携带CD自杀基因NDV重组病毒对小鼠肝癌细胞转移模型的治疗效果

采用反向遗传操作技术构建新城疫病毒基因组NP/P位点表达胞嘧啶脱氨酶(Cytosine deaminase,CD)基因弱毒力重组新城疫病毒rClone30-CD和中毒力重组新城疫病毒rAnhinga-CD。MTT检测结果表明,在协同5-氟胞嘧啶(5-Fluorocytosine,5-FC)条件下,两株重组新城疫病毒可在体外有效杀伤人肝癌细胞HepG2。通过Balb/c鼠尾静脉注射小鼠肝癌细胞H22构建小鼠肝癌细胞转移模型,经重组病毒协同5-FC联合治疗,荷瘤小鼠转移肿瘤体积显著缩小、肿瘤组织出现明显凋亡与坏死。体内试验结果表明,中毒力重组新城疫病毒rAnhinga-CD抑瘤效果优于弱毒力重组新城疫病毒r Clone30-CD。     

表达PCV2 Cap蛋白重组杆状病毒对小鼠的保护力试验

PCR扩增猪圆环病毒2型(PCV2)的衣壳蛋白(Capsid)基因,鉴定后克隆到杆状病毒转移载体pFastBacTM1中,获得重组转移载体pFastBac-Cap,转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,经转座作用,蓝白菌落筛选得到含cap基因的重组穿梭载体Bacmid-Cap,以脂质体介导的方法将重组穿梭载体转染Sf9昆虫细胞,获得重组病毒reBacCap,PCR能够扩增出相应大小的片段,间接免疫荧光分析表明,PCV2阳性血清能使reBac-Cap感染的Sf9昆虫细胞出现特异性绿色荧光,表明reBac-Cap在Sf9细胞中成功表达PCV2-Cap蛋白.动物试验表明该重组病毒对小鼠有一定的保护力.     

猪IL-15与PRRS病毒GP5基因核酸疫苗免疫效力

通过分子克隆技术构建了表达猪白细胞介素(IL)-15及猪繁殖呼吸综合症(PRRSV)病毒GP5基因重组核酸疫苗。以小鼠为试验模型,利用猪IL-15作为分子佐剂并检测其对表达PRRS病毒GP5基因核酸疫苗的免疫增强作用。结果表明,猪IL-15与GP5试验组小鼠抗体水平和T淋巴细胞亚群数量均高于PBS对照组及GP5基因单独免疫组,表明猪IL-15对核酸疫苗可有效增强PRRS病毒GP5基因的免疫效果,证实了其佐剂效应。     

沉默Prx Ⅱ基因促进5-FU诱导HepG2细胞凋亡研究

旨在探究PrxⅡ对5-FU诱导HepG2(人肝癌细胞系)细胞凋亡的影响,阐明沉默PrxⅡ基因提高5-FU促进HepG2发生细胞凋亡的作用。利用慢病毒介导的shRNA干扰技术建立PrxⅡ基因沉默的HepG2细胞系、MTT法检测细胞存活率、荧光显微照相测定凋亡情况、蛋白质免疫印迹检测凋亡相关蛋白表达水平。结果表明PrxⅡ基因沉默的HepG2细胞系构建成功;MTT检测发现在1mmol·L-15-FU处理下,shPrxⅡ组细胞存活率明显低于Scramble组;荧光显微照相结果表明shPrxⅡ组细胞凋亡率明显高Scramble组;蛋白质免疫印迹结果表明PrxⅡ基因沉默的HepG2细胞中凋亡标志物PARP、促凋亡蛋白Bad的表达水平明显升高,抗凋亡蛋白Bcl-xL表达水平明显下降。研究表明,沉默PrxⅡ基因能提高HepG2对5-FU促凋亡作用的敏感性,导致HepG2细胞凋亡水平上升,研究结果可为提高肝癌细胞对于5-FU的敏感性提供新的潜在靶目标。     

表达猪2型圆环病毒ORF2基因的重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定

【目的】以伪狂犬病病毒为载体，构建表达猪2型圆环病毒ORF2基因的重组病毒，并研究其生物学特性。【方法】将猪2型圆环病毒ORF2基因插入到伪狂犬病病毒gG缺失通用转移载体中，构建猪2型圆环病毒-伪狂犬病病毒重组中间转移质粒，然后将该质粒与伪狂犬病病毒TK-/gG-/LacZ+基因组共转染IBRS-2细胞，待发生细胞病变后收集病毒液进行重组病毒的筛选及生物学特性测定。【结果】利用检测PCV2 ORF2基因和LacZ基因的PCR方法筛选到重组病毒TK-/gG-/ORF2+，同时用Southern blotting证实外源基因PCV2 ORF2已成功插入到TK-/gG-/LacZ+亲本株的基因组中。间接免疫荧光试验（IFA）和Western blotting结果显示重组病毒中PCV2 ORF2基因获得了成功表达。对重组病毒的生物学特性研究表明，重组病毒与其亲本株在不同细胞上的增殖滴度相当，且重组病毒对小鼠无致病性，免疫小鼠后可诱导机体产生抗ORF2蛋白的特异性抗体。【结论】重组伪狂犬病毒构建成功，且表达的ORF2蛋白具有免疫原性。     

