茶树bZIP转录因子基因CsbZIP1的克隆与表达定位

碱性亮氨酸拉链蛋白(bZIP)作为真核生物中分布最广、最保守的一类转录因子,参与多种生物学过程,尤其在植物抵御各种逆境胁迫中有重要作用。采用RACE和RT-PCR技术克隆到茶树bZIP转录因子基因全长cDNA序列,命名为CsbZIP1(GenBank登录号为JX050148.1)。该基因cDNA全长1515 bp,包含813 bp的完整开放阅读框(ORF),编码270个氨基酸,预测分子量29.484 kD;含有bZIP家族典型的BRLZ结构域碱性结构域和亮氨酸拉链,属于B_-zip1家族;系统发育树分析显示CsbZIP1属于bZIP转录因子F亚家族;亚细胞定位结果表明CsbZIP1主要定位于细胞核;qRT-PCR分析表明,4℃低温和NaCl盐胁迫处理均能诱导CsbZIP1的表达,表达量变化趋势都是随着胁迫时间先逐渐升高,到24 h时降低,ABA胁迫处理24 h抑制CsbZIP1的表达。推测CsbZIP1与茶树低温、盐等逆境胁迫密切相关。     

茶树咖啡碱合成代谢中N-甲基转移酶的研究进展

咖啡碱是茶叶中的主要品质成分之一,是一种黄嘌呤生物碱化合物,约占茶叶干重的2%-5%。在茶树中咖啡碱的核心合成途径为:黄嘌呤核苷甲基化反应生成7-甲基黄嘌呤核苷,再通过脱核糖反应生成7-甲基黄嘌呤,然后经过两次甲基化依次生成可可碱和咖啡碱。咖啡碱合成途径中转甲基化反应是通过N-甲基转移酶催化进行的,该酶是咖啡碱合成的关键酶。本文综述了茶树中N-甲基转移酶的基因克隆、结构、功能分析及表达调控等方面的研究进展。     

茶树己糖激酶基因CsHXK2的启动子克隆及表达特性分析

植物己糖激酶是双功能蛋白,具有磷酸化己糖和介导糖信号的关键性作用。前期研究中,我们从茶树中克隆获得4个己糖激酶基因,其中CsHXK2基因编码492个氨基酸残基,与拟南芥AtHXK3、番茄LeHXK4归为Type A类HXKs。利用RT-PCR技术,克隆获得长度为2029bp的CsHXK2基因启动子。CsHXK2基因可能受到光照、低温、病原菌、糖和多种激素等信号的调控,且可能特异性表达于叶、花、种子、根系、腋芽等组织。CsHXK2蛋白定位于叶绿体内。酵母突变体功能互补试验表明,去除叶绿体转运信号肽的CsHXK2成熟蛋白具有葡萄糖和果糖磷酸化活性。茶树组织特异性表达分析显示,CsHXK2基因在根和茎中表达量最高,而在老叶中表达量最低。CsHXK2基因的表达受低温胁迫而显著下调,经炭疽菌侵染的茶树叶片内CsHXK2基因的表达也受到显著抑制,而外源赤霉素(GA₃)处理的茶树叶片内CsHXK2基因表达显著上调。本研究结果表明,CsHXK2基因在茶树的生长发育过程和逆境胁迫响应中发挥重要的调控作用。     

长春花茉莉酸受体CrCOI1的生物信息学分析与原核表达

通过生物信息学方法对长春花茉莉酸受体CrCOI1氨基酸序列、结构域以及二级、三级结构进行分析,利用分子生物学方法构建重组质粒并进行原核表达。结果显示：CrCOI1编码516个氨基酸,为胞质定位,分子量为58.26 k D,等电点pI为5.45,与番薯COI1蛋白的亲缘关系比较近,CrCOI1含有F-box结构域、多个LRR富集亮氨酸重复结构域以及转运抑制响应1结构域;该蛋白二级结构由50.97%α-螺旋、31.59%无规则卷曲、12.79%延伸链以及少部分β-转角(4.65%)组成;经SWISS-MODEL预测其三级结构显示,CrCOI1蛋白由α-螺旋和无规则卷曲组成,其中F-box的3个α-螺旋从蛋白的N端伸出便于结合配体。进一步地成功构建了重组表达质粒pET28a-CrCOI1,并经IPTG诱导后在大肠杆菌BL21中实现异源表达,且发现经16℃、0.4 mmol/L IPTG诱导至12 h后蛋白表达量最高,具有时间依赖性。上述结果表明,我们成功构建了长春花茉莉酸受体CrCOI1的重组表达质粒,实现大肠杆菌中的表达,并对其进行了序列以及结构分析。这为研究CrCOI1的功能以及通过其介...     

