芸薹属物种(B.napus,B.rapa,B.oleracea)CAMTA4基因家族的鉴定与进化分析

钙调蛋白在植物的生理代谢中起着重要作用,而钙调蛋白的转录翻译过程需要CAMTA的参与。为研究芸薹属植物中CAMTA4位点的分子进化,本研究利用生物信息学的方法,分析了甘蓝型油菜、白菜和甘蓝的CAMTA4家族核苷酸序列的基本特征和基因结构、蛋白序列的基本特征和功能域,以及它们的系统发生关系。结果显示,这3个物种的CAMTA4都具有CAMTA保守的结构域,且它们的进化符合禹氏三角理论和三倍化学说。本研究明确了甘蓝型油菜、白菜和甘蓝CAMTA4位点的进化历程,并且为研究芸薹属植物CAMTA的功能提供了生物信息学参考。     

芸薹属物种(B.napus,B.rapa,B.oleracea,B.juncea,B.nigra)MYB28家族的分子进化

芸薹属物种(甘蓝型油菜,白菜,甘蓝,芥菜型油菜和黑芥)是重要的经济作物,它们均含有硫代葡萄糖苷(简称硫苷),硫苷的合成受MYB转录因子的调控,其中MYB28能够调控甲硫氨酸合成脂肪族硫苷。目前,普遍认为芸薹属物种在进化过程中发生了全基因组三倍化,并且用禹氏三角表示来表示它们间的亲缘关系。本研究利用生物信息学方法,鉴定了5个芸薹属物种MYB28,分析了芸薹属MYB28的基本特征、同源性和系统发生关系,探讨了芸薹属物种MYB28家族的分子进化。结果显示,芸薹属MYB28在不同物种间的同源性存在高于种内同源性的现象,芸薹属MYB28位点的进化符合禹氏三角理论,但不完全符合三倍化学说。     

Bna-novel-miR311-HSC70-1模块调控甘蓝型油菜响应热胁迫的机制

HSP70(heat shock protein 70)参与植物热胁迫应答,增强植物耐热性,但目前油菜中尚无miRNA调控HSP70基因的报道。本研究novel-miR311是利用高通量技术在甘蓝型油菜茎尖中筛选出的新miRNA。novel-miR311存在于油菜而不存在于拟南芥中, 5'-RACE技术证实其2个靶基因属热应激同源蛋白基因HSC70-1 (HSP70家族),在甘蓝型油菜体内被剪切。构建novel-miR311超表达载体,转化拟南芥和甘蓝型油菜,其转基因阳性苗中HSC70-1基因表达量显著下降。高温胁迫试验表明,拟南芥和甘蓝型油菜热胁迫后,其阳性苗的生长势和存活率显著低于其对应的对照。qPCR结果显示,油菜中HSC70-1基因表达量热胁迫后较热胁迫前上升。上述结果表明,油菜novel-miR311介导HSC70-1基因的剪切降低了拟南芥和甘蓝型油菜耐热性。     

芸薹属VFB4基因家族的生物信息学分析

为了探究芸薹属甘蓝型油菜(B. napus)、白菜(B. rapa)、甘蓝(B. oleracea) 3个物种的进化关系,本研究利用生物信息分析学的方法,测定芸薹属VFB4基因成员的氨基酸序列,染色体定位和二级结构。利用VFB4基因在染色体上的位置,绘制出染色体定位图和3个物种的进化系统发育树,并对3个物种的亲缘关系进行讨论。结果显示,芸薹属VFB4基因编码的氨基酸数在524~534之间,均为亲水蛋白,亚细胞定位均在细胞核中。VFB4基因不含内含子,GC含量很高,但是在染色体上分布不均匀。系统进化发育树分析得出,芸薹属物种间的同源性非常的高,种内的同源性不是很高。通过对基因的对比分析发现,芸薹属VFB4位点符合禹氏三角理论,但是不完全符合芸薹属三倍体进化学说。本研究结果可为进一步研究芸薹属基因进化提供科学依据。     

