌物中的。与感病西瓜品种相比,抗病西瓜品种根系分泌物中不含酪氨酸,水稻根系分泌物中不含天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和精氨酸这9种氨基酸。综合西瓜专化型尖孢镰刀菌孢子萌发和产孢能力两项测定结果,供试的8种外源氨基酸中丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸为主要促菌氨基酸;甲硫氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸均促进西瓜专化型尖孢镰刀菌孢子萌发却抑制其孢子产生,而丝氨酸为抑菌氨基酸。因此,水稻、西瓜根系分泌物在糖和氨基酸含量及组成方面存在的显著差异,可以使连作条件下西瓜单作和西瓜/旱作水稻间作对根际微生物的养分供应不同,对其生长的影响也随之改变,这为阐释连作条件下西瓜单作发病严重而间作发病减轻的机制提供了科学依据。     

影响大豆疫霉根腐病菌卵孢子生活力的因素

在某些大豆生产区,由大豆疫霉(Phytophthorasojae)引起的大豆根茎腐烂病是一种普遍流行的、极具破坏性的病害,病原真菌以卵孢子在土壤中越冬,在条件适宜时导致下一年大豆发生根茎腐烂。病原菌卵孢子也可以存在于患病种皮内,但其在病害循环中的作用还不清楚。卵孢子通常休眠一段时间后才萌发,这阻碍了大豆疫霉有性生殖后代毒性的遗传和变异研究。而研究的目的是寻找一种能够促进卵孢子在短时间内大量萌发的方法。在研究过程中采用MTT染色法检测处理后的卵孢子的生活力。结果表明,卵孢子龄期、预处理温度、化学物质在某种程度上均影响大豆疫霉卵孢子的生活力。用0.4%的KMnO4处理45d龄期的卵孢子,或35℃下处理5d有利于卵孢子的萌动,H2O2、大豆根汁液和大豆根际土壤浸出液对卵孢子生活力没有影响。     

精甲霜灵对大豆根腐病菌的毒力研究

利用35%精甲霜灵种子处理乳剂对大豆根腐病菌进行室内菌丝生长抑制、卵孢子形成的影响和苗期盆栽防治试验.结果表明,35%精甲霜灵种子处理乳剂对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、瓜果腐霉菌(Pythium aphani dermatum)和大豆疫霉根腐病菌(Phytophthora sojae)菌丝生长抑制率均较高,分别为100%、100%和84.82%.35%精甲霜灵种子处理乳剂对瓜果腐霉菌卵孢子的形成有抑制作用,对大豆疫霉根腐病卵孢子的形成有促进作用.苗期盆栽防治试验中,35%精甲霜灵种子处理乳剂对尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、立枯丝核菌、瓜果腐霉菌和大豆疫霉根腐病防效均高于对照药剂,分别达到70.93%、65.63%、63.71%和76.54%     

大豆疫霉在江苏省适生性的初步研究

通过对苗期大豆下胚轴创伤接种，测定了大豆疫霉菌株S317（分离自中国东北）和Pmg-1,Pmg-2,Pmg-3（分离自进口美国2号大豆携带的土壤）对江苏省30个大豆品种的致病性。结果显示：30个大豆品种对菌株S317高度感病；27个大豆品种对菌株Pmg-1,Pmg-2，Pmg-3高度感病，另有3个品种表现为抗病。同时，测定了供试菌株的卵孢子在南京土壤中的存活能力。结果供试菌株的卵孢子在土壤中埋存9个月，仍有6．6％－13．3％具有萌发能力。上述结果表明，大豆疫霉在江苏省具有较强的适生性，一旦传入可能对江苏大豆生产构成威胁。     

Identification, Genetic Analysis and Mapping of Resistance to Phytophthora sojae of Pm28 in Soybean

Phytophthora sojae Kanfman and Gerdemann (P.sojae) is one of the most prevalent pathogens and causes Phytophthora root rot,which limits soybean production worldwide.Development of resistant cultivars is a cost-effective approach to controlling this disease.In this study,127 soybean germplasm were evaluated for their responses to Phytophthora sojae strain Pm28 using the hypocotyl inoculation technique,and 49 were found resistant to the strain.The hypocotyl of P1,P2,F1,and F2:3 of two crosses of Ludou 4 (resistant)×Youchu 4 (susceptible) and Cangdou 5 (resistant)×Williams (susceptible) were inoculated with Pm28,and were used to analyze the inheritance of resistance.The population derived from the cross of Ludou 4×Youchu 4 was used to map the resistance gene (designated as Rps9) to a linkage group.932 pairs of SSR primers were used to detect polymorphism,and seven SSR markers were mapped near the resistance gene.The results showed that the resistance to Pm28 in Ludou 4 and Cangdou 5 was controlled by a single dominant gene Rps9,which was located on the molecular linkage group N between the SSR markers Satt631 (7.5 cM) and Sat_186 (4.3 cM).     

新疆大豆疫霉生物学特性及生理小种鉴定

从石河子、阿勒泰和伊犁大豆种植区采集大豆根腐病病样进行分离,共分离到5个疫霉菌株,经生物学特性测定,供试的新疆大豆疫霉各菌株在10～35℃均可生长,最适生长温度25℃左右;最适于菌丝生长的pH值为7左右;其菌丝在胡萝卜、V8汁培养基上生长较快,在V8汁、CA和大豆汁培养基上都能产生大量的卵孢子.生理小种鉴定表明,供试的大豆疫霉菌株分属4个不同的毒力公式,它们与当前国内外所报道的53个生理小种的毒力公式均有较明显差别,可能属于新的生理小种.     