茶树赤霉素受体基因CsGID1a的克隆与表达分析

GID1作为赤霉素信号转导的受体,在赤霉素作用中具有重要作用。采用同源克隆方法,利用RT-PCR和RACE技术在茶树中克隆到赤霉素受体基因GID1的cDNA全长,命名为CsGID1a (GenBank登录号为JX235369)。该基因全长1411 bp,开放阅读框1 023 bp,编码341个氨基酸。生物信息学分析显示,CsGID1a编码的蛋白分子量为38.53 kD,理论等电点为5.62;无信号肽位点,是非分泌性蛋白,具有1个跨膜区,基因被定位于细胞核内;CsGID1a氨基酸序列具有激素敏感性脂肪酶(HSL)家族蛋白的HGG、GXSXG功能域以及羧酸酯酶典型的三级结构;与其他物种的GID1相似性均在60％以上,与葡萄的相似性最大达87％、进化关系最近。荧光定量PCR结果显示,高浓度(1.0×10^–5 mol L^–1)GA₃能够下调CsGID1a的表达,5 h内的表达呈下降趋势;随着越冬茶芽萌动进程,CsGID1a表达量逐渐降低,特别在3月初萌发以后变化较大,推测赤霉素及其受体基因可能与茶树越冬芽解休眠相关。     

小麦谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆及原核表达

为了进一步研究小麦谷胱甘肽-S-转移酶基因(TaGST)的功能,采用RT-PCR方法分离了小麦谷胱甘肽-S-转移酶基因(TaGST)的ORF全长c DNA,并进行了生物信息学分析。结果表明:小麦TaGST基因的ORF全长690 bp,编码229个氨基酸;TaGST蛋白分子质量为25.81 k Da,p I为5.29。系统进化分析表明,该基因编码蛋白与水稻OsGST蛋白的氨基酸同源性最高,与已知植物GST家族成员的氨基酸序列聚类分析将TaGST聚为Phi类GST。构建原核表达载体p ET32-TaGST,对TaGST基因进行原核表达,SDS-PAGE结果表明,其所表达蛋白与预期蛋白大小一致。为进一步研究该基因的特性和功能奠定了理论基础。     

茶树生长素响应因子基因CsARF1的克隆与表达分析

生长素响应因子(ARFs)是能够与生长素原初反应基因启动子区的生长素响应基元(TGTCTC)特异结合的一类转录因子,调控生长素应答基因的表达。采用SMART-RACE-PCR技术,获得茶树生长素响应因子基因CsARF1的全长cDNA序列(GenBank登录号为JX307853),并进行了生物信息学分析和表达分析。CsARF1基因cDNA全长3222 bp,包含2463 bp的开放阅读框(ORF),编码820个氨基酸残基。编码蛋白的分子量为49.35 kD,具有保守的N端DNA结合域B3和C端二聚化结构域IAA_ARF,中间区域富含谷氨酸、丝氨酸和亮氨酸,是一个定位于细胞质的具有激活转录功能的可溶性蛋白。相似性及系统进化分析表明,该基因编码的氨基酸序列与葡萄ARF8的相似性最高(83%),与番茄ARF8的亲缘关系最近。利用实时荧光定量PCR技术,检测该基因在茶树越冬芽休眠到萌发后不同时期的表达情况。结果显示CsARF1在茶树越冬芽深休眠和萌动期表达量较高,表明该基因与茶树越冬芽的休眠维持及解除密切相关。     

亚麻糖基转移酶基因LuUGT72E1的克隆与表达分析

以亚麻茎部组织总RNA为模版,通过反转录PCR获得糖基转移酶Lu UGT72E1基因的全长开放读码框序列。序列分析结果表明:开放读码框全长1 476bp,共编码491个氨基酸。通过多氨基酸比对发现,该蛋白与亚麻UGT72N2蛋白亲缘关系最近,相似度达99%,与毛果杨、巨桉、木薯、雷蒙德氏棉及拟南芥UGT72E1蛋白的氨基酸序列相似性在58%~51%。分子进化分析表明,该蛋白与拟南芥UGT72E1~3聚为一类,推测该蛋白参与木质素单体的糖基化修饰过程。基因表达谱结果表明,该基因被BR、Brz诱导下调表达。本研究为亚麻的纤维品质改良提供了候选基因。     

小麦TaMKK2基因的克隆及功能分析

小麦在生育周期内会遭遇多种非生物胁迫，制约小麦的生长发育。为了提升小麦新品种的抗逆性，本研究基于MAPK抗逆性基因开展实验，以冬小麦新品种‘新冬43号’为实验材料，采用同源克隆方法，获得了MKK2基因，暂命名为TaMKK2，对其编码的基因序列进行了生物信息学分析，并对该基因进行了亚细胞定位和原核表达分析。结果表明，该基因的cDNA序列全长为531 bp，含有1个完整的开放阅读框，编码176个氨基酸，相对分子量约20.07 kD，等电点为8.37；与山羊草、二穗短柄草MKK2基因的亲缘性较近；理论定位于细胞核上，然而实验操作未能检测到荧光信号；各诱导条件下目的蛋白均以包涵体形式存在，纯化复性后得到大小为20.07 kD的目的蛋白。本研究结果为小麦应对非生物胁迫以及利用基因育种技术改良植物抗逆性提供理论依据。     