茶氨酸溴香酰胺对人肝癌细胞体内外生长的抑制作用

以L-茶氨酸作对照,评估本实验室合成的新颖的茶氨酸衍生物-茶氨酸溴香酰胺（TBrC）对人肝癌HepG2细胞系体内外生长的抑制作用,并初步探究其作用的分子机制。采用MTT法检测不同浓度的TBrC对HepG2细胞体外生长的影响,应用蛋白质印迹法检测解析HepG2细胞中与癌细胞凋亡和生长密切相关蛋白的表达和药物可能作用的分子靶点。此外,建立动物肿瘤模型,与对照组茶氨酸和临床常用抗癌药物五氟尿嘧啶组相比较,评价TBrC对荷瘤裸鼠人肝癌HepG2肿瘤生长的抑制效果。实验结果显示,TBrC抑制人肝癌细胞体内外生长的活性超过其母体化合物茶氨酸分别为3倍和4倍以上,对小鼠生长无明显毒性。TBrC比茶氨酸更显著地抑制肝癌细胞生长因子受体c-Met和抗凋亡的Bcl-2等蛋白的表达;此外,TBrC大大上调促进凋亡的Bax蛋白的表达。TBrC抑制c-Met信号传导通路,下调Bcl-2/Bax蛋白比率可能是其作用的分子机制之一。这些结果提示,TBrC具有广泛应用于临床治疗和（或）辅助治疗人肝癌和其他癌症的潜力。     

低氘水对肝癌HepG2细胞增殖和侵袭能力的抑制作用

目的探讨低氘水(deuterium-depleted water,DDW)对肝癌HepG2细胞增殖、侵袭能力的抑制作用。方法 HepG2细胞及正常肝细胞LO2用50、75、100、150ppm DDW(纯净水对照组)处理,用MTT法、平皿克隆实验检测细胞增殖、侵袭转移能力,Western blot检测增殖细胞核抗原(PCNA)表达。结果 100ppm DDW处理24h对LO2细胞、72h对HepG2增殖抑制无影响(P>0.05)。HepG2在50、75ppm DDW中细胞克隆数均低于对照组,而LO2细胞克隆数高于对照组(P<0.01)。50、75、100ppm DDW处理后HepG2细胞PCNA表达明显低于对照组(P<0.01)。结论 DDW可抑制HepG2细胞增殖和侵袭能力,但促进正常细胞LO2生长,这可能与PCNA表达下调有关。     

新城疫病毒F和HN核心片段在杆状病毒中的表达

为研制抗新城疫病毒的基因工程疫苗,将新城疫病毒F48E8株F和HN基因的核心片段克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb中,然后转化到DH10Bac感受态细胞中与Bacmid杆状病毒穿梭载体进行转座重组,最后将重组子转染TN5细胞,得到含F片段和含F HN片段的重组杆状病毒rBac F和rBac F HN。PCR扩增结果证实F和F HN基因片段重组到杆状病毒基因组中;SDS-PAGE和Western blot检验结果表明F和F HN基因片段在重组病毒中得到了表达。     

重组禽腺联病毒传递的miRNAs对鸡传染性法氏囊病毒复制的抑制

为了研究重组禽腺联病毒介导的基因特异miRNAs对传染性法氏囊病毒(IBDV)复制的抑制作用。在前期研究基础上,利用重组DNA技术构建表达vp2与vp1基因特异miRNAs的重组禽腺联病毒转移载体,磷酸钙法制备重组禽腺联病毒;纯化后的病毒经过电镜观察、病毒感染性试验确定其存在与感染滴度,提取转导重组病毒后的细胞总RNA,RT-PCR法检测miRNAs表达情况,在重组病毒转导的细胞中感染不同源的IBDV,在感染后不同时间测定病毒TCID50及vp2基因表达水平。结果显示,成功制备了重组禽腺联病毒,病毒感染性滴度可达5×108TU/ml,与阴性对照相比,成功表达的miRNA能在细胞上抑制病毒基因的扩增,大幅度降低同源或异源病毒的滴度。表明重组禽腺联病毒可以作为有效传送和稳定表达miRNA的载体,有望开发预防鸡传染性法氏囊病(IBD)的新方法。     