用SSR标记和巢式PCR快速检测大豆疫霉菌

 【目的】建立快速、准确的大豆疫霉菌检测和病害早期诊断分子技术。【方法】基于大豆疫霉菌SSR标记Psc239设计两对引物Psc239EF/Psc239ER和Psc239F/Psc239R,建立特异性检测大豆疫霉菌的巢式PCR方法。【结果】用36个大豆疫霉菌分离物和25个其他卵菌和真菌分离物基因组DNA评价引物及巢式PCR的专化性,引物对Psc239EF/Psc239ER、Psc239F/Psc239R和巢式PCR反应只在大豆疫霉菌中分别扩增出519、242和242 bp的特异片段,在其它卵菌和病原真菌中不扩增片段;用两对引物进行常规PCR扩增,检测大豆疫霉菌DNA的灵敏度均为50 pg?μl-1,而巢式PCR的灵敏度为50 fg?μl-1;巢式PCR检测土壤中卵孢子的灵敏度为每克土壤0.4个卵孢子;巢式PCR能够特异地从大豆病株和土壤中检测到大豆疫霉菌。【结论】基于SSR标记建立的巢式PCR方法能够用于大豆疫霉菌的快速检测和病害诊断。     

大豆组成型三重反应基因GmCTR1的克隆与功能分析

【目的】植物激素乙烯参与植物的生长发育以及生物与非生物胁迫过程。组成型三重反应基因CTR1作为乙烯受体下游一个负调控因子,结合乙烯受体共同参与乙烯的信号转导途径。本研究通过对大豆(Glycine max)的组成型三重反应基因CTR1进行克隆和诱导表达分析,以及在大豆发状根中过表达该基因后进行疫霉根腐病的抗性分析,探究CTR1在大豆与疫霉菌互作过程中的功能。【方法】利用同源克隆的方法,以拟南芥的AtCTR1序列为探针,在大豆基因组数据库中搜索同源性最高的基因即为大豆的GmCTR1(Glyma.13G151100),并从Williams82中将GmCTR1克隆出来。对GmCTR1进行多重序列比对、系统进化分析和疫霉菌的诱导表达分析。构建植物过表达载体p Bin GFP2:GmCTR1。应用发根农杆菌介导的遗传转化方法获得大豆发状根,经GFP荧光筛选得到大豆过表达GmCTR1的阳性发状根和转入空质粒的阴性对照发状根。对过表达GmCTR1发状根和阴性对照发状根侵染疫霉菌后,检测病斑长度、疫霉生物量和抗性相关基因的表达。【结果】根据同源序列比对结果,将与拟南芥At CTR1(AT5G03730)同源性最高(75.3%)的大豆基因Glyma.13G151100命名为GmCTR1,从Williams82中克隆得到GmCTR1的CDS序列。该基因的CDS序列全长2 511 bp,编码836个氨基酸的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,蛋白质量为92.35 k D,等电点为6.51。多重序列比对结果显示,GmCTR1氨基酸具有CTR1同源蛋白的典型结构域和关键特征。构建系统发育树进行进化分析发现,GmCTR1与菜豆(Phaseolus vulgaris)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的CTR1亲缘关系十分相近,在同一个分支上,且与菜豆的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果表明,在大豆疫霉菌P6497侵染后,GmCTR1受诱导逐渐上调表达,在侵染48 h后表达水平达到最高,随后表达量降低。利用酶切连接方法将GmCTR1的CDS序列构建到植物过表达载体p Bin GFP2中,PCR和酶切验证获得了重组质粒p Bin GFP2:GmCTR1。对发状根接种疫霉菌后发现,过表达GmCTR1减弱了对疫霉根腐病的抗性,疫霉菌侵染36 h后过表达发状根与对照相比病斑长度显著增长。过表达GmCTR1发状根中疫霉菌的生物量与对照相比增加,与大豆抗病反应相关基因的表达水平显著降低。【结论】GmCTR1在大豆与疫霉菌的互作过程中发挥一定的负调控作用。     

Resistance Evaluation of Soybean Germplasm from Huanghuai Region to Phytophthora Root Rot

The aim of the study was to establish a set of differential strains and to identify soybean resistant genes to Phytophthora root rot and then to apply those strains for analysis of the resistant genes Rps1a, Rps1c, and Rps1k that soybean cultivars or lines may carry. Virulence formula of 125 Phytophthora sojae isolates were determined using the hypocotyls inoculation technique, the strains, which includ 6 isolates with different virulence formulas, were applied to identify the resistance of 55 soybean cultivars or lines and resistant genes were analyzed using the gene postulating procedure. Eighteen reaction types occurred in 55 cultivars or lines and results of gene postulation indicated that 2 cultivars or lines probably carried gene Rpslc and no cultivar may carry genes Rpsla or Rpslk. A few of soybean cultivars or lines from Huanghuai Region carry Rps genes Rpsla, Rpslc and Rpslk and tend to infect by P. sojae, so resistant cultivars or lines need to be bred and popularized actively.