芸薹属物种(B.napus,B.rapa,B.oleracea)TCP基因家族全基因组鉴定和分析

TCP蛋白是植物特有的一类转录因子,广泛参与植物叶发育、花对称性、侧枝发育等过程,具有重要的调控作用。为了揭示芸薹属TCP基因家族的功能和进化关系,本研究利用生物信息学方法对白菜、甘蓝和甘蓝型油菜的TCP转录因子家族成员、基因分类、基因结构、系统进化关系和结构域序列保守性进行分析。研究表明,白菜和甘蓝的TCP基因成员各有37条、甘蓝型油菜TCP基因成员有78条,且全部为亲水蛋白,大部分的TCP基因结构简单,不含内含子;序列分析表明,这些TCP基因均具有高度保守的TCP结构域;根据结构域差异和系统发育分析的结果,将白菜、甘蓝、甘蓝型油菜TCP基因分为两类:ClassⅠ和ClassⅡ,ClassⅡ可继续分为CIN和CYC/TB1两个小组;聚类分析发现,芸薹属中白菜、甘蓝、甘蓝型油菜TCP基因与拟南芥垂直同源的At TCP11、At TCP16、At TCP23的TCP基因缺失,可能与芸薹属发生三倍化事件或驯化过程中的人工选择有关。以上研究将为揭示芸薹属TCP基因的功能提供重要的理论基础。     

芸薹属CesA基因家族在AC基因组中的进化及其多态性分析

植物细胞壁在保持细胞完整和维持功能等方面发挥了极其重要的作用,纤维素合成酶(CesA)基因家族编码了参与细胞壁多糖生物合成的许多酶。为了系统地了解CesA基因家族在芸薹属AC基因组的基本情况及CesA多态性与抗菌核病之间的关系,本研究利用拟南芥CesA1基因AT4G32410的蛋白种子序列对白菜、甘蓝和甘蓝型油菜全基因组数据进行全基因组水平CesA鉴定(E-value=0),基因结构域特征、生化特征、进化关系等的分析。从连续3年用牙签茎秆接种菌核病的甘蓝型油菜田间抗病性鉴定试验中,筛选出高抗病和高感病材料8份,克隆其C07染色体上的CesA基因片段,记为C07-BnaCesA,并进行序列多态性与抗病关联性分析。结果显示,在芸薹属AC基因组中共鉴定到78个CesA基因,其中白菜23个,甘蓝16个,甘蓝型油菜39个(A亚基因组20个,C亚基因组19个)。基于UPGMA法CesA蛋白系统进化树在遗传距离0.24处明显分成2大类。2000 bp启动子区预测到被转录因子(TFs)结合位点最多的TFs为BBR-BPC、ERF,14个CesA没有预测到TFs结合位点,在白菜和甘蓝杂交形成油菜的进化过程中,可能发生了基因沉默。在8份材料中C07-BnaCesA基因片段共鉴定到58个SNPs。芸薹属AC基因组CesA基因在进化过程中有的比较保守,C07-BnaCesA基因片段多态性与菌核病抗性没有强的关联性。     

芸薹属物种(B.napus,B.rapa,B.oleracea)PHB基因的生物信息学分析

HD-ZIPⅢ基因家族参与植物胚胎发生、分生组织形成、叶极性建立和维管组织分化等过程。本研究利用生物信息学方法,对HD-ZIPⅢ成员之一PHABULOSA (PHB)进行鉴定,在甘蓝型油菜、白菜和甘蓝中共获得7个PHB成员,并对其核苷酸和氨基酸序列的基本特征、结构域、保守基序、基因结构和系统进化关系进行了分析。结果表明,这些PHB蛋白编码不稳定的亲水性蛋白,所有成员均含有Homeobox、bZIP、START和MEKHLA保守结构域,PHB位点在三个物种间的进化符合禹氏三角理论。序列分析及测序结果显示白菜的两个PHB基因在miR165、miR166结合位点处存在一个碱基差异。本研究为进一步揭示芸薹属物种PHB基因功能提供了依据。     