5-Aza-CdR激活肝癌细胞Runx3基因表达及其临床意义

目的:通过检测肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞中Runx3基因启动子区域甲基化状态,探讨肝癌细胞系经药物5-Aza-CdR处理后Runx3基因重新表达的可能性及对细胞生长的影响,寻找抗癌治疗的药物新靶点。方法:采用DNA甲基化特异性PCR(MSP)技术分别对5种肝细胞癌细胞系Runx3基因启动子区域甲基化状态进行检测,用药物5-Aza-CdR2μmol/L处理肝癌细胞HepG23d,继续常规培养5d后,RT-PCR检测Runx3 mRNA表达情况,利用集落形成实验观察细胞的生长活性,应用显微镜观察细胞形态及凋亡变化。结果:在5种肝癌细胞系中,有3种细胞Runx3基因启动子区域存在甲基化异常;肝癌细胞HepG2经5-Aza-CdR处理后,HepG2细胞检测出Runx3基因重新表达,细胞克隆形成率显著降低,显微镜观察显示部分细胞体积缩小、形态趋于规则及凋亡细胞明显增多。结论:Runx3基因启动子区域甲基化可能是导致Runx3基因失活的主要原因之一,去甲基化制剂5-Aza-CdR能有效激活Runx3基因重新表达,抑制肝癌细胞生长,诱导部分肿瘤细胞凋亡。     

柴胡皂甙-d对人肝癌HepG2细胞增殖及细胞周期的影响

目的 探讨柴胡皂甙-d(SSd)对人肝癌HepG2细胞增殖和细胞周期的影响.方法 (1)常规培养人肝癌HepG2细胞;(2)噻唑蓝(MTT)实验观察不同质量浓度SSd处理HepG2细胞72 h后以及10mg/L的SSd作用HepG2细胞不同时间对HepG2细胞生长指数的影响;(3)流式细胞术(FCM)检测SSd处理HepG2细胞48h后细胞周期的分布.结果 SSd能明显抑制HepG2细胞的增殖,以10mg/L的SSd作用48h的抑制作用最明显.FCM检测显示SSd作用48h后实验组处于S期的细胞数较对照组明显减少(P<0.01).结论 SSd对人肝癌HepG2细胞的体外增殖具有抑制作用,并能使细胞周期中处于S期的细胞数减少.     

蛹虫草多糖抗乳腺癌转移作用及机制研究

目的 研究蛹虫草多糖抗乳腺癌转移的作用及机制。方法 30只小鼠随机分为3组,分别为模型组、蛹虫草多糖低剂量组（20 mg/kg）和蛹虫草多糖高剂量组（80 mg/kg）,所有动物采用尾静脉接种4T1乳腺癌细胞建立乳腺癌肺转移模型,后2组接种后连续腹腔注射给予蛹虫草多糖15 d。以肺组织表面的肿瘤结节数、血清MMP-2和MMP-9含量、肺组织病理为检测指标;采用CCK8法检测蛹虫草多糖对4T1细胞增殖的影响;采用Caspase-3/7检测试剂盒测定细胞凋亡情况。结果 与模型组比较,蛹虫草多糖高剂量组能够明显降低小鼠肺部的肿瘤结节数（P<0.01）;与模型组比较,蛹虫草多糖高剂量组能够显著降低血清MMP-2和MMP-9的含量（P<0.01）;显微镜下发现,蛹虫草多糖高剂量组的肺组织肿瘤转移灶体积和数量均少于模型组。蛹虫草多糖对乳腺癌4T1细胞增殖具有浓度依赖性趋势的抑制作用,半数抑制浓度（IC₅₀）为0.092 mg/mL;与溶媒组比较,0.10 mg/mL和0.20 mg/mL的蛹虫草多糖可以显著增加Caspase-3/7的表达（P<0.01）。结论 蛹虫草多糖可抑制乳腺癌肺转移,其作用机制可能与抑制MMP-2和MMP-9的表达和直接的抗肿瘤作用有关。     

2-辛亚砜-5,8-二甲氧基-1,4萘醌通过ROS/Akt通路诱导HepG2细胞凋亡

为研究修饰后的萘醌类衍生物对人肝癌细胞株HepG2诱导细胞凋亡作用及其机制。采用MTT、流式和Western blot方法观察2-辛亚砜-5,8-二甲氧基-1,4萘醌对人肝癌细胞的生长作用。结果表明:2-辛亚砜-5,8-二甲氧基-1,4萘醌可通过促进早期ROS水平升高,抑制Akt的磷酸化水平,并选择性地激活p38,ERK信号通路,从而抑制肝癌细胞株HepG2细胞的增殖并诱导其发生凋亡。     