红麻HcAOC1基因克隆及响应茉莉酸甲酯的表达模式分析

茉莉酸对植物的生长发育、花药开裂具有重要调控作用。丙二烯氧化物环化酶基因(AOC)是茉莉酸合成途径关键基因,在植物生长发育、育性调控过程也发挥关键作用。为了探究红麻茉莉酸合成途径中关键基因(HcAOC1)的调控机理,本研究以红麻细胞质雄性不育系UG93A为材料。利用同源克隆的方法,以UG93A的g DNA和cDNA为模板,成功克隆获得HcAOC1基因全长。其CDS序列为780 bp,编码259个氨基酸残基,蛋白质分子量为28.4 kD,等电点为9.28。HcAOC1系统发育进化树分析结果表明,红麻与棉花、蓖麻、榴莲的亲缘关系较近,与小果野芭蕉、萝卜的亲缘关系较远(GenBank登录号:MW520098)。此外,在花期采用不同浓度的外源茉莉酸甲酯(MeJA)处理红麻。在处理的第0天、5天、10天和15天后取样成熟期花药,利用RT-qPCR分析不同处理时间下HcAOC1的表达差异,发现HcAOC1表达量随着处理时间延长存在先增高后降低的趋势,即0.5 mmol/L (T1)、1 mmol/L (T2)、2 mmol/L (T3)处理在第10天HcAOC1的表达量达最高值,均极显著高于对照组...     

花生溶血磷脂酸酰基转移酶基因的克隆与表达分析

溶血磷脂酰基转移酶(LPAT)是植物油脂合成途径的一个关键酶,在植物油脂品质改良和提高种子含油量方面具有重要的应用价值。本研究通过构建花生种子全长cDNA文库,结合大规模EST测序和功能注释,从花生中克隆了溶血磷脂酸酰基转移酶基因,命名为AhLPAT。该基因cDNA全长1 629 bp,对应的基因组序列5 531 bp,由11个外显子和10个内含子组成,内含子剪接方式符合GT-AG剪接规则。根据编码区预测AhLPAT编码一条387个氨基酸组成的多肽,预测分子量为43.2 kD,等电点为9.42。AhLPAT蛋白含有一个典型的酰基转移酶保守功能结构域以及溶血磷脂酰基转移酶相似的保守区域。该蛋白的氨基酸序列与已报道的其他物种LPAT蛋白序列有较高的一致性。AhLPAT与旱金莲、油菜、海甘蓝、蓖麻和拟南芥的LPAT蛋白氨基酸相似性依次为90%、89%、89%、88%和87%。系统进化分析表明,AhLPAT与拟南芥AtLPAT2亲缘关系较近,且同属于内质网型LPAT蛋白。RT-PCR分析表明,AhLPAT基因在花生根、茎、叶、花、果针和种子中均有表达,在花生开花后50~60 d,果针和种子中的表达量最高,且AhLPAT的表达量与花生种子含油量积累速率变化一致,二者显著相关(r=0.63,P<0.05)。推测AhLPAT基因在花生种子油脂合成中起重要作用。     

绿竹咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因的克隆与分析

咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶（CCoAOMT）是木质素生物合成过程中的一个关键酶类。采用RT-PCR及RACE方法从绿竹中分离了CCoAOMT家族的一个基因,命名为BoCCoAOMT1（GenBank注册号为EF028662）。BoCCoAOMT1的cDNA全长873bp,含有一个780bp的读码框,编码一个259aa的蛋白,分子量约为29kD。序列分析结果表明,BoCCoAOMT1的编码肽链含有CCoAOMT类基因所有的保守序列元件,与禾本科植物水稻的CCoAOMT类基因有着很高的一致性,达到90.0%。系统进化树分析表明,BoC-CoAOMT1与水稻的CCoAOMT亲缘关系较近。     

小麦TaHPPR基因的克隆与表达分析

为研究羟基苯丙酮酸还原酶(HPPR)在小麦逆境胁迫中的作用,本研究利用同源克隆法获得1个小麦HPPR基因,命名为TaHPPR,并对其组织表达特性和逆境胁迫表达特性进行了分析.以'太原806'、'小白麦'、'京冬8'及'京411'为供试材料,用荧光定量方法获得组织表达和逆境胁迫表达数据.序列分析表明:TaHPPR基因含有...     