白菜HSP90基因家族的鉴定及表达分析

本研究为了深入研究白菜(Brassica rapa)热激蛋白90(heat shock protein 90, HSP90)家族基因在温度胁迫下的响应机理及相关功能,利用生物信息学的方法对白菜HSP90基因家族成员进行了鉴定,同时分析了这些家族成员的理化性质、基因结构、进化关系、染色体分布、启动子元件以及表达模式。结果表明：白菜中至少含有14个HSP90基因,氨基酸长度在490～820之间,呈酸性,分布于10条染色体上,含有1～19个不等的内含子,10个保守基序;基于系统进化树分析,将14个基因分为5个簇;顺式作用元件分析得到7个响应温度胁迫基因;荧光定量分析表明这些基因在温度胁迫下存在显著差异,表明这些基因广泛参与温度胁迫响应。本研究为后续白菜HSP90基因功能挖掘提供科学参考。     

甘蓝型油菜SLG基因片段的克隆及序列分析

通过不同甘蓝型油菜中SLG基因的克隆及序列分析, 探索了甘蓝型油菜中是否存在与芸薹属二倍体中相同或相似的S-locus基因。对10个甘蓝型油菜品种和品系中SLG基因的PCR扩增和序列比较分析发现, 这些甘蓝型油菜中都存在第2类的SLG基因, 而且, 同二倍体芸薹属物种一样, 第2类SLG基因之间具有较高的同源性; 只有5个甘蓝型油菜品种和品系中存在第一类SLG基因, 而且这些基因序列之间表现出高度的保守性, 即同源性在96%以上, 明显高于不同等位基因之间的同源性。这些甘蓝型油菜中的class I SLG基因可能源于同一个自交不亲和单体。     

甘蓝型油菜BES1转录因子家族的鉴定及比较基因组学分析

BES1转录因子家族对调节植物的生长发育和逆境胁迫具有非常重要的作用。本研究在甘蓝型油菜基因组测序完成的基础上,对芸薹属作物BES1转录因子家族的进化及表达进行了系统深入研究。本研究在甘蓝型油菜、白菜、甘蓝和拟南芥全基因组中分别鉴定到29条、15条、14条和8条BES1转录因子。通过系统发育、基因结构和保守基序的分析,这些转录因子被分为三组,即Group A、Group B和Group C。在甘蓝型油菜与白菜、甘蓝和拟南芥间分别鉴定出30对、32对和23对直系同源基因。甘蓝型油菜中含有15对旁系同源BES1基因,显著的高于其它3个物种。大多数BES1基因在根和叶中都具有较高的表达水平,表明这些基因在甘蓝型油菜生长发育过程中起到重要的作用。本研究对进一步探索该家族调控植物的生长及逆境适应的分子机制奠定了基础,同时为其它基因家族的研究提供了指导。     

甘蓝型油菜及其亲本物种甲基化酶I基因的克隆及表达模式

DNA甲基化作为一种表观遗传调控方式,在植物体生长发育中起重要作用,而甲基转移酶I(DNA methylase I,MET1)在甲基化过程中起主要作用。本研究克隆到5个油菜Bn MET1同源基因,并比较了白菜Br MET1、甘蓝Bo MET1和油菜Bn MET1同源基因的进化及其表达模式。结果显示,白菜和甘蓝MET1同源基因在进化中较为保守,而油菜Bn MET1基因结构发生较大改变;部分油菜Bn MET1同源基因表达发生沉默,而激活表达的Bn MET1表达模式较其亲本白菜和甘蓝直系MET1同源基因发生明显的改变。上述结果表明,Bn MET1同源基因通过改变基因结构以及表达模式影响油菜组织中Bn MET1基因剂量,从而调节油菜的生长发育。     