某豆科植物粗提物(JA1)对人肝癌细胞株端粒酶活性的抑制和细胞周期的改变

采用单管法一步完成端粒重复序列扩增法检测人肝癌细胞株,经不同浓度JA1及不同时间的作用前后端粒酶活性的变化,并采用流式细胞仪分析细胞周期的变化。结果显示,JA1可显著抑制人肝癌细胞端粒酶活性,而且这种抑制效果有剂量依赖性和时间依赖性。流式细胞仪分析细胞周期的变化表明,端粒酶活性被抑制后,肝癌细胞被阻滞在G2/M。同时,在检测标本中显示有明显的DNA低含量颗粒(“亚G1期”峰),表明肝癌细胞凋亡的存在。     

漆树黄酮对HepG2细胞端粒酶活性及NF-κB p65表达的影响

目的观察漆树黄酮对人肝癌细胞系HepG2端粒酶活性及NF-κBp65表达的影响。方法端粒酶重复序列扩增-酶联免疫吸附法（TRAP-ELISA）检测不同浓度漆树黄酮对HepG2细胞端粒酶活性的影响,RT-PCR法检测端粒酶逆转录酶（hTERT）mRNA表达,Western blot检测NF-κBp65蛋白表达。结果漆树黄酮对端粒酶活性具有抑制作用。漆树黄酮组hTERT mRNA和NF-κBp65蛋白表达降低,并且与端粒酶活性下调存在相关性。结论漆树黄酮可能通过下调NF-κBp65蛋白表达而抑制HepG2细胞hTERTmRNA转录,导致端粒酶活性降低。     

裸小鼠人结肠癌术后转移模型的建立

将人结肠腺癌细胞株HCT-116接种于裸小鼠右侧背部近腋部皮下,得到皮下移植瘤,肿瘤在体内适应后用28只裸小鼠采用组织块法建立皮下移植瘤模型。4周后随机挑选15只裸小鼠作为实验组切除肿瘤组织,建立裸小鼠人结肠癌术后转移模型,其余13只裸小鼠作为对照组,观察动物生存情况及肿瘤远处转移情况。对照组裸小鼠9周时出现恶病质,解剖检查肺转移率为23%(3/13);实验组裸小鼠术部无肿瘤复发,17周后肺转移率达到100%(15/15),淋巴结转移率100%(15/15),脾脏转移率33.3%(5/15)。本模型模拟了临床肿瘤根除术后发生远处转移的过程,可为研究结肠癌转移机制和术后抗转移治疗提供理想的动物模型。     

柠檬精油的抗菌活性研究

[目的]研究柠檬精油的抗菌活性。[方法]将柠檬精油作为抑菌活性物质制作成固体栓剂,以穿刺肺叶注射菌液的方法建立小白鼠肺炎模型,利用柠檬精油固体栓剂自然挥发的特性对肺炎小白鼠进行治疗,同时设立空白对照与保护伞阳性对照,观察各组小鼠存活及死亡情况,重复3次。[结果]柠檬精油实验组、保护伞阳性对照组、空白对照组小白鼠平均存活率分别为62.5%、75%、13.3%。[结论]柠檬精油对小白鼠肺炎具有恢复治疗作用。     

西兰苔叶黄酮体外抗癌活性的研究

[目的]探讨西兰苔叶黄酮粗提物（EOF）的抗癌机制。[方法]通过四甲基偶氮唑盐（MTT）试验检测EOF对细胞生长的抑制率,并用流式细胞仪采用Annexi-V/PI双染法进行细胞凋亡检测,以探讨西兰苔叶EOF对癌细胞增殖的抑制作用及其诱导的癌细胞凋亡机制。[结果]西兰苔叶EOF对SW480、HepG2、Hela和A549这4种细胞的生长均表现出抑制作用,抑制率随药物浓度的增加而增大,呈明显的量效关系,其50%抑制浓度（IC50）值分别为88.14、99.65、104.43、79.77μg/ml,对SW480细胞的作用最为明显。通过Annexi-V/PI双染法流式细胞仪测得其浓度为30、60、80、120、160μg/ml时,诱导的SW480细胞的早期凋亡率分别为12.74%、16.41%、19.61%、28.28%和50.66%。[结论]西兰苔叶EOF是通过抑制增殖和诱导细胞凋亡来发挥对肿瘤的治疗作用的。