茶树CsMCC1和CsMCC2基因的克隆及表达特征性分析

组蛋白乙酰化修饰由组蛋白乙酰化酶(histoneacetyltransferases,HATs)和脱乙酰化酶(histonedeacetylase,HDACs)共同催化完成,是重要的表观遗传调控方式之一,在植物生长发育、逆境胁迫响应和激素响应的调控过程中均具有重要意义,但对茶树(Camellia sinensis)组蛋白乙酰化修饰的研究还比较少。本研究从‘福鼎大白茶’茶树中克隆获得了2个HATs家族的MCC (MEIOTIC CONTROL OF CROSSOVERS)基因:CsMCC1和CsMCC2,通过生物信息学分析、实时荧光定量PCR技术(Real-time quantitative PCR, qRT-PCR)和亚细胞定位试验对其功能进行解析。结果显示, CsMCC1和CsMCC2基因分别位于茶树1号和7号染色体,分别编码257 aa和269 aa,均属于碱性不稳定亲水性蛋白,与拟南芥AtMCC1具有高度相似的基因结构和蛋白空间结构。系统进化树和保守结构域分析表明,CsMCC蛋白与葡萄、番茄的同源蛋白有较近的亲缘关系, MCC蛋白序列高度保守,均含有GNAT保守结构,属于HAT蛋...     

白花虎眼万年青QtJMT基因的克隆及其植物表达载体的构建

茉莉酸及其甲基化的衍生产物茉莉酸甲酯,后者具有较高生物活性,在植物的生命活动过程中发挥重要作用。茉莉酸甲基转移酶(jasmonic acid carboxyl methyltransferase, JMT)作为甲基转移酶类家族中的重要成员,是将茉莉酸甲基化衍生为茉莉酸甲酯过程中发挥催化作用的关键酶,过表达能够使得植物内源茉莉酸甲酯的生物合成能力增强,内源茉莉酸甲酯的含量提高,进而增强植物抗逆性及提高植物次生代谢物质含量,以及调控植物生长发育。白花虎眼万年青具有抗逆性强、次生代谢物质丰富、以及器官再生方式独特等特点,可能具有较高生物活性的茉莉酸甲基转移酶及其分子机制,但是尚未见到报道。本研究根据白花虎眼万年青叶上珠芽转录组分析数据,设计引物,克隆分离出茉莉酸甲基转移酶基因完整编码区,进而对其进行了三维立体结构、蛋白质保守序列及系统发育等生物信息学分析,将其命名为QtJMT基因,并成功将其连接到泛素启动子(pUB)驱动的植物表达载体上。本研究结果为QtJMT基因的深入分析其功能及在花卉分子育种中的应用提供了一定的依据。     

萝卜开花基因RsFLC3的克隆与表达分析

植物开花春化途径中关键抑制因子FLC基因属于MADS-box基因家族,为探索萝卜开花抑制基因FLC3的功能,以抽薹开花差异较大的萝卜品种YZH(易抽薹)和XHT(耐抽薹)为研究材料,对萝卜开花基因进行生物信息学分析,克隆了萝卜RsFLC3基因,并进行亚细胞定位和两个萝卜品种不同时期的qRT-PCR分析。结果表明,共鉴定出萝卜开花相关基因638个,亚细胞定位显示该基因编码的蛋白定位于细胞核,RsFLC3基因在萝卜抽薹开花过程中表达量整体呈下降趋势,但不同品种间大部分时期的表达量差异较大。     

天然棕色棉葡萄糖苷转移酶基因Gh3GT的克隆与表达分析

本研究以发育18d的天然棕色棉及相同发育时期的白色棉近等基因系纤维细胞为材料,采用抑制性差减杂交结合RACE技术分离得到了一个葡萄糖苷转移酶基因的全长cDNA,命名为Gh3GT(GenBank登录号eu921265)。序列分析发现:该基因编码一条有450个氨基酸残基组成的多肽,含有葡萄糖苷转移酶C-端所特有的保守的信号序列PSPG基序,属于植物中特有PSPG基序的UGT家族成员。推断的Gh3GT编码产物与其它糖苷转移酶同源性比对和系统发生分析表明:该糖苷转移酶与玫瑰Rh3GT(Rosa hybrida)、矮牵牛(Petunia hybrida)PhF3GT以及葡萄VvUFGT(Vitis vinifera)的相似性分别为51.30%、46.94%和45.85%,而与已知的陆地棉糖苷转移酶基因GhUGT1和GhUGT2一致性较低,仅为25.37%和12.14%。半定量RT-PCR分析表明:该基因在棕色棉纤维中的表达量明显高于其它组织及其近等基因系白色棉品种,且其在纤维中的表达规律与棕色棉的色素形成过程一致。