甘蓝型油菜防御素基因的克隆与生物信息学分析

为了研究甘蓝型油菜防御素基因的结构和功能,根据白菜防御素基因序列设计引物,采用RT-PCR方法从甘蓝型油菜中克隆到4个防御素基因,并对其序列进行了生物信息学分析。结果表明,甘蓝型油菜防御素基因cDNA全长325~335 bp,包含231~243 bp的开放阅读框,编码76~80个氨基酸;防御素基因在长期进化过程中产生了显著的差异,但防御素含有的8个保守半胱氨酸残基均稳定存在;Bndef1、Bndef2、Bndef3与萝卜Rs-AFP1、诸葛菜Omdef亲缘关系较近,Bndef4与豇豆Vudef亲缘关系较近;4个防御素蛋白均为稳定蛋白,具有信号肽结构,可能为分泌蛋白。     

结球甘蓝类钙调素蛋白基因BoCML39的克隆与表达分析

类钙调素蛋白作为钙调素蛋白的家族之一,调控植物生长发育、激素调控、病原菌防御及各种胁迫。本研究以结球甘蓝为试验材料,通过克隆获得BoCML39基因,其开放阅读框(ORF)为510 bp,编码169个氨基酸,不含内含子。预测BoCML39蛋白分子量为19.25 k D,等电点为4.35,为亲水蛋白,含有4个EF-hand结构域;系统发育树表明结球甘蓝BoCML39蛋白与白菜CML39蛋白处于同一进化枝,与油菜CML39蛋白、甘蓝CML39蛋白的亲缘关系近;三级结构预测发现该蛋白包含9个α-螺旋结构、5个β-转角、2个β-折叠、7个无规则卷曲和4个似小球状的钙离子结构。qPCR表明干旱(PEG6000,150 g/L)、盐(NaCl,200 mmol/L)、低温(4℃)、高温(37℃)、过氧化氢(H2O2,30 mmol/L)、脱落酸(ABA,100μmol/L)、水杨酸(SA,2 mmol/L)、茉莉酸甲酯(MeJA,100μmol/L)不同处理条件均能上调结球甘蓝叶和根中BoCML39的表达。研究结果初步证实BoCML39基因响应逆境胁迫(PEG6000,Na Cl,4℃,37℃)、活性氧(H2O2)和激素(ABA,SA,MeJA)调控,为Bo CML39参与植物逆境、活性氧和激素调控信号途径及其功能研究提供科学依据。     

人工合成甘蓝型油菜及其亲本的甲基化变异模式分析

甘蓝型油菜作为多倍体起源和发生的历史较短, 遗传背景较为狭窄, 人工合成甘蓝型油菜可作为植物多倍化研究的优选模型, 本文以人工合成的甘蓝型油菜为材料, 通过HPLC分析发现白菜型油菜和甘蓝的甲基化率分别为8.33%和15.88%, 2个杂种株系的全基因组甲基化水平介于双亲之间(分别为10.29%和12.83%)。MSAP分析发现杂种F₁代及其亲本的甲基化水平存在明显差异(白菜型油菜<杂种F₁<甘蓝), 杂种F1代的甲基化变异(23.71%)中来自A、C基因组的变异分别占6.60%和10.16%。MSAP差异性条带的序列分析发现多倍化过程中与甲基化变化相关的基因参与了多种生物学过程, 且差异甲基化基因在人工合成甘蓝型油菜及其亲本间的表达差异与甲基化修饰模式是一致的。本研究为了解甘蓝型油菜多倍化过程中发生的表观变异奠定了基础。     

甘蓝和白菜紫色酸性磷酸酶17基因家族的克隆和比较分析

从甘蓝和白菜中分别克隆到2个PAP17, 根据序列相似性, 将PAP17分为类型I (BoPAP17-1和BrPAP17-1)和类型II (BoPAP17-2和BrPAP17-2)。Southern杂交表明, 白菜和甘蓝中均只存在2个PAP17成员, 与克隆结果吻合。系统发育和分子进化分析表明, PAP17基因家族受纯化选择, 编码低分子量PAP蛋白。荧光定量PCR结果表明, PAP17在所检测的9个组织器官中均有表达, 尤以花和蕾中的表达量特别高, 种子中也有一定程度的表达, 表明其与体内储备态磷的动用有关, 尤其在花和蕾的发育阶段。磷饥饿诱导表达结果表明, 除BrPAP17-2在幼苗叶片中表达受抑制外, BrPAP17和BoPAP17在幼苗根部和叶片中均受磷饥饿诱导, 表达量先降后升, 诱导4 d或8 d后达到峰值; 恢复供磷4 d后, 表达量迅速降低至基础表达水平以下。与幼苗叶片相比, 白菜和甘蓝幼苗根部的PAP17磷饥饿诱导表达似乎更为强烈。这些结果表明PAP17在白菜和甘蓝根部可能参与了根外磷的活化与吸收及无机磷由根部向其他组织器官的转运。     

甘蓝型油菜脯氨酸合成相关同源基因的进化和差异表达分析

以异源四倍体甘蓝型油菜(Brassica napus)及其二倍体祖先白菜(B.rapa)和甘蓝(B.oleracea)为对象,研究了脯氨酸合成途径关键酶基因P5CS和OAT的进化命运以及各自不同祖先来源的同源基因的差异表达情况。序列比对和进化分析表明,甘蓝型油菜中P5CS基因和OAT基因和其二倍体祖先的相对应基因高度同源;进化上,和二倍体亲本相比甘蓝型油菜P5CS2基因发生了1个拷贝的丢失,而OAT基因没有基因丢失现象;半定量RT-PCR结果表明,甘蓝型油菜中来自二倍体亲本白菜和甘蓝的P5CS2和OAT同源基因在所有检测器官中均表达,没有发生基因沉默;但是它们可能发生了亚功能化,不同祖先来源的2个P5CS2同源基因存在较弱的偏向性表达,不同器官的同源基因表达模式稍有不同;而OAT基因明显偏向于表达来自于甘蓝祖先的同源基因,OAT的2个同源基因的不同器官表达模式基本一致;盐胁迫处理后,来自于甘蓝的BnaC.P5CS1.d表达量显著高于来自于白菜的Bna A.P5CS1.a,表明盐处理条件下甘蓝型油菜偏向性表达BnaC.P5CS1.d。甘蓝型油菜的脯氨酸合成基因Bna A.P5CS1.a、BnaC.P5CS1.d及Bna A.P5CS2.a、BnaC.P5CS2.c的盐诱导表达模式均基本保持了亲本来源基因的特征。以上结果表明,与二倍体祖先相比,甘蓝型油菜中脯氨酸合成基因序列和表达模式均存在高度保守性,这可能说明了脯氨酸积累在进化上对植物的有利性。     

人工合成具有白菜或甘蓝细胞质的甘蓝型油菜

为比较甘蓝型油菜不同细胞质基因组的遗传效应及其与核基因的相互作用,对12个白菜(2n=20)与1个芥蓝(2n=18)的正反交种间杂种分别进行子房和胚培养,人工合成白菜和甘蓝细胞质甘蓝型油菜。结果表明,白菜×芥蓝的正交子房培养杂种苗平均诱导率2.32%,甘蓝×白菜的反交胚培养杂种苗平均诱导率为1.16%。不同杂交组合之间,杂种苗诱导率差异大,但相同亲本正反交杂种获得的难易趋势相似。将单倍体杂种小苗在含0.01%秋水仙碱的MS培养基中预培养处理10d的染色体加倍效果最好,加倍率达59.32%。人工合成的甘蓝型油菜农艺性状类似于栽培甘蓝型油菜,无论正交或反交合成的甘蓝型油菜,其农艺性状介于父母本之间,但更接近于母本。合成油菜花粉育性在40.53%～88.95%之间。